MTT法绘制生长曲线.docx

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MTT法绘制生长曲线

MTT实验

实验材料：

1，5%FBS-L-DMEM,5x104个/ml细胞悬液，5mg/mlMTT溶液，DMSO,0.01MPBS,

2,96孔板共7个,酶标仪,50ml离心管，1.5ml离心管，0.22μm滤膜，锡箔纸，MTT工作液（1ml/管）

实验步骤：

1，分别选取生长良好的P1、P3、P5代BMSCs消化后制备成细胞悬液，调整细胞密度为5x104/ml。

接种到96孔板，每孔接种200μl细胞悬液进行培养（每孔1x104细胞）。

2，培养16-48后，每天选择6个培养孔各自加入MTT溶液（5mg/ml）20μl，37℃继续孵育。

3，孵育4h后终止培养，吸出孔内上清，此时应该倾斜96孔板，用枪头小心的将上清液吸去，不可吸去下面的结晶颗粒，慢慢吸去。

每孔加入150μlDMSO,室温振荡10min，使结晶充分溶解，于试验孔平行设不加细胞只加培养液的空白对照1孔。

注意事项：

【1】1,两种方法分离小型猪骨髓间充质干细胞的比较

分别取两组0,1,3代细胞，制成1x103的细胞悬液，接种到96孔板，每孔细胞悬液200微升，置37℃、5%CO2饱和湿度孵箱内孵育，各组每24小时分别取出4孔，每孔加入MTT（2mg/ml）20微升37℃孵育，4h后吸弃孔内培养液，每孔加入150微升分析纯的二甲基亚砜，移至酶联免疫检测仪上振荡10min,用分光光度计在492nm波长处测定每孔的吸光度值（OD492），以OD（492）值为纵坐标，时间为横坐标绘制生长曲线

【2】来自：

SD大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养的实验研究

大鼠MSCs生长曲线测定：

为了定量测定大鼠BMSCs的生长状况，对来源于同一动物的原代细胞进行连续培养。

分别选取生长良好的P1、P3、P5代BMSCs消化后制备成细胞悬液，调整细胞密度为5x104/ml。

接种到96孔板，每孔接种200μl细胞悬液进行培养（每孔1x104细胞）。

次日起每天选择6个培养孔各自加入MTT溶液（5mg/ml）20μl，37℃继续孵育4h后终止培养，吸出孔内上清，每孔加入150μlDMSO,室温振荡10min，使结晶充分溶解，于试验孔平行设不加细胞只加培养液的空白对照1孔。

在酶标仪上选择570nm波长，以空白孔调零，测定各孔吸光度（A）值，连续测7天，以时间为横轴，A值为纵轴绘制细胞生长曲线。

来自：

2003人骨髓间充质干细胞的分离培养及部分生物学特性的实验研究

来自：

2007贴壁法培养大鼠的骨髓间充质干细胞

来自：

大鼠骨髓间充质干细胞移植促进皮肤创伤愈合的研究

（3）接种细胞时，尽量混匀后再接种，尽量保持每孔细胞数接近

（4）为防止96孔板的边缘效应，最好在实验组留出一空孔，内加平衡盐溶液，或者培养液以维持适当湿度，减少实验误差。

（5）加入MTT时每孔加入量很少，通常是10-15微升，不宜准确定量，可以事先算好要加入的培养液总量，以及所需MTT量，混匀后再加入培养孔内。

（6）加入MTT时，建议熄灭酒精灯，配置好的MTT应避光冷藏，一周内用完，最好在加入MTT前换一次液。

（7）在进行检测期间需要换液，换液时最好不用PBS洗，这样会损失紫色结晶，可以将96孔板拿掉铺几张滤纸在其上，小心将板翻过来，孔中液体会流出来，且不会损失，肉眼可见的结晶，加入MTT溶解液后，上下吸收可以完全溶解甲簪。

（8）为了防止板来回移动对细胞的影响，因此，把需要测得的孔，做完所有操作后吸出来，放在一个外面用的酶标板里，然后上机检测。

（9）MTT对菌很敏感，所以整个过程都要无菌。

保存在-20℃，防止反复冻融，保存到4℃最多一周。

一旦变为绿色应禁止使用。

（10）加入DMSO前需要去掉原培养液，但是去掉原培养液就怕会丢失结晶，因此