生物工程下游技术实验讲义Word文件下载.docx
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mL/min）
始终保护凝胶上端有一段液体
。
（注意不能干柱、分层、否则需重新装柱）
（四）凝胶柱柱效测定
1肉眼观察，柱子填装是否均匀，无纹路，无气泡
2用0.5ml2mg/mL的蓝色葡聚糖-2000上柱，如果色带狭窄、平整、均匀下降，表明柱中的凝胶填装情况较好，可以用来进行样品分离。
如果色带分散，歪曲，则需重新装柱。
（五）凝胶再生
鉴定完毕，打开出水口，继续用２～３倍床体积洗脱剂洗脱，洗脱后关闭出口，以备下次使用。
五、注意事项
1.
装柱要均匀，既不过松，也不过紧，流速不宜过快，避免因此压紧凝胶。
2.
始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分蒸发，凝胶变干。
也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动。
3.
所用凝胶比较昂贵，需小心操作，实验后回收，尽量避免浪费和损失
六、背景资料
凝胶层析的使用
（一）
层析柱
层析柱是凝胶层析技术中的主体，一般用玻璃管或有机玻璃管,柱的直径与长度根据经验，组别分离时，大多采用
20-30cm
长的层析柱，分级分离时，一般需要
100cm
左右长的层析柱，其直径在
1-5cm
范围内，小于
1cm
产生管壁效应，大于
5cm
则稀释现象严重。
由于层析柱的直径大小不影响分离度，所以样品量大时可用大直径的层析柱
（一般制备用凝胶柱，直径大于
2cm
但在加样时应将样品均匀分布于凝胶柱床面上
）
分离度取决于柱高，为分离不同组分，凝胶柱床必须有适宜的高度，分离度与柱高的平方根相关，但由于软凝胶柱过高挤压变形阻塞，一般不超过
1m。
⑴
分组分离时用短柱，一般凝胶柱长
20－30cm
，柱高与直径的比较
5:
1─10:
1
，样品溶液体积应小于
凝胶床体积为的
20%
⑵
分级分离时柱高与直径之线为
20:
1─100:
（层析柱滤板下的死体积应尽可能的小，如果支撑滤板下的死体积大，被分离组分之间重新混合的可能性就大，其结果是影响洗脱峰形，出现拖尾出象，降低分辩力。
在精确分离时，死体积不能超过总床体积的
1/1000
），样品溶液体积
应小于
5
%
⑶
脱盐：
高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。
适用的凝胶为
SephadexG-10、15、25
或
Bio-Gel-p-2、4、6
柱长与直径之比为
5-15
，样品体积可达柱床体积的
20-25%
，为了防止蛋白质脱盐后溶解度降低会形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸铵等挥发性盐类缓冲液使层析柱平衡，然后加入样品，再用同样缓冲液洗脱，收集的洗脱液用冷冻干燥法除去挥发性盐类。
（二）凝胶的类型
常用凝胶有葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶。
具体的种类型号及性能列表如下：
种类及主要用途
化学组成
部分型号
颗粒大小（/目数）
分离性能（Da）
溶胀时间/h
20-25℃
90-100℃
葡聚糖凝胶（Sephadex
G-）
由葡聚糖和甘油基通过醚桥交联而成
G-10
100-200
＜700
3
G-15
120-200
＜1500
1
G-25
50-400
100-5,000
G-50
500-30,000
G-75
120-400
1,000-8,000
24
G-100
1,000-15,000
72
G-150
1,000-30000
G-200
1,000-60,000
聚丙烯酰胺凝胶（Bio-gel
p-）
由丙烯酰胺和双丙烯酰胺共聚而成
P-2
200-1,800
4
2
P-4
800-4,000
P-6
1,000-6,000
P-10
1,500-20,000
P-30
50-200
2,500-40,000
12
P-60
3,000-60,000
P-100
5,000-100,000
5
P-150
15,000-150,000
P-200
50,000-20,000
48
P-300
60,000-400,000
琼脂糖凝胶（Sepharose
gio-gel
由D-半乳糖和3、6脱水的L-半乳糖连接而成，为中性琼脂糖
A
0.5m
＜10,000-500,000
1.5m
＜10,000-1,500,000
5m
10,000-5,000,000
15m
10,000-15,000,000
50m
100,000-50,000,000
150m
1,000,000-150,000,000
（三）凝胶的选择
根据所需凝胶体积，估计所需干胶的量。
一般葡聚糖凝胶吸水后的凝胶体积约为其吸水量的2倍，例如
Sephadex
的吸水量为20，1克Sephadex
G─200
吸水后形成的凝胶体积约
40mL
凝胶的粒度也可影响层析分离效果。
粒度细分离效果好，但阻力大，流速慢。
一般实验室分离蛋白质采用
号筛目的的
效果好；
脱盐用
G-25、G-50，用粗粒，短柱，流速快。
（四）凝胶的制备
商品凝胶是干燥的颗粒使用前需直接在欲使用的洗脱液中膨胀。
为了加速膨胀，可用加热法，即在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温至近沸，这样可大大加速膨胀，通常1-2小时内即可完成。
特别是在使用软胶时，自然膨胀需24小时至数天，而用加热法在几小时内就可完成。
这种方法不但节约时间，而且还可消毒，除去凝胶中污染的细菌和排除胶内的空气。
（五）样品溶液的处理
样品溶液如有沉淀应过滤或离心除去，如含脂类可高速离心或通过
G-15短柱除去。
样品的粘度不能太大，否则影响分离效果。
上柱样品液的体积根据凝胶床体积的分离要求确定。
（六）防止微生物的污染
交联葡聚糖和琼脂糖都是多糖类物质，防止微生物的生长，在凝胶层析中十分重要，常用的抑菌剂有：
（1）叠氨钠（NaN3）
在凝胶层析中只要用
0.02％叠氮钠已足够防止微生物的生长，叠氮钠易溶于水，在20℃时约为40%。
它不与蛋白质或碳水化合物相互作用，因此叠氮钠不影响抗体活力；
不会改变蛋白质和碳水化合物的层析特性，但可干扰荧光标记蛋白质。
（2）可乐酮
[Cl
3C-C（OH）（CH3）2
]
在凝胶层析中使用浓度为0.01-0.02%
在微酸性溶液中它的杀菌效果最佳，在强碱性溶液中或温度高于60℃
时易引起分解而失效。
（3）乙基汞代巯基水杨酸钠
在凝胶层析中作为抑菌剂使用浓度为
0.05-0.01
%。
在微酸性溶液中最为有效。
重金属离子可使乙基代巯基的物质结合，因而包含疏基的蛋白质可在不同程度上降低它的抑菌效果。
（4）苯基汞代盐
在凝胶层析中使用浓度为
0.001%-0.01
在微碱性溶液中抑效果最佳，长时间放置时可与卤素、硝酸根离子作用而产生沉淀；
还原剂可引起此化合物分解；
含疏基的物质亦可降低或抑制它的抑菌作用。
（六）凝胶回收
如果不再使用可将其回收，一般方法是将凝胶用水冲洗干净滤干，依次用
70％、90％、95％乙醇脱水平衡至乙醇浓度达
90％以上，滤干，再用乙醚洗去乙醇、滤干、干燥保存。
湿态保存方法是凝胶浆中加入抑菌剂或水冲洗到中性，密封后高压灭菌保存。
实验二溶菌酶的粗提取
一、实验目的
1.掌握等电点沉淀法进行初级分离的操作方法和注意事项；
2.能针对不同的目标产物选择恰当的初级分离方法，锻炼应用生物分离技术知识分析、解决实际问题的能力。
溶菌酶是一种有效的抗菌剂，全称为1,4-β-N-溶菌酶，又称作粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶或胞壁质酶。
是一种糖苷水解酶，能催化水解粘多糖的N-乙酰氨基葡萄糖与N-乙酰胞壁酸间的β-1，4糖苷键，由129氨基酸残基构成，由于其中含有较多碱性氨基酸残基，所以其等电点高达10.8左右，最适温度为50℃，最适PH为6～7左右。
溶菌酶广泛存在于动植物及微生物体内，鸡蛋（含量约为2%～4%）和哺乳动物的乳汁是溶菌酶的主要来源，目前，溶菌酶仍属于紧销的生化物质，鸡蛋的蛋清中含有丰富的上述物质，本实验以鸡蛋蛋清为原料，对溶菌酶进行提取。
溶菌酶常温下在中性盐溶液中具有较高天然活性，在中性条件下溶菌酶带正电荷，因此在分离制备时，先采用等电点法粗分离。
721型分光光度计、摇床、高速离心机，200mL烧杯、玻璃棒、漏斗、定性快速滤纸、200mL量筒、50mL离心管，鸡蛋一个、0.02mol/LPBS（pH8.0）,40%甘油
四、实验步骤
溶菌酶的粗提取（约两个半小时）
1.拿1个鸡蛋破壳取蛋清置于250mL烧杯中，轻轻搅拌5分钟，使其的稠度均匀，去除脐带和蛋壳。
记录其体积V1
2.加入1.5倍体积的pH8.0PBS缓冲液，搅拌均匀
3.用冰醋酸调pH4.7左右，充分搅拌
4.3500rpm，离心20min,弃沉淀，转移上清至烧杯中
5.加入1倍体积的pH8.0PBS缓冲液，搅拌均匀，并用5mol/LNaOH调pH8.0
6.滤纸过滤，取清液，测量并记录体积V2
7.取0.5ml蛋清于EP管中，装两管，-20℃冻存备用（样品S1）
8.剩余清液装在烧杯中-20℃冻存备用。
注：
保存样品需明确标记名称、班级、组号、日期。
五、实验注意事项
1.等电点沉淀后利用离心的办法，要尽量除去沉淀；
2.调节pH时要避免局部过酸；
3.提取过程中尽量避免泡沫的产生。
1.掌握离子层析的原理以及离子交换层析的操作方法
2.掌握离子交换树脂的再生和保存
离子交换层析是根据蛋白质所带电荷的差异进行分离纯化的一种方法。
蛋白质的带电性是由蛋白质多肽中带电氨基酸决定的。
由于蛋白质中氨基酸的电性又取决于介质中的pH，所以蛋白质的带电性也就依赖于介质的pH。
当pH较低时，负电基团被中和，而正电基团就很多;
在pH较高时，蛋白质的电性与低pH时相反。
当蛋白质所处的pH，使蛋白质的正负电荷相等，此时的pH称为等电点。
离子交换层析所用的交换剂是经酯化、氧化等化学反应引入阳性或阴性离子基团制成的，可与带相反电荷的蛋白质进行交换吸附。
带有阳离子基团的交换剂可置换吸附带负电荷的物质，称为阴离子交换剂，如DEAE-纤维素树脂;
反之称为阳离子交换剂，如CM-纤维素树脂。
不同的蛋白质有不同的等电点，在一定的条件下解离后所带的电荷种类和电荷量都不同，因而可与不同的离子交换剂以不同的亲和力相互交换吸附。
当缓冲液中的离子基团与结合在离子交换剂上的蛋白质相竞争时，亲和力小的蛋白质分子首先被解吸附而洗脱，而亲和力大的蛋白质则后被解吸附和洗脱。
因此，可通过增加缓冲液的离子强度和/或改变酸碱度，便可改变蛋白质的吸附状况，使不同亲和力的蛋白质得以分离。
三、实验器材
D152大孔弱酸性阳离子交换树脂，层析柱，试管及试管架，高速离心机（可用50mL离心管），冰箱，可见光分光光度计、摇床、烧杯、玻璃棒、漏斗、滤纸；
样品S1，0.5mol/LNaCl,0.02mol/LpH8.0的PBS（离子交换洗脱溶液，含0.5mol/LNaCl），0.02mol/L的磷酸盐缓冲剂（pH6.5），硫酸铵，NaOH，HCl,无水乙醇，聚乙二醇
四、实验内容与步骤
采用离子交换层析对实验二获得的初提液，进行进一步的分离纯化以得到较高纯度的溶菌酶。
具体来说包括：
1、D152树脂的处理：
将D152树脂先将蒸馏水洗去杂物，滤除，用1mol/LNaOH搅拌浸泡并搅拌4-8h，抽滤干NaOH,用蒸馏水洗近pH7.5左右，抽滤干，再用1mol/LHCl按上述方法处理树脂，知道全部转变为氢型，抽滤干HCl，用2mol/LNaOH处理树脂，是指转变为钠型，pH值不低于6.5。
吸干溶液，加0.02mol/L的磷酸盐缓冲剂（pH6.5）平衡树脂。
2.装柱
装柱方式与第一次课大家装填分子筛层析柱的方法一样。
注意不能使树脂露出水面，因为树脂露于空气中，当加入溶液时，树脂间隙中会产生气抱，而使交换不完全。
对于重复使用的填料，需要先冲3倍柱床体积蒸馏水，将保存用的乙醇洗脱出来。
取层析柱，自顶部注入经处理过的上述树脂悬浮液，关闭层析柱出口，带树脂沉降后，放过量的溶液，再加上一些树脂，至树脂沉积至15~20cm高度即可。
与柱子顶部继续加入0.02mol/L的磷酸盐缓冲剂（pH6.5）平衡树脂。
最终是流出液pH为6.5为止，关闭柱子出口，保持页面高出树脂表面1cm。
2.平衡
用3倍柱床体积的0.02MPBSpH8.0过柱。
这一步的作用是使得柱床体系的内外达到平衡与均一，以利后续目的蛋白的结合。
3.上样
用吸管将0.5mlS1样品加入层析柱，经过一段时间之后，蛋白将通过离子交换的方式，与介质相互作用而挂柱。
注意观察并记录280nm下吸收值的变化。
4.洗脱
用50mL含0.5mol/LNaCl的0.02mol/LpH8.0的PBS和50mL0.02mol/LpH8.0的PBS进行梯度洗脱。
收集洗脱峰，记录洗脱时间和洗脱峰体积V4。
取0.5mL清液于Ep管中，制备2管，-20℃备用（留样S4）
5.再生
用2倍柱体积的2mol/LNaCl过柱，然后水洗4倍柱体积。
洗脱完成后，需要进行离子交换填料的再生处理。
离子交换基团为一些盐所覆盖，影响下次的重复使用。
因此，先用高浓度的盐将与介质结合紧密的杂质洗脱下来，然后再恢复其离子交换功能。
对于CM-sepharose而言，只需要用水过柱即可以使其离子交换功能得到恢复。
6.保存
用2倍柱体积的20%乙醇过柱。
介质回收，用于蛋白质分离纯化的介质多保存于液体中。
保存时需加入一些抑菌剂，如叠氮化钠等。
对于本介质，只需采用20%乙醇保存即可。
四、注意事项
1．离子交换树脂再使用前需要再生，阴离子交换树脂以“碱酸碱”的顺序进行处理，阳离子交换树脂以“酸碱酸”的顺序进行处理和再生。
装柱时要求粒度均匀，比较致密，柱床表面平整，柱中无裂缝，气泡和沟流的现象。
2．加样蛋白浓度低于20mg/mL，上样体积小于柱体积的1/3。
3.在整个实验过程中，流速必须得到一定的控制。
过大，会使填料压缩紧密，导致流速过低，层析柱有可能堵塞而实验失败，流速过小，实验时间过长，引起酶的活性变化。
在我们的实验中，控制流速为2mL/min。
八、背景资料
（一）离子交换树脂
离子交换树脂是具有网状结构的复杂的有机高分子聚合物。
网状结构的骨架部分一段很稳定，不溶于酸、碱和一般溶剂。
在网状结构的骨架上有许多可被交换的活性基团。
根据活性基团的不同、离子交换树脂可分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂两大类。
由于本实验采用的是阳离子交换树脂，所以将其做重点介绍。
阳离子交换树脂具有酸性基团，如葡聚糖凝胶型、琼脂糖凝胶型以及强酸性磺酸型聚苯乙烯树脂等等。
这种树脂的化学性质很稳定，具有耐强酸、强碱、氧化剂和还原剂的性质，因此应用非常广泛。
各种阳离子交换树脂含有不同的活性基因、常见的有磺酸基（-SO3H）、羧基（-COOH）和酚基（-OH）等。
根据活性基团离解出H+能力的大小不同，阳离子交换树脂分为强酸性和弱酸性两种。
例如含-SO3的为强酸性阳离子交换树脂，常用R-SO3H表示（R表示树脂的骨架），含-COOH和-OH的弱酸性阳离子交换树脂，分别用R-COOH和R-OH表示。
强酸性阳离子交换树脂应用较广泛，弱酸性阳离子交换树脂的H+不易电离，所以在酸性溶液中不能应用，但它的选择性较高而且易于洗脱。
本次实验采用的离子交换树脂为CM-SepharoseF.F，其中Sepharose是指琼脂糖凝胶，CM是是弱酸性活性基团—羧甲基（-CH3COOH）。
离子交换反应和其他化学反应一样，完全服从质量作用定律。
树脂对离子亲合力的大小，与离子的水合离子半径大小和带电荷的多少有关。
经实验证明，在低浓度、常温下，离子交换树脂对不同离子的亲合力顺序有下列规律。
对于在弱酸性阳离子交换树脂中具有相同价态离子的亲合力顺序为：
Ag+＞Cs+＞Rb+＞K+＞NH4+＞Na+＞H+>
Li+
根据这些原理我们利用在此条件下溶菌酶的亲和力大于H+，所以弱酸性阳离子交换树脂的活性基团在离子交换过程中可吸附溶菌酶，再采用亲和力更大的Na+进行洗脱就可得到相对纯化的溶菌酶。
同时，为了监测分离纯化的效果，我们必须对相应的结果进行检测。
对于酶而言，主要通过其催化特异的反应进行监测。
溶菌酶对革兰氏阳性菌的细胞壁有明显的破坏作用，可利用这一特性进行溶菌酶活性的监测，以便我们区分在纯化过程中，含有溶菌酶的组分。
类似的采用DEAE-纤维素对抗体进行精制，特别是经过初步纯化后的Ig的纯化，效果尤为显著。
IgG的等电点为pI8.0，IgM，IgA的等电点为pI7.0，7.4，在pH8.0时IgG带正电荷，不能被DEAE-纤维素吸附而被洗脱下来，被DEAE-纤维素吸附的其它球蛋白，可用逐渐增加洗脱液中PO4
3-浓度的方法将其逐一洗脱，或降低pH使之洗脱出来。
目前常用的离子交换纤维素列于下表：
DEAE－纤维素
形状
长度（微米）
交换当量（mg当量/g）
蛋白吸附容量（毫克/克）
床体积（毫升/克）
胰岛素（pH8.5）
牛血清清蛋白（pH8.5）
pH6.0
pH7.5
DE-22
DE-23
DE-32
DE-52
CM－纤维素
CM-22
CM-23
CM-32
CM-52
改良纤维性*
同上（除细粒）
微粒性（干粉）
同上（溶胀）
改良纤维性
改良纤维性（除细粒）
微粒性（溶胀）
12~400
18~400
24~63
1.0±
0.1
0.6±
0.06
750
850
溶菌酶
（pH5.0）
600
1,260
450
660
7S－γ球蛋白（pH5.0）
150
400
7.7
8.3
6.0
pH5.0
9.1
6.8
6.3
6.7
6.
（二）离子交换层析
蛋白质进入离子交换柱后，与离子交换树脂无亲和力的蛋白质被洗脱下来。
余下的蛋白质均结合在树脂上，利用其蛋白质表面电荷性质的不同，与树脂的亲和力也各不相同，利用不同强度的离子溶液，将其分别洗脱下来达到分离、纯化蛋白质的目的。
以下对操作过程的要点进行说明。
1.离子交换剂预处理和装柱
对于离子交换纤维素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的颗粒，以保证有较好的均匀度，对于已溶胀好的产品则不必经这一步骤。
溶胀的交换剂使用前要用稀酸或稀碱处理，使之成为带H+或OH-的交换剂型。
阴离子交换剂常用“碱-酸-碱”处理，使最终转为-OH-型或盐型交换剂；
对于阳离子交换剂则用“酸-碱-酸”处理，使最终转为-H-型交换剂。
洗涤好的纤维素使用前必须平衡至所需的pH和离子强度。
已平衡的交换剂在装柱前还要减压除气泡。
为了避免颗粒大小不等的交换剂在自然沉降时分层，要适当加压装柱，同时使柱床压紧，减少死体积，有利于分辨率的提高。
柱子装好后再用起始缓冲液淋洗，直至达到充分平衡方可使用。
2.加样与洗脱
加样：
层析所用的样品应与起始缓冲液有相同的pH和离子强度，所选定的pH值应落在交换剂与被结合物有相反电荷的范围，同时要注意离子强度应低，可用透析、凝胶过滤或稀释法达此目的。
样品中的不溶物应在透析后或凝胶过滤前，以离心法除去。
为了达到满意的分离效果，上样量要适当，不要超过柱的负荷能力。
柱的负荷能力可用交换容量来推算，通常上样量为交换剂交换总量的1％－5%。
加样蛋白浓度低于20mg/mL，上样体积小于柱体积的1/3。
洗脱：
已结合样品的离子交换前，可通过改变溶液的pH或改变离子强度的方法将结合物洗脱，也可同时改变pH与离子强度。
为了使复杂的组份分离完全，往往需要逐步改变pH或离子强度，其中最简单的方法是阶段洗脱法，即分次将不同pH与离子强度的溶液加入，使不同成分逐步洗脱。
由于这种洗脱pH与离子强度的变化大，使许多洗脱体积相近的成分同时洗
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