培养基的制备与微生物接种技术Word文档格式.docx

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配料、溶化、测定及矫正PH、过滤、分装、灭菌、无菌检验

三、仪器设备

试管、刻度吸管、纱布、滤纸、三角瓶、培养皿、量筒、漏斗、棉塞、电炉、天平、包装纸、棉线、ph试纸、玻棒。

试剂：

牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、磷酸氢二钾、琼脂条、0.1mol/L和1mol/L氢氧化钠、0.1mol/L和1mol/L的盐酸溶液、蒸馏水等。

四、相关知识点

一、配制原则和种类

（一）培养基配制原则

1、培养基：

培养基是提供食用菌等生物生长发育所需的营养与特定环境条件的基质，如蘑菇菌是有机营养型中的草腐生菌。

制备培养基不仅要考虑它所需要的含碳化合物、含氮化合物、矿物盐类、生长因子，还要考虑水与pH环境，同时还应考虑它们培养方式是固体培养还是液体培养。

因此，可以把按菌类生长发育需要比例配制的灭菌营养基质，称为培养基。

换言之，培养基必须具备三个条件：

含有菌株生长发育所需要的营养物质；

具有菌类生长环境条件；

经过灭菌，并保持无菌状态。

2、培养基的选择：

在整菌种制备过程中，从母种到原种、栽培种，各个阶段的目的要求有所不同，所选用的培养基的配比也应有所区别。

一般母种初生菌丝较嫩弱，分解养分能力差，要求营养丰富、完全，氮源、维生素的比例应高。

须选用易于被菌丝吸收利用的物质，如葡萄糖、蔗糖、马铃薯、蛋白胨、无机盐类及生长素等为等而原种、栽培种所需数量较多，且菌丝分解能力强，可利用大量农作物秸秆、粪草、棉籽壳、麸皮、米糠等原料作为培养基。

（二）培养基的种类

1、根据营养物质的来源，可以把培养基分炎天然培养基、半合成培养基和合成培养基。

（1）天然培养基　天然培养基是指用化学成分还不清楚或化学成分不恒定天然有机物配制而成的培养基，如各种农副产品及其下脚料──小麦、大豆、玉米粉、麸皮、米糠、作物秸秆、木屑、棉籽壳、甘蔗渣等，以及动植物组织的浸出液──牛肉膏、肉汤、马铃薯汁、麦芽汁、豆芽汁等都可以用来配制天然培养基，这种培养基来源广，成本低，营养丰富，适合于在生产上大规模培养菌类使用，但这些天然有机物质因产地、品种、生长期的不同，化学成分不能宣。

每批成分也不稳定，不宜用来做精细的科学实验。

以分离驯化食用菌培养基

（2）半合成培养基　为了促进食用菌菌丝的生长发育，常在天然培养基中添加适量的无机盐类，或在合成培养基中添加适量的某些天然有机物，就成为半合成培养基。

这类培养基种类繁多，应用广泛，也是生长菌种和实际栽培最常用的培养基。

（3）合成培养基　是指采用化学成分已知的有机物（碳水化合物、含氮化合物、有机酸类）或无机物配制而成的培养基。

这类培养基组成和含量明确，价格较贵，一般用于在实验室范围内做有关营养、代谢、菌种鉴定等有关于食用菌的生理生化研究。

2、根据培养基制成后的物理状态，可将培养基分为液体培养基、半固体培养基和固体培养基。

（1）液体培养基　根据食用菌所需的营养物质，扫一定比例配成营养液，叫液体培养基。

液体培养基可进行营养源的筛选实验，以及生理生化方面如酶活力等研究，应用液体培养基生产的菌种也可在生产中进行使用。

（2）固化培养基　将各种营养成份按比例配制成营养液后，加入适量固化剂，如琼脂，即可配成固化培养基。

利用这种斜面试管可保藏及扩大菌种，同时亦可制成各种平皿固化培养基分离菌种。

（3）固体培养基　利用各种富含纤维素和木质素的农林废弃物如木屑、棉籽壳、秸秆、玉米蕊等作为主要原料，再加入适量的米糠或麸皮和无机盐类制成固体培养基。

该培养基可作为二、三、级菌种生产用的培养基，也可以用它制成发酵草粉保藏菌种用的培养基。

五、实验步骤

（一）制备牛肉膏蛋白胨琼脂培养基

1、配方：

牛肉膏3—5g、蛋白胨10g、氯化钠5g、琼脂20—30g、蒸馏水1000mL。

PH值7.4—7.6。

2、步骤：

（1）称量：

根据用量按比例依次称取各种成分，牛肉膏常用玻璃棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水融化后到入烧杯，蛋白胨易吸湿，称量时要迅速。

（2）溶解：

在烧杯中加入少于所需的水量，加热，逐一加入各成分，使其溶解，琼脂在溶液煮沸后加入，融化过程需不断搅拌。

加热时应注意火力，勿使培养基烧焦或溢出。

溶好后，补足所需水分。

（3）调pH值：

若PH值不适宜，可用1mol/LNaOH或1mol/LHCl把pH值调至所需范围。

（4）过滤：

趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利于某些实验结果的观察，如无特殊要求时可省去此步骤。

（5）分装：

按照实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角瓶内，分装时注意，勿使培养基沾染在容器口上，以免沾污棉塞引起污染。

液体分装：

分装高度以试管高度的1/4左右为宜，分装三角瓶的量则根据需要而定，一般以不超过三角瓶容积的1/2为宜。

固体分装：

分装试管时其装入量不超过试管高度的1/5，灭菌后制成斜面，斜面长度不超过管长的1/2。

分装三角瓶，以不超过容积的1/2为宜。

半固体分装：

装入量以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。

（6）加棉塞：

分装完毕后，在试管口或三角瓶口塞上棉花，以阻止外界微生物进入培养基而造成污染，并保证有良好的通气性能。

（7）包扎：

棉塞上包一层牛皮纸，扎紧，即可进行灭菌。

（8）灭菌：

将上述培养基以0.1Mpa，121℃，高压蒸汽灭菌20min。

（9）搁置斜面：

将灭菌的试管培养基管口端搁在玻璃棒或其他合适高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长度的一半为宜。

（10）无菌检验：

灭菌后的培养基放入37℃恒温箱中培养24h，以检验灭菌效果，无污染方可使用。

（二）制备马铃薯蔗糖琼脂培养基

马铃薯（去皮）200g、蔗糖15—20g、琼脂20—30g、蒸馏水1000mL。

PH自然。

（1）将马铃薯洗净，去皮，切成大小约为1㎝3的小块，称200g，放入1000mL水中煮沸20—30分钟，用双层沙布过滤，取其液滤。

（2）定容：

加水补足至1000mL。

（3）加入蔗糖至全部溶化。

（4）加琼脂.至全部溶化。

（5）趁热分装试管及三角瓶。

灭菌后的培养基放入28℃恒温箱中培养24h，以检验灭菌效果，无污染方可使用。

注：

第（8）（9）（10）步需在实验二进行。

六、实验报告要求

1、根据实验要求，在实验时间内到实验室进行实验时，一边测量，一边记录实验数据。

报告要求准确、美观。

2、在实验中，如果发生实验测量数据与事先的计算数值不符，甚至相差过大，此时应该找出原因，不能不了了之。

同时要把通过实验所测量的数据与计算值加以比较，如果误差一般5％以下。

3、在报告的最后要完成指导书上要求解答的思考题。

七、思考题

1、写出制备牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、马铃薯蔗糖琼脂培养基的步骤。

2、说明制备培养基应注意哪些问题？

八、实验成绩评定办法

本门实验课程考核成绩占课程总成绩的30％，考核分实验预习、实验过程操作、实验报告和实验技能等四个方面，其成绩计算为预习实验（包括资料搜集）占10%、实验过程操作（包括实验流程、调试过程）占25％、实验报告（包括原理描述、数据记录、实验结果和效果）占25％、实验技能考核（包括解决问题的能力）或考试占40％。

凡考核不及格者，应参加补考或重修。

微生物接种技术

1、初步掌握微生物的分离、培养和菌种的基本方法。

2、练习微生物接种、移植和培养的基本技术，掌握无菌操作技术。

土壤是微生物生活的大本营，为了获得某种微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂，淘汰其他一些不需要的微生物，再用各种方法分离、纯化该微生物，直至得到纯菌株。

样品：

新鲜土壤。

培养基：

灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏一号培养基、马铃薯蔗糖培养基。

无菌水：

带有玻璃珠装有45mL无菌水三角瓶、装有9mL无菌水的试管。

其它：

无菌培养皿、无菌吸管、无菌三角玻棒、电子天平、记号笔、接种环、酒精灯、火柴。

试剂：

1万U/mL链霉素液、10％苯酚

接种方法：

常用的有斜面接种法、平板接种法、液体接种法、试管深层固体培养基的穿刺接种法。

接种工具：

常用的有接种针、接种环、接种钩、接种圈、接种铲或接种锄、玻璃涂棒等。

（一）实验程序1

制备土壤稀释液：

（无菌操作过程见教师示范）

1、称取土壤5g，放入45mL无菌水的三角瓶中，振荡10min，即为稀释10－1的土壤悬液。

2、另取装有9mL无菌水试管5支，用记号笔编上10－2、10－3、10－4、10－5、10－6。

取已稀释成10－1的土壤液，振荡后静止0.5min，用无菌吸管吸取1mL土壤悬液加入10－2的无菌水的试管中，并在试管内轻轻吹吸数次，使之充分混匀，即成10－2土壤稀释液。

同法依次连续稀释至10－4、10－5、10－6土壤稀释液。

吸取稀释液

取一吸管，以无菌操作法分别吸取10－4、10－5、10－6土壤稀释液0.1mL，加在已制好的平板培养基上。

涂板

用玻璃刮铲将稀释液在培养机上充分混匀铺平，倒置于恒温箱培养。

计算出每克土壤中细菌的数量。

即用某一培养皿内真菌的菌落数乘以该培养皿接种液的稀释倍数即得。

挑取单个菌落，进行划线分离。

（二）实验程序2

制平板

取一吸管，以无菌操作法分别吸取10－4、10－5、10－6土壤稀释液0.1mL，加在空培养皿中。

混菌

水平轻轻转动培养皿，使菌液、培养基充分混匀铺平，放在平坦的桌面上，凝固后倒置于恒温培养箱培养。

计算出每克土壤中放线菌的数量。

（三）实验程序3

制成平板。

凝固后，用接种环取相应的菌液一环（10－1）在平板上划线。

1、连续划线法：

将挑取有样品的接种环在平板培养基表面作连续划线。

完毕后，倒置于28～300C温室培养。

2、分区划线法：

用接种环以无菌操作挑取土壤稀释液1环，先在培养基的一边作第一次平行划线3—4条，再转动培养皿约600C角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次划线会，同法依次作第三次和第四次划线。

划线完毕，盖上皿盖，倒置于温室培养。

挑取单个菌落接种于斜面培养基上，如果不纯，再移植纯化，最后得到纯培养。

1、平板培养时为什么要把培养皿倒置？

2、在划线分离时，为什么每次都需要将接种环上的剩余物烧掉？

凡考核不及格者，应参加补考或重修