高效液相色谱知识.docx

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（一）、开机：

   1、打开计算机,进入WindowsNT（或Windows2000）画面,并运行BootpServer程序。

    2、打开1100LC各模块电源。

    3、待各模块自检完成后，双击Instrument1Online图标，化学工作站自动与1100LC通讯，进入的工作站画面。

   4、从“View”菜单中选择“MethodandRuncontrol”画面,单击”View”菜单中的“ShowTopToolbar”，“Showstatustoolbar”，“Systemdiagram”,”Samplingdiagram”，使其命令前有“√”标志，来调用所需的界面。

  5、把流动相放入溶剂瓶中。

  6、打开Purge阀。

  7、单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击Setuppump选项，进入泵编辑画面。

  8、设Flow：

5ml/min，单击OK。

  9、单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击Pumpcontrol选项，选中On，单击OK，则系统开始Purge，直到管线内（由溶剂瓶到泵入口）无气泡为止,切换通道继续Purge，直到所有要用通道无气泡为止。

  10、单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击PumpControl选项，选中Off，单击Ok关泵，关闭Purge valve。

  11、单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击Setuppump选项，进入Pump编辑画面，设Flow：

1.0ml/min。

  12、单击泵下面的瓶图标，输入溶剂的实际体积和瓶体积。

也可输入停泵的体积。

单击Ok。

（二）数据采集方法编辑：

   1、开始编辑完整方法：

    ●从“Method”菜单中选择“Editentiremethod”项，如上图所示选中除“Data analysis”外的三项，单击Ok，进入下一画面。

   2、方法信息：

    ●在“MethodComments”中加入方法的信息（如：

方法的用途等）。

    ●单击Ok进入下一画面。

   3、泵参数设定：

（以二元泵为例）

     ●在“Flow”处输入流量,如1ml/min，在“SolventB”处输入70.0,（A=100-B）,也可Insert一行”Timetable”,编辑梯度。

在“PressureLimitsMax”处输入柱子的最大耐高压，以保护柱子。

    ● 单击Ok进入下一画面。

   4、自动进样器参数设定:

     ●选择合适的进样方式,进样体积1.0ul,洗瓶位置为6号。

“StandardInjection”----只能输入进样体积，此方式无洗针功能。

“InjectionwithNeedleWash”----可以输入进样体积和洗瓶位置，此方式针从样品瓶抽完样品后，会在洗瓶中洗针。

“Useinjectorprogram”---可以点击Edit键进行进样程序编辑。

    ●点击Ok进入下一画面。

   5、柱温箱参数设定:

     ●在”Temperature”下面的方框内输入所需温度,并选中它,点击”more>>”键,如图所示,选中”Sameasleft”---使柱温箱的温度左右一致。

      ●点击ok进入下一画面。

    6、VWD检测器参数设定:

      ●在”Wavelength”下方的空白处输入所需的检测波长,如254nm, 在”Peakwidth（Responsetime）”下方点击下拉式三角框,选择合适的响应时间,如>0.1min （2s）。

       ●在Timetable中可以“Insert”一行，输入随时间切换的波长，如1min ，波长=300nm。

点击ok进入下一画面。

   7、DAD检测器参数设定:

      ●检测波长:

254nm,BW=30nm,    参比波长=350nm,BW=100nm; 

      ●检测波长：

一般选择最大吸收处的波长。

样品带宽BW：

一般选择最大吸收值一半处的整个宽度。

参比波长：

一般选择在靠近样品信号的无吸收或低吸收区域。

参比带宽BW：

至少要与样品信号的带宽相等，许多情况下用100nm作为缺省值。

Peakwidth（Responsetime）：

其值尽可能接近要测的窄峰峰宽。

Slit—狭缝窄，光谱分辨率高；宽时，噪音低。

同时可以输入采集光谱方式，步长，范围，阈值。

选中所用的灯。

      ●点击Ok进入下一画面。

     8、RID检测器参数设定:

      ●色谱条件:

        进样体积:

20ul。

     光学单元温度:

 Off。

        极性:

正。

          峰宽（响应时间）:

 4s 。

       ●“OpticalUnitTemperature”---若环境温度控制在±2℃,设定为Off, 若环境温度不稳定,则设定光学单元温度为高于环境温度5度,以防样品在池中沉淀。

“Peakwidth”---大多数分析设为4S，只有在高速分析下设为更短。

“Automaticrecyclingafteranalysis”---在不进行分析时可以让流动相循环，节省流动相，检测器连续运行，可随时投入使用。

      ●点击RID图标，选择RID Control：

Heater设为On，若要循环流动相，必须将“RecyclingValve”设为ON。

手动purge参比池，将其设为On，并输入Purge时间。

     9、FLD检测器参数设定:

       色谱条件：

       ●  样品：

P/N01018-68704 用甲醇稀释为1:

10。

       ●   进样体积：

5ul。

       ●   柱温箱:

 30℃。

  EX=246nm,EM=317nm,PMT=10。

        ●   响应时间=4s.    停止时间：

出峰完毕。

       ●   ExcitationA:

激发波长:

200-700nm,步长为1nm,或ZeroOrder。

       ●   Emission:

  发射波长:

280-900nm,步长为1nm,或ZeroOrder。

       ●   PMT:

 大多数应用适当的设定值为10,若高浓度样品峰被切平头,则减少PMT值。

        ● “Peakwidth”：

大多数应用设为4s，只有快速分析采用小的设定值。

       ●   MultiEx：

多波长及光谱（激发）。

       ●   MultiEm：

多波长及光谱（发射）。

       ●   同时可以输入范围Range、步长step、采集光谱。

     10、在“Runtimechecklist”中选中“Dataacquisition”，单击Ok。

     11、单击“Method”菜单，选中“Savemethodas”，输入一方法名，如“test”，单击Ok。

     12、从菜单“View”中选中”Onlinesignal”,选中Windows1,然后单击Change钮,将所要绘图的信号移到右边的框中,点击Ok.（如同时检测二个信号,则重复12,选中Windows2）。

     13、从“Run control”菜单中选择“Sampleinfo”选项，如上图所示，输入操作者名称，在“Datafile”中选择“Manual”或“Prefix”。

     区别:

 Manual--每次做样之前必须给出新名字,否则仪器会将上次的数据覆盖。

Prefix—在Prefix框中输入前缀，在Counter框中输入计数器的起始位，仪器会自动命名，如vwd0001，vwd0002……。

    14、从Instrument菜单选择Systemon。

    15、等仪器Ready，基线平稳，从Method菜单中选择“Runmethod”，进样。

（三）、数据分析方法编辑:

   1、从“View”菜单中，单击“Dataanalysis”进入数据分析画面。

   2、从“File”菜单选择“Loadsignal”，选中您的数据文件名，如下图所示。

单击Ok。

   3、做谱图优化,从“Graphics”菜单中选择“Signaloptions”选项，。

从Ranges中选择Autoscale及合适的显示时间，单击ok,或选择”UseRanges”调整。

反复进行，直到图的比例合适为止。

   4、积分:

（1）、从“Integration”中选择“Autointegrate”,如积分结果不理想,再从菜单中选择“Integration Events”选项，选择合适的Slopesensitivity，Peakwidth，Areareject，Heightreject。

（2）、从“Integration”菜单中选择“Integrate”选项，则数据被积分。

      （3）、如积分结果不理想，则修改相应的积分参数，直到满意为止。

     （4）、单击左边“√”图标，将积分参数存入方法。

   5、打印报告:

（1）、从“Report”菜单中选择“Specifyreport”选项，进入如上画面。

（2）、单击“Quantitative Results”框中Calculate右侧的黑三角，选中Percent（面积百分比），其它选项不变。

     （3）、单击Ok.

     （4）、从“Report”菜单中选择“Printreport”，则报告结果将打印到屏幕上，如想输出到打印机上，则单击Report底部的“Print”钮。

（四）、关机:

     ● 关机前，用100%的水冲洗系统20分钟，然后用有机溶剂冲洗系统10分钟（如ACN），然后关泵，（适于反相色谱柱）。

[正相色谱柱用适当的溶剂冲洗]

     ● 退出化学工作站，及其它窗口，关闭计算机（用shutdown关）。

关掉Agilent1100电源开关。

Agilent1100高压液相色谱仪维护保养知识保养事项：

1、色谱柱长时间不用，存放时，柱内应充满溶剂，两端封死（如ACN适于反相色谱柱，正相色谱柱用相应的有机相）

2、对于手动进样器，当使用缓冲溶液时，要用水冲洗进样口，同时搬动进样阀数次，每次数毫升。

3、流动相使用前必须过滤，不要使用多日存放的蒸馏水（易长菌）。

4、带seal-wash的1100，要配制90