分子生物学实验指导.docx

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分子生物学实验指导

分子生物学实验指导

（补充讲义）

南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学中心

二OO九年十二月

目录

实验总RNA的提取、定量与RT-PCR………………………………………………1

实验质粒DNA的提取、定量与酶切鉴定……………………………………………7

实验蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳………………………………………………………13

附录Ⅰ相关试剂盒说明书………………………………………………………………19

附录Ⅱ相关仪器使用说明书……………………………………………………………19

实验九总RNA的提取、定量与RT-PCR

一、总RNA的提取与定量

目的：

从细胞中分离RNA是分子生物学实验经常进行的操作之一，所提取RNA的质量是进行其它实验的基础，如Northern杂交，目的基因cDNA的克隆，荧光定量，文库构建等。

原理：

在哺乳动物中，平均每个细胞内大约含有10-5μgRNA，其中rRNA占总量的80%-85%，tRNA和核内小分子RNA占10-15%，而mRNA只占1-5%。

rRNA由28S、18S、5S等几类组成，这些RNA分子根据密度和分子大小，通过密度梯度离心、凝胶电泳、离子交换层析进行分离。

mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，在细胞中含量少，绝大多数mRNA分子（除血红蛋白、有些组蛋白mRNA以外），在3’端存在20-250个多聚腺苷酸（polyA）。

利用此特点，用oligo（dT）亲和层析柱分离mRNA。

RNA分离的方法有：

异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。

目前常用的是Trizol法。

Trizol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。

TRIzol的主要成分是异硫氰酸胍和酚。

异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。

酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8－羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。

在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相中。

取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。

Trizol试剂可用于小量样品（50~100mg组织、5×106细胞）也适用于大量样品（≥1g组织、>107细胞）。

对人，动物，植物组织，细菌均适用，整个提取过程在一小时内即可完成。

分离的总RNA无蛋白质和DNA污染，可用于Northernblot，dotblot，ployA筛选，体外翻译，RNase保护分析和分子克隆。

在用于RT-PCR时如果两条引物存在于一个单一外显子内，建议用无RNase的DNaseⅠ处理RNA样品，避免出现假阳性。

共纯化的DNA可用作标准，比较不同样品RNA的得率，也可用于PCR和酶切。

蛋白质可用于westernblotting。

核酸的最大吸收波长为260nm，蛋白质为280nm，在波长260nm时，1OD值相当于双链DNA浓度为50μg/ml，单链DNA和RNA浓度为40μg/ml，单链寡核苷酸的含量为33μg/ml，可以据此来计算核酸样品的浓度,还可通过测定在260nm和280nm的OD值的比值（OD260/OD280），估计核酸的纯度。

纯净DNA的比值为1.8,RNA为2.0。

若样品中含有酚和蛋白质将导致比值降低。

270nm存在高吸收表明有酚的干扰。

紫外分光光度法只能用于测定浓度大于0.25μg/ml的核酸溶液，对浓度更小的样品，可采用荧光分光光度法。

仪器和主要试剂：

1.紫外分光光度计、微量加样枪、灭菌超薄PCR反应管

2.Trizol试剂3.氯仿4.异丙醇5.75℅乙醇

6.无RNase的水或0.5℅SDS（溶液均需用DEPC处理过的水配制）

实验方法：

[本次实验采用TaKaRa公司的RNAisoPlus试剂]

（一）RNA提取

1.匀浆处理:

a.组织将组织在液氮中磨碎，每50-100mg组织加入1mlTrizol，用匀浆仪进行匀浆处理。

样品体积不应超过Trizol体积10℅。

b.单层培养细胞直接在培养板中加入Trizol裂解细胞，每10cm2面积加1ml，用移液器吸打几次。

Trizol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。

Trizol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。

c.细胞悬液离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1mlTrizol，反复吸打。

加Trizol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。

一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。

（注意：

匀浆一定要彻底，是提取高质量RNA的前提；细胞数量与Trizol的比例，细胞的数量不能过多。

）

2.将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5min，使核酸蛋白复合物完全分离。

3.可选步骤：

如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10min，取上清。

离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。

处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。

取澄清的匀浆液进行下一步操作。

4.每使用1mlTrizol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15s，室温放置3min。

（注意：

此步振荡非常重要，建议在旋涡振荡器上进行。

）

5.2-8℃10000×g离心15min。

样品分为三层：

底层为黄色（红或绿）有机相，上层为无色水相和一个中间层。

RNA主要在水相中，水相体积约为所用Trizol试剂的60℅。

6.把水相转移到新管中（如要分离DNA和蛋白质可保留有机相），用异丙醇沉淀水相中的RNA。

每使用1mlTrizol加入0.5ml异丙醇，室温放置10min。

7.2-8℃10000g离心10min，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。

移去上清。

8.用75℅乙醇洗涤RNA沉淀。

每使用1mlTrizol至少加1ml75℅乙醇。

2-8℃不超过7500g离心5min，弃上清。

9.室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，不要晾得过干，否则不易溶解，大约晾5-10min。

加入25-200μl无RNase的水，-70℃保存。

（二）紫外吸收检测RNA的浓度和纯度

21.紫外分光光度计先用水在260nm和280nm两个波长下校零。

2.取RNA样品2μl，用水稀释50倍，转入分光光度计的石英比色杯中。

3.在260nm和280nm分别读出样品OD值。

根据260nm时1OD单位的单链RNA=40μg/ml和稀释倍数，可以计算出样品RNA的浓度和产量。

4.若OD260/OD280小于2，说明可能有DNA片段污染，可以考虑用无RNase的DNase处理样品，若小于1.8，说明样品中还可能含有蛋白质或酚，应再用酚/氯仿抽提，以乙醇沉淀纯化RNA。

注意事项：

1.从少量样品（1-10mg组织或102-104细胞）中提取RNA是可加入少许糖原以促进RNA沉淀。

例如加1mlTrizol匀浆样品，沉淀RNA前加5-10μgRNase-free糖原。

糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml是不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。

2.匀浆后加氯仿之前样品可在-60～-70℃保存至少一个月。

RNA沉淀可保存在75%酒精中2-8℃一个星期以上或-5--20℃一年以上。

3.预期产量：

1mg组织或1×106细胞提取RNA分别为：

肝和脾6-10μg，肾3-4μg，骨骼肌和脑组织1-1.5μg，胎盘1-4μg，上皮细胞8-15μg，成纤维细胞5-7μg。

4.蛋白聚糖和多糖污染:

沉淀RNA的过程中作以下改进可去除这些污染，步骤7中，每使用1mlTrizol在水相中加0.25ml异丙醇和0.25ml高盐溶液（0.8mol/L柠檬酸钠和1.2mol/LNaCl）混合离心，按之前操作进行。

这种方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，高效沉淀出纯RNA。

从含有大量多糖的植物中提取RNA时应在匀浆后离心，并加上以上操作步骤。

5.预防RNase污染措施：

经常更换新手套，皮肤上常带有的细菌，霉菌可能成为RNase的来源。

使用灭过菌的RNA专用塑料制品避免交叉污染。

RNA在Trizol试剂中时不会被RNase污染，但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。

玻璃器皿可在150℃烘烤4小时，塑料制品可在0.5mol/LNaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，高压灭菌，即可去除RNase。

配制溶液应使用无RNase的水（将水加入处理过不含RNase的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.01℅v/v，放置过夜，高压灭菌。

注：

DEPC有致癌之嫌，需小心操作。

RNA的提取常见问题分析

问题

解析

得率低

A．样品裂解或匀浆处理不彻底

B．RNA沉淀未完全溶解

A260/A280<1.65

A．检测吸光度时，RNA样品没有溶于水，而溶于了TE中

二、逆转录-聚合酶链反应（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction，RT-PCR）

原理：

提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。

再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。

RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。

该技术主要用于：

分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。

（一）反转录酶的选择

1．Money鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：

有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。

最适作用温度为37℃。

2．禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：

有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。

最适作用温度为42℃。

3．Thermusthermophilus、Thermusflavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：

在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。

4．MMLV反转录酶的RNaseH-突变体：

商品名为Superscript和SuperScriptⅡ。

此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。

（二）合成cDNA引物的选择

1．随机六聚体引物：

当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。

用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。

通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。

2．Oligo（dT）：

是一种对mRNA特异的方法。

因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly（A+）尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。

由于Poly（A+）RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。

3．特异性引物：

最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA3’端最靠近的配对引物起始。

用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。

仪器和主要试剂：