年产400t中性淀粉酶的生产工艺设计Word文件下载.docx
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为保持α-淀粉酶的结构完整性和活性，至少需要一个能与之紧密结合的Ca2+，而Cl-往往是α-淀粉酶的变构激活因子，并且在所有Cl-依赖性的α-淀粉酶中，组成催化三联体的残基都是严格保守的[10]。
2.2α-淀粉酶的性质
早在1967年，Jones和Varner就对小麦中α-淀粉酶的活性进行了研究[11]。
不同来源的α-淀粉酶的酶学和理化性质有一定的区别，它们的性质对在其工业应用中的应用影响也较大，在工业生产中要根据需要使用合适来源的酶，因此对淀粉酶性质的研究也显得比较重要。
2.2.1底物特异性
α-淀粉酶和其它酶类一样，具有反应底物特异性，不同来源的淀粉酶反应底物也各不相同，通常α-淀粉酶显示出对淀粉及其衍生物有最高的特异性，这些淀粉及衍生物包括支链淀粉、直链淀粉、环糊精、糖原质和麦芽三糖等。
2.2.2最适pH和最适温度
反应温度和pH对酶活力影响较大，不同来源的α-淀粉酶有各自的最适作用pH和最适作用温度，通常在最适作用pH和最适作用温度条件下酶相对比较稳定，在此条件下进行反应能最大程度地发挥酶活力，提高酶反应效率。
因此，在工业应用中应了解不同的酶最适pH和最适温度，确定反应的最佳条件，最大限度地提高酶的使用效率是很重要的。
通常情况下α-淀粉酶的最适作用pH一般在2到12之间变化。
真菌和细菌类α-淀粉酶的最适pH在酸性和中性范围内，如芽孢杆菌α-淀粉酶的最适pH为3，碱性α-淀粉酶的最适pH在9～12。
另外，温度和钙离子对一些α-淀粉酶的最适pH有一定的影响，会改变其最适作用范围。
不同微生物来源的α-淀粉酶的最适作用温度存在着较大差异，其中最适作用温度最低的只有25℃～30℃，而最高的能达到100℃～130℃。
另外，钙离子和钠离子对一些酶的最适作用温度也有一定的影响[12]。
2.2.3金属离子
α-淀粉酶是金属酶，很多金属离子，特别是重金属离子对其有抑制作用；
另外，巯基，N-溴琥珀酸亚胺，p-羟基汞苯甲酸，碘乙酸，BSA，EDTA和EGTA等对α-淀粉酶也有抑制作用。
α-淀粉酶中至少包含一个Ca2+，Ca2+使酶分子保持适当的构象，从而维持其最大的活性和稳定性。
Ca2+对α-淀粉酶的亲和能力比其它离子强，其结合钙的数量在1到10之间。
结晶高峰淀粉酶A（TAA）包含10个Ca2+，但只有一个结合很牢固。
通常情况下结合一个Ca2+就足以使α-淀粉酶很稳定。
用EDTA透析或者用电渗析可以将Ca2+从淀粉酶中除去，加入Ca2+可以激活钙游离酶。
用Sr2+和Mg2+代替TAA中的Ca2+，在Sr2+和Mg2+过量的情况下也能使其结晶。
加入Sr2+、Mg2+和Ba2+离子可以激活用EDTA失活的TAA。
通常情况下，有Ca2+存在淀粉酶的稳定性比没有时要好，但也有报道α-淀粉酶在Ca2+存在时会失活，而经EDTA处理后却保留活性，另外，有报道称Ca2+对α-淀粉酶没有影响。
2.2.4电场强度
实验结果表明，不同强度电场导致酶活性增加的效应不同，并且呈非单调性变化。
我们认为，不同强度电场对酶蛋白分子的构象产生了不同影响，处理酶所用的电场能量虽然不足以改变酶蛋白氨基酸序列，但可以改变酶蛋白的构象．姚占全等[13]用不同强度电场处理α-淀粉酶5min，处理后分别在第1天与第1O天测定电场对α-淀粉酶活性的影响。
第1天测定结果表明，电场对酶产生明显影响，而且不同强度电场对α-淀粉酶活性的影响程度不同，在0.5～6.0kV／cm范围内，酶活性随场强增加呈非单调性变化，与对照组相比，变化幅度在5.5%～26.2%之间。
第1O天测定，酶活性变化幅度在0.2％～16.3%之间，表明电场对酶产生的影响经过一定时间后趋于消失。
3工艺流程设计
3.1菌种的选育
3.1.1菌种的选育及制备
菌种选择性分离的步骤一般是：
含微生物材料采集——标本材料的预处理——菌种的分离——富集培养——菌种初选——菌种复选——性能鉴定——菌种保藏。
1）含微生物材料的选择
土壤是微生物聚集最丰富的场所，菜园和农田耕作层土壤含有丰富的有机物常以细菌和放线菌居多，由于枯草芽孢杆菌生活在中性的环境中，可以采集中性的土壤。
采土时先用小铲除去表土，取5～15㎝深处的土样，选好3～5点，每点取土10g混在一起装入灭过菌的牛皮纸袋，并记录时间、地点、植被等情况。
2）预处理
在培养过程中以淀粉作为唯一或主要碳源，控制pH在6.7～7.2。
那些在所采用的条件下最适用于淀粉代谢的微生物最终将占优势，并可在淀粉琼脂糖平板上分离到产生中性淀粉酶的菌株。
3）所需菌种的纯化和分离
可用平板划线法进行菌种分离。
方法如下：
用接种管蘸取少量经增殖培养后的菌液，在含无菌固体培养基的平板表面上进行规则划线，操作时由右向左轻轻划线，划线时平板面与接种环成30°
～40°
，以手腕力量在平板表面轻巧滑动划线，线条要平行密集，使两线不能重叠，充分利用表面积，划线时接种环不要嵌入板内划破培养基，密集的含菌样品，经过多划线稀释，使菌体在平板培养基上逐渐分离成单个菌株，经培养繁殖成单个菌落，反复进行几次平板划线分离，可得枯草芽孢杆菌野生菌株。
4）菌株的培养
常用培养基配方：
1L蒸馏水+10g蛋白胨+3g牛肉膏+15～20g琼脂+5gNaCl。
本课题以麸皮、豆饼粉作为天然培养基，在37℃保温箱中培养，至培养基中部分出现成熟颜色即可进行保藏。
5）菌落的选择
初筛采用透明圈法，方法为在培养基里接入淀粉天青，接入含菌样品后，可在菌落周围清晰地观察到淡蓝色晕环，初筛选出的微生物经过菌株性状试验后已确定具有一定生产能力的菌株还要进行复筛。
方法：
将初筛后的少数菌株接种于40ml锥形瓶内的液体培养基中，110次/min往复式摇床式震荡培养，得到摇瓶种子。
3.1.2诱变育种
诱变育种可以利用物理、化学因素诱导遗传特性发生变异，再从变异群体中选择符合人们某种要求如高产的个体，进而培育成新的品种或种质。
诱变育种操作程序如下：
出发菌株→纯化→培养液→细胞或孢子悬液→诱变剂处理→中间培养→平板分离→初筛→复筛→生产性能实验→菌种保藏。
1）出发菌株的选择
由于野生型菌株生产性能较差，通常采用经历过生产条件考验的菌株，即经过液体培养的摇瓶种子，这类菌株一定的生产性状，对生产环境有较好的适应性，正突变的可能性也很大。
2）菌悬液的制备
细菌一般要求处于对数生长中期的菌，用玻璃珠振荡5min，使细胞均一分散，然后用灭菌脱脂棉过滤，得到分散菌株。
菌悬液的细胞浓度不宜过高，本课题中的枯草芽胞杆菌，宜将其浓度控制在108个/ml。
菌悬液介质一般用生理盐水。
3）诱变剂的处理
诱变剂包括物理、化学、生物诱变，在微生物诱变育种中，可用物理化学复合诱变因素处理菌种，这样可以扩大培养幅度，提高诱变效果获得中性淀粉酶高产突变株。
方法及步骤如下：
吸取制备好的枯草芽孢杆菌悬液5ml于直径为6㎝的无菌培养皿中，然后用0.5%～1%的二乙酯处理30min，处理时采用pH7.0的磷酸缓冲液，再将磁力搅拌器于紫外灯下（距离30cm）1min，接着在红灯下吸取经处理的菌液0.5ml，稀释至10-6，取10-6～10-1稀释液滴一滴于6个平板中，10-6～10-1依次涂布均匀，再置暗箱内与37℃培养48h。
注意：
一般化学诱变剂均有毒性，多数还具有致癌作用，故操作时切忌用口吸取并勿与皮肤直接接触，做好安全工作。
4）突变菌株的筛选
包括：
琼脂块透明圈法初筛。
倒入选择培养基6皿，取其中较厚的2皿，用打孔器或玻璃打制圆形培养基→平移琼脂块至一个选择平板上，再用接种针挑取单菌落的少量菌体分别接种于琼脂块中心并与一琼脂块接入出发菌株作为对照→正置于37℃培养45小时→于培养好的选择平板中滴加几滴淀粉天青，观察到透明圈的直径→选择透明圈大的菌落接入斜面备复筛用。
摇瓶发酵复筛：
将经初筛处的菌株分别接入增殖培养基中，培养13小时→分别接种于锥形瓶发酵培养基中→置37℃摇床上发酵40小时→选出酶活力较高者进一步复筛直至选出中性淀粉酶高产突变株。
3.1.3菌种的保藏
菌种是从事微生物学以及生命科学研究的基本材料，特别是利用微生物进行有关生产，如氨基酸、抗生素、酿造等工业，更离不开菌种。
所以菌种保藏是进行微生物学研究和微生物育种工作的重要组成部分。
其任务是使菌种不死亡，同时还要尽可能设法把菌种的优良特性保持下来而不致向坏的方面转化。
菌种保藏主要是根据菌种的生理生化特点，人工创造条件，使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。
一般可通过保持培养基营养成分在最低水平、缺氧状态、干燥和低温，使菌种处于“休眠”状态，抑制其繁殖能力。
常用的菌种宝藏方法有：
斜面冰箱宝藏法、沙土管宝藏法、菌丝速冻法、石蜡油封存法、真空冷冻干燥保藏法、液氮超低温保藏法。
在这里我们采用沙土保藏法。
将需保藏的菌种经斜面培养后用无菌水制成孢子悬液，加入经灭菌处理的沙和土的混合物（或纯沙亦可）作为载体，减压抽去水分，这些吸附有孢子的干燥沙土载体，在低温下保存。
操作步骤：
斜面孢子先加灭菌蒸馏水2～2.5ml，沿斜面轻刮孢子后，再吸0.2～0.3ml到灭菌备用的沙土管中，在真空度100Pa以下进行干燥，直至沙土管外貌呈松散状态，然后低温（4℃）保存。
经真空干燥后的沙土管，最好放在密闭容器内，容器内可放入吸潮剂CaCl2或硅胶等，保藏期间整个容器置于冰箱内。
一般保存期为一年左右。
3.2培养基的配制
3.2.1培养基的类型
培养基的种类很多，可以根据组成、状态和用途等进行分类，按照用途可以分成孢子培养基，种子培养基和发酵培养基。
微生物大规模发酵设计主要用到孢子,种子和发酵培养基这三种类型。
1）孢子培养基
孢子培养基配制的目的是供菌体繁殖孢子的，常采用的是固体培养基，对这类培养基的要求是能使菌体生长快速，产生数量多而优质的孢子，并且不会引起菌体变异。
对孢子培养基的要求：
①营养不要太丰富；
②所用无机盐的浓度要适量；
③注意培养基的pH和湿度。
淀粉酶的孢子培养基配置如下：
将麸皮5％、豆饼粉3％、蛋白胨0.25%、琼脂2%（pH7.1）制成斜面培养基，在0.1MPa蒸汽灭菌20min。
2）种子培养基
种子培养基是供孢子发芽、生长和大量繁殖菌丝体，并使菌丝体长得粗壮成为活力强的种子。
对于种子培养基的营养要求比较丰富和完全，氮源和维生素的含量也比较高些，浓度以稀薄为好，可以达到较高的溶解氧，供大量菌体生长和繁殖。
α-淀粉酶的种子培养基的配置：
将豆饼1%、蛋白胨和酵母膏各0.4%、氯化钠0.05%配置成种子培养基（pH7.1～7.2），在0.1MPa蒸汽灭菌20min。
3）发酵培养基
发酵培养基的要求是营养要适当丰富和完全适合于菌种的生理特性和要求，使菌种迅速生长、健壮，能在比较短的周期内充分发挥产生菌合成发酵产物的能力，但要注意成本和能耗。
α-淀粉酶的发酵培养基配方是：
麸皮70％、小米糠20％、木薯粉10%、烧碱0.5%，加水使水量达60％，常压蒸汽灭菌1h。
3.2.2培养基的营养要求
培养基的成分大致分为碳源、氮源、无机盐、微量元素、特殊生长因子、促进剂、前体和水等几大类。
对不同的微生物，微生物不同的生长阶段，不同的发酵产物以及不同发酵工艺条件等，所使用的培养基都是不同的，这些也都是培养基配制需要考虑的因素。
1）水
水是所有培养基的主要成分，也是微生物机体的重要组成成分。
水是良好的溶剂，又是活细胞中一切代谢反应的媒介物，还可以维持细胞中的渗透压，同时水又是热的良好导体，有利于散热，可调节细胞温度。
在中性淀粉酶的发酵生产中，为了避免水质变化给生产带来不良影响，发酵用水采用深井水，并定期检查水质，要求：
pH6.8～7.2，电导率500～1500μΩ/cm，总硬度100～230mmol/L。
2）碳源
碳源的主要为微生物细胞的生长繁殖提供能源。
目前生产中性淀粉酶的菌种为异养型微生物，所以只能利用有机碳；
大量的农副产品是主要的有机碳源，如山芋、麸皮、玉米、米糠、马铃薯、木薯、土茯苓等淀粉质原料，这里用到的碳源是麸皮、马铃薯、木薯。
3）氮源
氮源是组成蛋白质和核酸的主要元素，酶自身即为蛋白质。
因此，氮源是必不可少的重要原料。
常用的有机氮源油花生饼粉、豆饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉等。
我们用到的氮源是豆饼粉剂和蛋白胨。
常用的无机氮源有铵盐、硝酸盐和氨水等。
4）无机盐类及微量元素
酶在生长和繁殖生长过程中，需要某些无机盐及微量元素如磷、镁、硫、钾、钠、钙、铁、锰、锌等。
钠离子具有控制细胞和培养基之间的渗透压的作用，从而促进产酶，添加适量亚硝酸钠可提高酶活力；
钙对淀粉酶有稳定和活化作用。
中性淀粉酶生产中通常以氯化钙提供钙离子。
5）生长因子和产酶促进剂
酶的生产中所需的生长因子大多由天然原料提供。
玉米浆、麦芽汁、豆芽汁等，都含有丰富的生长因子。
产酶促进剂一般是该酶的底物和底物类似物，对于中性淀粉酶，可添加适量浓度的淀粉琼脂糖作为诱导剂。
3.3工艺灭菌
3.3.1培养基的灭菌
生物化学反应过程中，特别是细胞培养过程，往往要求在没有杂菌污染的情况下进行，这是由于生物反应系统中通常含有比较丰富的营养物质，因而很容易受到杂菌污染，进而产生各种不良后果：
（1）由于杂菌的污染，使生物化学反应的基质或产物消耗，造成产率下降；
（2）由于杂菌所产生的某些代谢产物，或染菌后发酵液的某些理化性质的改变，使产物的提取变得困难，造成收得率降低或使产品质量下降；
（3）污染的杂菌可能会分解产物而使生产失败；
（4）污染的杂菌大量繁殖，会改变反应介质的pH，从而使生物化学反应发生异常变化；
（5）发生噬菌体污染，微生物细胞被破裂而使生产失败等。
1）灭菌方法
所谓灭菌，就是指用物理或化学方法杀灭或去除物料或设备中一切有生命物质的过程。
常用的灭菌方法有：
化学灭菌、射线灭菌、干热灭菌、湿热灭菌和过滤灭菌等。
本实验采用湿热灭菌。
2）培养基的湿热灭菌
条件为在121℃（表压约0.1MPa）维持30分钟。
湿热灭菌即利用饱和水蒸气进行灭菌，是工业中最重要的灭菌方法。
在同样的温度下，温热的杀菌效果比干热好，其原因有：
①蛋白质凝固所需的温度与其含水量有关，含水量愈大，发生凝固所需的温度愈低。
湿热灭菌中菌体蛋白质吸收水分，较同一温度的干热空气中易于凝固而杀灭各种微生物。
②温热灭菌过程中蒸气放出大量潜热，加速提高温度。
因而湿热灭菌比干热所要温度低。
如在同一温度下，则湿热灭菌所需时间比干热短。
③湿热的穿透力比干热大，使深部也能达到灭菌温度，故湿热比干热收效好。
一．影响灭菌效果的因素
⑴微生物的种类和数量；
⑵培养基性质、浓度、成分；
⑶灭菌的温度、时间。
二．热阻：
微生物对热的阻抗能力。
三．灭菌原理
对数残留定律：
经加工灭菌，死亡微生物速度和存在的微生物数量成正比。
3.3.2空气灭菌
此课题为好氧发酵，以空气作为氧源。
根据国家药品质量管理规范的要求，生物制品、药品的生产场地业需要符合空气洁净度的要求。
获得无菌空气的方法有：
辐射灭菌、化学灭菌、加热灭菌、静电除菌、过滤介质除菌等。
过滤介质除菌是目前发酵工业中空气除菌的主要手段，其介质有棉花过滤器、超细玻璃纤维纸、石棉滤板、金属烧结管等。
1）过滤除菌流程及设备
流程如下：
采风塔→空气粗过滤器→空气压缩机→储气罐→冷却器→旋风分离器→冷却器→丝网除沫器→空气加热器→总空气过滤器。
设备如下：
1.采风塔：
采风塔建在工厂的上风头，高至少10m,气流速度8m/s。
2.粗过滤器：
主要作用是拦截空气中较大的灰尘以保护空气压缩机，同时起一定的除菌作用，减轻总过滤器的负担。
3.空气压缩机：
作用是提供动力，以克服随后各设备的阻力。
4.空气储罐：
作用是消除压缩空气的脉动。
要求：
H/B=2～2.5V=（0.1～0.2）V1
其中，H为罐高；
B为罐直径；
V1为空压机每分钟排气量（20℃，1×
105Pa状况下）。
5.旋风分离器：
是利用离心力进行气-固或气-液沉降分离的设备。
作用是分离空气中被冷却成雾状的较大的水雾和油雾粒子。
6.冷却器：
空压机出口温度气温在120℃左右，必须冷却。
另外在潮湿的地域和季节还可以达到降湿的目的。
7.丝网除沫器：
可以除去空气中绝大多数的20µ
m以上的液滴和1µ
m以上的雾滴，一般采用规格为直径0.25㎜×
40孔且高度为150㎜的不锈钢丝网。
8.空气加热器：
列管内走空气，管外走蒸汽。
可将空气湿度由100%降低到70%以下。
9.总过滤器：
填充物按下面顺序安装：
孔板→铁丝网→麻布→活性炭→麻布→棉花→麻布→铁丝网→孔板。
介质要紧密均匀，压紧一致，上下棉花层厚度为总过滤层厚度的1/4，中间活性炭层为1/3。
2）无菌空气的检查
现在采用的无菌检查实验方法有肉汤培养法、斜面培养法和双碟培养法。
这里采用斜面培养法来检查。
具体方法如下：
500ml三角瓶内装斜面培养基50m1，其组成为麦芽糖6％、豆粕水解液6％、Na2HPO4·
12H2O0.8％、（NH4）2SO40.4％、CaCl20.2％、NH4C10.15％，
pH6.5～7.0，接种后置旋转式摇床亡，（37±
1）℃下培养28h左右备用。
3.3.3发酵罐的灭菌
发酵罐的灭菌可采用空罐灭菌和实罐灭菌，此处采用空罐灭菌。
空罐灭菌是将所有的通气口都稍微打开，然后通入热水蒸汽，让水蒸汽尽量通过每一个菌落达到灭菌效果。
具体方法是：
在121℃灭菌30分钟。
3.4种子扩大培养
本发酵属于一级种子罐扩大培养，二级发酵。
设计流程如下：
孢子→锥形瓶→种子罐→发酵罐
3.4.1孢子制备
将保存在淀粉琼脂斜面上的枯草芽孢杆菌孢子用无菌水洗下，接种到锥形瓶中，在35℃静置培养2～4天，待长出大量孢子后作为接种用的种子。
3.4.2种子制备
将保藏的菌种接种到马铃薯茄子瓶斜面（20%马铃薯煎出汁加MgSO4·
7H2O5mg/L，琼脂2%，pH6.7～7.0），37℃培养3天。
然后接入到20L种子罐，37℃搅拌，通风培养12～14小时。
此时菌种进入对数生长期（镜检细胞密集，粗壮整齐，大多数细胞单独存在，少数呈链状，发酵液pH6.3～6.8,酶活5～10U/mL），再接种到发酵罐。
3.4.3发酵罐培养
培养基的配制：
用麦芽糖液配置成含麦芽糖6％、豆粕水解液6％～7％、Na2HPO4·
12H2O0.8％、（NH4）2SO40.4％、CaCl20.2％、NH4Cl0.15％、豆油1kg、深井水20L，调pH至6.5～7.0。
发酵罐培养基经消毒灭菌冷却后接入3%～5%种子培养成熟液。
培养条件为：
温度37±
1℃，罐压0.5kg／cm2，风量1～20h为1：
0.48vvm，20h后1：
0.67vvm，培养时间为28～36h。
3.5发酵过程的工艺控制
1）发酵过程的补料策略
中间补料是在发酵过程中补充某些营养物料、水或产酶促进剂，以满足微生物的代谢活动和产酶的需要。
α-淀粉酶生产中要经常补料，用3倍年度浓度碳源的培养基补料，体积相当基础料的1/2，从培养12h开始，每小时1次，分30余次补加完毕。
延长了发酵时间，提高了酶活力和单罐产量。
2）发酵过程pH值的控制
各种微生物需要在一定的pH环境中方能正常生长繁殖。
培养基中C/N比值高，发酵液倾向于酸性，pH偏低；
C/N比值低，发酵液倾向于中性或碱性，pH偏高。
α-淀粉酶最适pH为6.8～7.2。
因此，在发酵过程中，可通过添加适量的尿素或碳酸钙等来调节pH上升或下降。
3）发酵过程温度的控制
温度对微生物的生长、产物的合成和代谢调节有重要作用。
温度变化一方面影响各种酶反应的速率和蛋白的性质，另一方面影响发酵液的物理性质。
不同的菌种有着不同的最适温度。
枯草杆菌发酵温度控制在35℃～37℃最适宜。
4）溶氧的控制
α-淀粉酶发酵是需氧发酵，无论是基质的氧化，菌体的生长还是产物的合成均需大量的氧气。
若发酵液中氧气不足，可通过加大通气量，适当降低温度，提高罐压，补水，提高搅拌速度来控制。
α-淀粉酶发酵过程中，0～12h通气量为1：
0.67vvm，12h至发酵结束通气量为1：
（1.0～1.33）vvm搅拌转速200r/min。
罐压0.5kg/cm2。
5）染菌的控制
在工业发酵中，染菌轻则影响产品的质和量、重则倒罐或停产、影响工厂效益。
因此要严格无菌操作，种子灭菌要彻底，净化空气设备，操作要慎重，设备灭菌要彻底。
若在前期染菌，应重新灭菌；
中期染菌，应偏离杂菌生长条件；
后期染菌，可提前或及时放罐。
可能出现的异常发酵现象：
1.培养基变稀：
可能是噬菌体污染或营养成分缺乏；
2.培养基过浓：
会抑制微生物的生长，考虑可能是污水污染；
3.耗糖较慢：
可能原因是种子生长能力降低，检测种子是否衰退，发酵条件是否合适，以及营养成分是否全面，尤其注意缺磷；
4.pH值不正常：
用缓冲对来调节，检查是否染杂菌，碳氮比是否合适；
5.生长缓慢：
最可能的原因
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