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既然不是自生的，就必然已经存在，人们就可以去探索它，寻找它。
由此将微生物的探索方法由一项科学性观察转向成了一项实验科学，打开了研究感染性疾病病因的方法之门。
（2）在免疫学的预防接种方面，发现传染疾病的微菌，在特殊的培养之下可以减轻毒力，变成防病的药苗。
首次制成狂犬疫苗；
（3）发现并证实发酵是由微生物引起的；
（4）其他贡献，如巴斯德消毒法等
2）、柯赫的主要贡献及意义
（1）对病原细菌的研究作出了突出的贡献：
包括具体证实了炭疽杆菌是炭疽病的病原菌；
发现了肺结核病的病原菌（1905年获诺贝尔奖）；
提出了证明某种微生物是否为某种疾病病原体的基本原则——著名的柯赫原则，即①在每一相同病例中都出现这种微生物；
②要从寄主分离出这样的微生物并在培养基中培养出来；
③用这种微生物的纯培养接种健康而敏感的寄主，同样的疾病会重复发生；
④从试验发病的寄主中能再度分离培养出这种微生物来。
（2）微生物学基本操作技术方面的贡献包括：
细菌纯培养方法的建立；
设计了各种培养基，实现了在实验室内对各种微生物的培养；
流动蒸汽灭菌；
染色观察和显微摄影等技术。
柯赫根据巴斯德的工作，证明了微生物是疾病的原因，并进一步表明：
特定的疾病是由特定的微生物引起的。
进一步将微生物研究推向更高的一种科学水平上，形成了疾病确定的“柯赫原则”。
与此同时柯赫还向微生物学贡献了一系列研究技术。
“柯赫原则”以及柯赫发明的纯培养技术，促进了微生物学的极大发展。
5、微生物学的发展及贡献
（1）多学科交叉促进微生物学全面发展，使微生物学发展成为生命科学领域内一门发展最快、影响最大、体现生命科学发展主流的前沿科学。
（2）微生物学推动生命科学的发展。
促进许多重大生命理论问题的突破；
对生命科学研究技术的贡献，如细胞的人工培养、突变体筛选、DNA重组技术和遗传工程、微生物与“人类基因组计划”等。
教案二
第二章：
纯培养技术和显微技术
一、纯培养技术
1、分离获得微生物的纯培养物是研究利用微生物的基础。
获得纯培养物涉及的相关技术包括：
无菌技术、微生物的分离与分离纯化技术和微生物培养和保藏技术。
2、无菌技术：
包括培养基和物品的各种灭菌技术和微生物各种接种过程的无菌操作技术等。
重点在实验课中掌握相关的技术原理和操作规范，以牢固树立“无菌”的思想和概念。
3、固体培养基分离纯培养物的基本方法和原理
纯培养指的是只有一种微生物组成的细胞群体。
自然环境中微生物是混杂在一起的，因此分离获得纯培养物的基本原理：
首先采用方法将单个的细胞与其他细胞分离开，进而提供细胞合适的营养和条件，使其生长成为可见的群体。
进行微生物的分散主要采用稀释的方法，而固体培养基由于能够使分散的细胞固着于一定的位置，与其他的细胞分离，从而生长成为一个单细胞来源的群体－即纯培养，而成为常用而简便的分离介质和营养介质。
固体培养基分离纯培养物由于稀释方法的差异和接种平板的方式差异而分为以下几种方法：
（1）划线平板法
将合适的无菌培养基倒入无菌培养皿中，冷却后制备成平板，按以下方法划线：
平板划线法中细胞的分离和稀释过程发生在接种环在固体平板表面上的划线和移动过程中，产生的单个细胞在培养基表面生长的后代就是纯培养物。
（2）倾注平板法和涂布平板法
这两种方法的共同点就是在将细胞接种到培养基之前，通过液体稀释的方法分散细胞，最常用的液体稀释方法为10倍系列稀释，参考下图：
随着稀释程度的增大，单位体积中的微生物细胞数量减少，细胞得以分散。
稀释倾注平板法的操作是：
选择细胞得以分散的合适稀释度的菌悬液与灭完菌冷却到50-55°
C的培养基混合均匀，一起倒入无菌培养皿中，冷却形成平板后，培养。
稀释倾注平板法操作较麻烦。
在进行微生物分离纯化时，该方法需要样品与热的培养基混合，因此对热敏感微生物的影响明显；
该方法操作过程中，样品中的微生物有的分布于平板表面，有的则裹在培养基中，后者则会影响严格好氧微生物的生长；
而且，对于同一种微生物，平板表面的菌落形态与培养基内的菌落形态会存在着明显的差别，影响菌落形态的判别。
在进行微生物计数时，该方法细胞分散均匀，计数较准确。
稀释涂布平板方法的操作是：
首先将灭完菌冷却到50-55°
C的培养基倒入无菌培养皿中冷却形成平板，然后选择细胞得以分散的合适稀释度的菌悬液加到平板中央，以三角刮刀将之均匀地涂布于整个平板上，培养。
稀释涂布平板方法操作相对简单，它克服了倾注平板方法对热敏感微生物、严格好氧微生物和培养基内部菌落带来的不利影响，是实验室中经常使用的常规分离方法。
其存在的问题是有时会由于菌液太多或者涂布不均匀而使细胞分散不充分，影响计数结果和分离纯化效果。
（3）稀释摇管法
主要用于厌氧微生物的分离纯化，是稀释平板法的一种变通。
其基本操作流程为：
试管培养基融化à
50度保温à
样品梯度稀释后加入试管培养基中à
摇匀冷却凝固à
石蜡油封闭à
培养。
细胞固着于试管的琼脂柱中，再加以石蜡覆盖，就可以进行厌氧菌的分离纯化。
由于氧的存在对严格厌氧微生物有毒害作用，因此严格厌氧菌的培养往往需要专业的厌氧操作设备。
因此，稀释摇管法在虽然观察和挑取菌落时比较困难，但是在缺乏专业设备的条件下，此法仍是一项方便有效地进行厌氧微生物分离、纯化和培养的低成本方法。
所有以稀释为基础达到分离纯培养物的方法，其前提条件是该类群的微生物细胞必须在群体中占有数量上的优势，才能够在不断的稀释中不被淘汰而保留下来。
4、液体培养基分离纯培养的原理
液体培养基分离纯培养物仍然基于稀释的基本原理，但是需要高度稀释，致使一支试管中分配不到一个微生物细胞，至多只有一个细胞，这样才能够在液体培养基中获得纯培养物。
因此根据统计学原理，采用稀释法进行液体分离纯培养物时，必须要求在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数（一般应超过95%）试管中表现为不生长，这时表现为生长的试管中为纯培养的可能几率就增大（据统计计算，若同一稀释度的试管中有95%表现为不生长，在有细菌生长的试管中培养物来源于一个细胞（即纯培养）的几率为97.5%。
来源于两个细胞的几率为2.44%，来源于三个细胞的几率为0.04%）
5、选择培养分离与富集培养
非数量优势微生物类群的分离纯化则可以首先通过选择培养与富集培养的方式使其数量增加，成为数量优势菌群后，再通过上述各种平板法进行分离和纯化。
选择培养就是通过添加抑制剂，抑制大多数其它微生物的生长；
或者选择特定的营养物，使得需要的微生物易于快速生长。
——没有一种培养基或一种培养条件能够满足自然界中一切生物生长的要求，在一定程度上所有的培养基都是选择性的。
富集培养就是利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定特定的环境条件，使仅适应于该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，人们能够更容易地从自然界中分离到所需的特定微生物。
6、微生物的保藏技术
性状稳定的菌种纯培养物是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。
影响微生物菌种稳定性的因素：
a）变异b）污染c）死亡
基本要求：
在一定时间内使菌种不死、不变、不乱。
基本方法：
生活态:
培养基传代培养（斜面、平板、半固体）;
?
寄主传代培养
休眠态’?
冷冻（液氮、低温冰箱）;
干燥（沙土管、冷冻真空干燥）
其它方法：
滤纸片;
明胶片;
蒸馏水
对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各种不同的手段进行保藏，以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。
二、显微技术
由于微生物微小，多数肉眼无法看见，因此对于微生物世界的认识必须借助于显微技术。
显微技术不仅与显微镜自身的原理和特点有关，也取决于进行显微观察时对显微镜的正确使用及良好的标本制作和观察技术。
因此显微技术是微生物学的重要内容之一，在了解各种显微工具及其原理和应用优势后，还必须紧密结合试验课程熟练掌握微生物学研究的常规显微工具。
1、显微镜的分辨率
显微镜物象是否清楚不仅决定于放大倍数，还与显微镜的分辨率（Resolution）有关，它是决定观察效果的最重要的指标。
分辨率（力）（Resolution，R）指的是显微镜能够分辨两点之间最小距离能力。
能够分辨的距离越小，分辨率越高，反之越低。
依据德国理学家ErnstAbbe，在19世纪70年代建立的在Abbe的公式中，两物体之间的最小可分辨距离被称为最小距离（d）
0.5λ
最小可分辨距离：
d=——————
nsinθ
公式解析：
（l）所用光源的光波波长（λ），是影响最小可分辨距离的最主要因素。
可见光光线的波长为400-700nm，，其中蓝光的波长最短（400-500nm），最小可分辨距离最小，所提供的分辨率最高（所以为什麽大多数显微镜的滤光片都是蓝色的）。
（2）θ:
为物镜镜口角的半数，它取决于物镜的直径和工作距离。
（3）n：
玻片（样品）与物镜间介质的折射率（空气：
干燥物系；
香柏油：
油浸物系）。
（4）nsinθ:
被称为数值口径（NumericalAperture,NA），它是决定物镜性能的最重要的指标。
分辨率从定义上讲，与可分辨的最小距离（d）成反比，可表示为：
Ｒμ（１／ｄ）。
以这种方式将最小可分辨距离与分辨率作为两个概念分开理解，比较容易理解提高分辨率的相关措施（获得最小分辨距离à
提高分辨率）：
（1）减短光波波长（λ）。
（2）增加镜口角（θ）,这是增加数值口径的因素之一。
（3）增加介质的折射率（n），这是增加数值口径的重要因素。
如，利用油镜进行显微观察时，以香柏油取代空气，其重要作用就是提高介质折射率，使数值口径和分辨率均得到提高，同时香柏油与玻璃的折射率相近，使得很多原来在透镜和载玻片表面因折射和反射而损失的光线可以进入物镜，提高照明亮度，改善观察效果。
2、明视野显微镜
明视野显微镜即常用的普通光学显微镜，其照明光线直接进入视野，属透射照明。
生活的细菌在明视野显微镜下观察是透明的，不易看清。
解决的措施，一方面是对观察的样品进行改造，发展出各种染色技术，通过特殊的染色方法使细胞着色，增加与背景的反差，便于观察；
另一方面进行显微镜的改造，由此发展出不同种类的显微镜，适用于不同的观察目的。
3、暗视野显微镜
暗视野显微镜则利用特殊的聚光器遮挡中心光源，实现斜射照明，使照射到样品上的透射光线无法进入物镜，但由样品反射或折射的光线进入物镜，因此，整个视野是暗的，而样品是明亮的，由此达到增加反差，便于观察的目的。
并且，使用暗视野显微镜，即使所观察微粒的尺寸小于显微镜的分辨率，仍然可以发现其存在。
4、相差显微镜
光波的长短表现为颜色差别，光的振幅高低表现为明亮程度的不同。
观察样品各部分厚薄、密度不同，光线通过时直射光和衍射光的光程产生差别，导致出现相位差。
相差显微镜配备了特殊的光学装置，利用光的干涉现象，将光的相位差转变成人眼可辨的振幅差（明暗差），形成反差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见，因此相差显微镜很适合观察活的细胞以及细胞内的一些细微结构。
相差显微镜实现这一目的的特殊的光学装置主要是环状光圈和相板。
5、荧光显微镜
紫外线光源照射在具有荧光素的样本上，荧光素激发出荧光，使标本在暗的视野中显现出光亮的物体，不同的荧光素还表现为不同的颜色，由此可以进行定性和定量的研究。
主要应用于免疫学、环境微生物学和分子生物学等方面。
6、电子显微镜——透射电子显微镜与扫描电子显微镜
电子显微镜与光学显微镜的差异：
1）以电子波（波长最短可达到0.005nm）代替光源，由于波长的极大缩短而大大提高了分辨率。
光镜的最高分辨率可达到0.2μm，这种局限是由可见光的性质决定的，与显微镜自身的性能无关。
电镜实际的分辨率比光镜提高约1000倍。
2）电镜镜筒中要求高真空（在电子的运行中如遇到游离的气体分子会因碰撞而发生偏转，导致物象散乱不清）。
电子显微镜因需在真空条件下工作，所以很难观察活的生物。
3）以电子透镜（电磁圈）代替光学透镜，通过电磁圈使电子“光线”汇聚、聚焦。
4）电子像人肉眼看不到，需用荧光屏来显示或感光胶片作记录。
电子显微镜按结构和用途可分为：
透射电子显微镜（transmissionelectronmicroscope）:
电子束穿过薄切片
扫描电子显微镜（scanningelectronmicroscope）:
观察样品的表面结构
7、扫描隧道显微镜
是目前分辨率最高的显微镜，其横向分辨率可以达到0.1-0.2nm，纵向分辨率可以达到0.001nm，足以对单个的原子进行观察。
由于在扫描时不接触样品，又没有高能电子束轰击，因而可以避免样品的变形。
不仅可以在真空，而且可以在保持样品生理条件的大气及液体环境下工作，所以对生命科学研究领域具有十分重要的意义。
8、细菌染色法
由于微生物细胞微小，含水量多，因此在光学显微镜下为透明状态，与背景没有反差，无法进行观察，因此通过各种染色方法提高其反差。
细菌菌体（等电点一般pH2-5）在中性\碱性\或弱酸性溶液中带负电荷，易于碱性染料（正电荷）进行结合，所以常用碱性染料进行染色。
常见碱性染料:
结晶紫，番红，美蓝，孔雀绿；
中性红等。
常用的染色方法：
染色操作的基本程序为：
制片，干燥，固定，染色，水洗，干燥，镜检。
ˉ
革兰氏染色（C.Gram于1884年发明的一种鉴别不同类型细菌的染色方法。
）
结晶紫初染，碘液媒染，酒精脱色，番红复染。
教案三
第三章：
微生物细胞的结构与功能
第一节：
原核微生物
1、微生物的主要类群：
2、原核微生物
指细胞核无核膜包裹，只存在由裸露DNA组成的核区（nuclearregion）的原始单细胞生物。
主要类群包括细菌与古生菌。
细菌又称真细菌（eubacteria），包括普通细菌、放线菌、蓝细菌、支原体、立克次氏体和衣原体等（三菌三体）。
古生菌，在进化谱系上与真细菌及真核生物相互并列，且与后者关系更近，而其细胞构造却与真细菌较为接近，同属于原核生物。
3、细菌细胞的基本形态
基本形态：
球状、杆状、螺旋状和其他形状。
球状菌：
细胞个体呈球形或椭圆形，球菌在细胞分裂时形成的不同空间排列方式，常被作为分类依据。
杆状菌：
细胞呈杆状或圆柱形，一般其粗细（直径）比较稳定，可作为分类依据；
而长度和排列方式常因生长阶段和培养条件不同而发生较大变化，一般不作为分类依据。
螺旋状：
包括
（1）弧菌，其菌体只有一个弯曲，其程度不足一圈，形似“C”字或逗号，鞭毛偏端生。
（2）螺菌,菌体回转如螺旋，螺旋数目和螺距大小因种而异（1-20）。
鞭毛二端生。
细胞壁坚韧，菌体较硬。
（3）螺旋体菌,菌体柔软，螺旋数目因种而异（3-70）。
用于运动的类似鞭毛的轴丝位于细胞外鞘内。
其它形状：
包括柄杆菌、星形细菌、方形细菌及各种条件下细胞正常发育受阻而产生的异常形态
4、细菌细胞的大小
一般细菌大小的度量单位为微米（micrometer,μm），目前发现的细菌中最小的与无细胞结构的病毒相仿（约50nm）；
最大的肉眼可见（0.75mm）。
一般细菌的大小范围：
球菌，0.5~1μm（直径）；
杆菌0.2~1μm（直径）×
1~80μm（长度）；
螺旋菌0.3~1mm（直径）×
1~50mm（长度）（长度是菌体两端点之间的距离，而非实际长度）。
5、细菌细胞的基本结构
6、细胞壁的主要功能
①固定细胞外形和提高机械强度，从而使其免受渗透压等外力的损伤。
②为细胞的生长、分裂和鞭毛运动所必需。
失去了细胞壁的原生质体，也就丧失了这些重要功能；
③阻拦酶蛋白和某些抗生素等大分子物质（分子量大于800）进入细胞，保护细胞免受溶菌酶、消化酶和青霉素等有害物质的损伤；
④赋予细菌具有特定的抗原性、致病性以及对抗生素和噬菌体的敏感性。
7、革兰氏阳性（G+）和革兰氏阴性（G-）细菌细胞壁的化学组成和结构特点
革兰氏阳性（G+）菌细胞壁特点：
厚度大（20~80nm），化学组分简单，一般只含90%肽聚糖和10%磷壁酸。
肽聚糖是真细菌细胞壁中的特有成分。
磷壁酸为革兰氏阳性细菌细胞壁中特有的一种酸性多糖。
革兰氏阴性（G-）细菌细胞壁特点结构分为肽聚糖层和外膜层。
其特点是肽聚糖层薄（2-3nm），层次多，化学组分复杂，强度低。
8、肽聚糖单体的化学组成和结构
肽聚糖单体中的化学组成：
①双糖单位，由由N-乙酰胞壁酸（NAMorM）和N-乙酰葡萄糖胺（NAGorG）l两种单糖之间以β-1,4-糖苷键[M
（1）-G（4）]连接形成。
该糖苷键很容易被溶菌酶（lysozyme）所水解，从而引起细菌因肽聚糖细胞壁的“散架”而死亡。
双糖单位是肽聚糖中糖链骨架的基本结构单位。
②四肽侧链，由四个氨基酸分子按L型与D型交替方式连接而成，连接于糖骨架的N-乙酰胞壁酸分子上。
③肽桥连接一条肽侧链的4位氨基酸和另一条肽侧链的3位氨基酸，变化多样，是不同微生物肽聚糖多样性的基础。
目前所知的肽聚糖已超过100种，主要的变化发生在肽桥上。
（附结构示意图）
9、磷壁酸
革兰氏阳性细菌细胞壁上特有的化学成分，主要成分为甘油磷酸或核糖醇磷酸。
膜磷壁酸（又称脂磷壁酸）跨越肽聚糖层并与细胞膜相交联的，由甘油磷酸链分子与细胞膜上的磷脂进行共价结合后形成。
其含量与培养条件关系不大。
可用45%热酚水提取，也可用热水从脱脂的冻干细菌中提取。
壁磷壁酸，它与肽聚糖分子间进行共价结合，含量会随培养基成分而改变，一般占细胞壁重量的10%，有时可接近50%。
用稀酸或稀碱可以提取。
磷壁酸的主要生理功能（p41）
①其磷酸分子上较多的负电荷可提高细胞周围Mg2+的浓度，进入细胞后就可保证细胞膜上一些需Mg2+的合成酶提高活性；
②贮藏磷元素；
③增强某些致病菌如A族链球菌（Streptococcus）对宿主细胞的粘连、避免被白细胞吞噬以及抗补体的作用；
④赋予革兰氏阳性细菌以特异的表面抗原；
⑤可作为噬菌体的特异性吸附受体；
⑥能调节细胞内自溶素（autolysin）的活力，借以防止细胞因自溶而死亡。
因为在细胞正常分裂时，自溶素可使旧壁适度水解并促使新壁不断插入，而当其活力过强时，则细菌会因细胞壁迅速水解而死亡。
10、革兰氏阴性细菌的细胞壁
（1）肽聚糖
它的肽聚糖埋藏在外膜层之内，是仅由1~2层肽聚糖网状分子组成的薄层（2~3nm），含量约占细胞壁总重的10%，故对机械强度的抵抗力较革兰氏阳性菌弱。
四肽尾的第3个氨基酸不是L-lys，而是内消旋二氨基庚二酸（m-DAP），一种只有在原核微生物细胞壁上才有的氨基酸。
没有特殊的肽桥，其前后两个单体间的连接仅通过甲四肽尾的第4个氨基酸——D-ala的羧基与乙四肽尾的第3个氨基酸——mDAP的氨基直接相连,只形成较为疏稀、机械强度较差的肽聚糖网套。
（2）外膜
位于革兰氏阴性细菌细胞壁外层，由脂多糖、磷脂和脂蛋白等若干种蛋白质组成的膜，有时也称为外壁。
a脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）
位于革兰氏阴性细菌细胞壁最外层的一层较厚（8~10nm）的类脂多糖类物质，由类脂A、核心多糖（corepolysaccharide）和O-特异侧链（O-specificsidechain，或称O-多糖或O-抗原）三部分组成。
Man,mannose,甘露糖
Abe,abequose,β-脱氧岩藻糖
Rha,rhamnose,鼠李糖
Gal,galactose,半乳糖
Glu,glucose,葡萄糖
GluNac,N-acetylglucosamine,N-乙酰葡萄糖胺
Hep,heptoses,庚糖
KDO,2-keto-3-deoxyotonate,2-酮-3-脱氧辛酮酸
脂多糖的主要功能
①LPS结构的多变，决定了革兰氏阴性细菌细胞表面抗原决定簇的多样性；
②因其负电荷较强，故与磷壁酸相似，也有吸附Mg2+、Ca2+等阳离子以提高其在细胞表面浓度的作用；
③类脂A是革兰氏阴性细菌致病物质——内毒素的物质基础；
④是许多噬菌体在细胞表面的吸附受体；
⑤具有控制某些物质进出细胞的部分选择性屏障功能；
可透过若干种较小的分子（嘌呤、嘧啶、双糖、肽类和氨基酸等），但能阻拦溶菌酶、抗生素（青霉素等）、去污剂和某些染料等较大分子进入细胞膜。
b外膜蛋白（outermembraneprotein）
嵌合在LPS和磷脂层外膜上的蛋白。
有20余种，但多数功能尚不清楚。
孔蛋白（porins）是由三个相同分子量（36000）蛋白亚基组成的一种三聚体跨膜蛋白，中间有一直径约1nm的孔道，通过孔的开闭，可对进入外膜层的物质进行选择。
非特异性孔蛋白：
可通过分子量小于800~900的任何亲水性分子
特异性孔蛋白：
只容许一种或少数几种相关物质通过，如维生素B12和核苷酸等。
C周质空间（periplasmicspace,periplasm）
又称壁膜间隙。
在革兰氏阴性细菌中，一般指其外膜与细胞膜之间的狭窄空间（宽约12~15nm），呈胶状。
周质空间是进出细胞的物质的重要中转站和反应场所
在周质空间中，存在着多种周质蛋白（periplasmic
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