总酵母生产实训3Word文件下载.docx
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发酵罐操作使用规程18
附录3：
酵母生产中的检测分析22
绪论
一、实验目的
本实训项目，“利用糖蜜高密度生产酵母片”，是目前生物技术中应用和研究较为活跃的领域。
酵母中富含维生素B1、维生素B2、烟酸，还含有维生素B12、维生素B6、叶酸、肌醇、转化酶等。
一般来说，人体内不能合成维生素B1和维生素B2，需通过摄食补给。
人体一天最多吸收12毫克左右的维生素B1，若缺乏维生素B1可以引起脚气病、心功能不全、多发性神经周围炎、体重下降及厌食。
维生素B2每日需要量约2毫克，缺乏会引起口角炎等皮肤病变。
烟酸在体内转变成烟酰胺后才具有维生素的作用，其功能是降血脂及扩张周围血管。
缺乏烟酸可引起糙皮病。
维生素B12、维生素B6、叶酸、肌醇能参与体内氨基酸和脂肪的代谢。
所以酵母片在临床上主要用于B族维生素缺乏症，及对消化不良有辅助治疗作用。
本次大型实验是在学生学习了微生物学、生物化学、生物制药设备及生物制药工艺学、制剂学等专业课程之后进行的一次综合性实验，是对学生专业知识掌握程度及动手操作能力的全面强化和考核。
在为期二周的实验过程中，希望学生能以积极认真的态度投入，确保实验顺利完成，在实验中有出色的表现，取得优良的实验结果。
二、实验内容和进度安排
本实验可分为以下几个部分：
1、酵母种的选育、纯化和保藏；
2、酵母种的扩培工作；
3、糖蜜原料的预处理与培养基的制备；
4、发酵罐及其附属设备和管路等结构的了解和操作应用；
5、按照发酵工艺的要求，正确操作控制发酵罐进行产品生产；
6、酵母的离心收集、干燥和制片。
相应地实验进度安排如下：
第一阶段：
即准备阶段，包括实操动员，任务下达，学生分组；
查阅资料，设计拟订整个酵母片生产的工艺方案；
了解发酵设备的构成，并用水来模拟发酵的启动和生产过程中的控制、采样等操作；
配置必要的显微染色剂和化学分析试剂。
第二阶段：
酵母种的选育、纯化和保藏；
第三阶段：
糖蜜原料预处理；
第四阶段：
种子的扩培；
第五阶段：
上罐生产；
第六阶段：
酵母产品的分离、制片和干燥。
第七阶段：
实验用品的整理清洗；
第八阶段：
整理实验报告，并及时上交。
三、训练技能与要求
1独立制定工艺流程的能力
2独立制定工作进度的能力
3确定各种培养基配方和计划培养基用量的能力
4确定有关检测方法和计划试剂用量的能力
5掌握菌种分离纯化、保藏的原理和技术
6掌握种子扩培的原理和技能
7糖蜜预处理方法和质量鉴定
8熟练掌握发酵罐管道灭菌、空罐灭菌、实罐灭菌、接种、取样等无菌操作技能
9掌握有关工艺参数的控制技能
10掌握酵母分离、制片和干燥的技能
11掌握有关检验分析的技能
12具备初步生产成本分析的能力
13具备生产指标分析的能力（总结、提出改进）
酵母菌种选育及纯培养
一、酵母菌种培养基的制备
酵母培养一直是人们不懈探索的内容，经过许多年的积累，形成了一些比较经典的酵母培养基配方，可供参考借鉴。
下面就是在工业生产与实验室中常用的酵母培养基配方，仅供参考：
培养基1：
葡萄糖50克磷酸二氢钾2.5克尿素1克
酵母膏0.5克硫酸镁1克硫酸铁0.1克
孟加拉红（1%）0.23毫升水1000毫升
培养基2：
马铃薯（去皮）200克水1000毫升
将马铃薯洗净去皮，称取200克，切成小块，加1000毫升煮沸1小时，用双层纱布滤成清液。
加水补充因蒸发而减少的水分。
培养基3：
蔗糖150克蛋白胨5克磷酸二氢钾5克
硫酸镁2克碳酸钙5克水1000毫升
培养基4：
蛋白胨3%酵母膏0.5%酪蛋白水解物0.5%
葡萄糖4%硫酸锌1.4%自然PH值
培养基5：
豆汁100毫升酵母膏2克葡萄糖3克
自然PH值
豆汁制备：
取黄豆100克，加水1000毫升，煮沸30—40分钟取汁备用。
培养基6：
将普通麦芽汁稀释到100Bx，调pH约6.4即成。
不同的酵母培养基，具有不同的制备方法，下面仅以麦芽汁培养基的制备为例，说明酵母培养基制备的基本要求、原理及常用方法。
如果需要用到其它培养基，请自行查阅有关资料。
麦芽汁培养基的制备：
1、原理：
利用麦芽中的糖化酶与蛋白酶将麦芽中的淀粉和蛋白质等高分子不溶性物质逐渐分解成糊精、麦芽糖、多肽和各种氨基酸等可溶解性低分子物质，加水调节到一定浓度以利于酵母的培养。
2、实验材料
1大麦芽（无霉变、虫蛀）。
2水浴锅、烧杯、比色板、碘液、玻璃棒、纱布、漏斗、电炉、高压灭菌锅、组织捣碎机。
3、实验步骤
1首先计算麦芽的用量，根据所要制备的平板、斜面数目（一支平板需培养基约15ml，一去斜面约需5ml）及液体培养基体积计算。
一般根据经验，500g麦芽可配制合格的培养基体积为1~~~1.2L。
2称取大麦芽，用组织捣碎机粉碎（粉碎度适中，不能太粗，也不能太细），分别装入两个1升的烧杯中（每个约250克）。
3向每个烧杯中加入4倍麦芽重量的60℃热水，置于55℃水浴锅中保温糖化，间歇搅拌，约30~~~40分钟后将水浴锅升温至65℃，3~~~4小时后，用玻棒沾取少量糖化液于白色比色板内，加一滴碘液混合，颜色呈棕黄色即糖化完毕。
4用纱布过滤出去麦渣。
5把麦汁煮沸40分钟，出现沉淀物质，用多层纱布仔细、缓慢过滤，即得澄清的麦芽汁。
6上述麦芽汁约为15~~~18oBx，还应加水调整浓度为10~~~12oBx，
原麦芽汁体积x浓度
加水量==---------------------原麦芽汁体积
要求配制的浓度
⑥灭菌：
把制得麦芽汁置于三角瓶中，加棉塞，在高压灭菌锅中灭菌，0.07MPa,15分钟
⑦制备琼脂斜面和平板：
在上述制得的10~~~12oBx麦芽汁中，加入2%（w/w）的琼脂，加热溶解，调pH6.4，装入带棉塞的大三角瓶中，在高压灭菌锅中灭菌，0.07MPa,15分钟，然后冷却至50度左右，倒入事先已包扎灭菌好的试管和平皿中。
二、酵母种的纯化分离与扩大培养
1、酵母种子的要求：
a.酵母种子要纯，菌体粗壮，不能携带有任何其它杂菌；
b.用于生产的酵母种子要求生长能力强，生长周期短；
c.接种的酵母种子要有相当的菌体浓度，一般≥109/ml且总体积能满足生产规模的需求。
2、原理：
在进行酵母发酵之前，首先要获得优良纯种酵母，所以要对酵母种子进行纯种的分离纯化。
酵母的发酵生产是在发酵罐中进行，它需要一定数量的菌种进行繁殖，因此必须把斜面菌种经过多次逐级扩大培养，方可获得一定数量的菌种。
本实验发酵罐为10升，实际装量为6升，按照接种量10%计算，需要600毫升左右的酵母种子液。
3、实验材料：
1菌种：
各组给定
2培养基：
麦芽汁琼脂平板，麦芽汁琼脂斜面，无菌水，12oBx的麦芽汁，已处理的糖蜜
3三角瓶、烧杯、糖度计、灭菌锅、培养箱
4、纯化分离步骤：
①工艺流程：
菌悬液制备———→菌种梯度稀释————→菌种稀释液涂布麦芽汁琼脂平皿
|培养箱培养，
|28~~~30℃，
培养箱培养，28~~~30℃，↓16~~~20hr
斜面菌种←------------——挑单菌落观察、鉴定和接种
16~~~20hr麦芽汁琼脂斜面
注：
制备菌悬液之前，先要对菌种进行活化，若所用的菌种为斜面菌种，则接种新斜面培养24小时即可。
若所用菌种为干菌种，则用无菌水溶解于38℃活化1~~~2小时（1：
20溶解），每20min摇一次，即可。
活化结果检查可用美蓝染色法，取活化液0.5mL，加入9.5mL无菌水（在50mL）烧杯中，磁力搅拌5分钟（打碎酵母），美蓝染色3min，血球板计数（染色的为死亡）。
②各阶段要求：
˙a、菌悬液制备：
称取1g菌种，用100mL无菌水，将菌种所含酵母细胞悬浮于其中，制成菌悬液；
b、菌种梯度稀释：
将上述菌悬液依次稀释为10－３、10－４、10－５、10－６浓度梯度；
c、平皿涂布：
将上述各浓度梯度分别涂布麦芽汁琼脂平板，每浓度分别涂3个。
将涂布好的平皿在培养箱中于28~~~30℃培养16~~~20hr；
d、挑单菌落：
从培养好的平皿上，挑选生长旺盛，菌落边缘齐整且比较大的酵母单菌落，用显微镜观察形态，并接种斜面，培养斜面菌种保藏。
5、扩培步骤：
1
16~~~24hr12hr，静置
斜面菌种———→试管培养，内有10毫升液体————→250毫升三角瓶装100毫升麦芽汁
28~~~30℃28~~~30℃|摇床培养，
摇床培养，28~~~30℃，↓6~~~8hr
发酵罐←——700毫升的种子液←------------——2000毫升三角瓶装300毫升麦芽汁
6~~~8hr和300毫升的糖蜜
工艺流程：
要求学生自己按照时间，自己设计合理的实验进度，在安排进度时，要注意避开晚上上夜班的局面。
②各培养阶段要求：
a、斜面菌种的制备：
首先用12oBx麦芽汁加入2%琼脂，制成试管斜面培养基，灭菌后备用。
将酵母种一环，转接到上述培养基中，在28~~~30℃下培养，镜检达到对数生长旺盛期后即可用于下一阶段，或放入4℃冰箱保存。
b、液体试管培养：
从斜面种中挑取一环转接到装有10毫升麦芽汁的试管中，放在培养箱中28~~~30℃静置培养10~~~12hr，具体培养时间根据镜检的酵母状况而定（酵母处于对数生长期，大小均匀，数量较多）。
250毫升三角瓶中的培养：
把10毫升培养好的酵母液倒入装有100毫升麦芽汁的250毫升三角瓶中，进行摇床培养（150rpm），28~~~30℃，6~~~8hr。
c、2000毫升三角瓶中的扩培：
当上述100毫升菌液培养成熟后，将其倒入装300毫升麦芽汁和300毫升糖蜜（已加入营养盐）的2000毫升三角瓶，进行摇床培养（150rpm），成熟后接入发酵罐作为种子液。
注意事项：
a、在菌种扩培过程中，必须严格采用无菌操作方法，手、接种针及三角瓶瓶口均需用75%酒精擦拭。
b、菌种在扩培过程中必须镜检跟踪酵母的生长状况。
菌体形态正常，圆形或椭圆形，没有杂菌；
菌体内较少空泡；
出芽率20~~30%；
美蓝染色，酵母菌的死亡率在10%以下。
酵母培养液应具有酵母香味或少许酒味，不能有其他杂味。
原料处理
一、糖蜜处理的目的
糖蜜中含有妨害酵母生长繁殖，影响酵母成品质量的杂质必须先经过处理成棕红色清晰透明，中间无悬浮小粒的液体，才能作发酵的原料，其杂质主要有以下几种：
亚硫酸：
其在糖蜜中所存在之浓度，不能超过０.１２５%二氧化硫。
挥发性有机酸：
主要为甲酸、醋酸、丁酸、丙酸等，不能超过0.3%。
胶体物质和色素：
如所含胶体少于0.008%对于酵母生产亦有影响，而且会影响酵母色泽。
微生物：
在糖蜜储藏期中微生物繁殖很快，在发酵进行中影响酵母繁殖。
其他因素：
如硝酸盐、亚硝酸盐也是有害因素。
加水稀释的作用；
糖蜜进厂一般含糖40—50%，浓度太高，不易澄清，因此需稀释到适当浓度（15—17oBx），进行处理。
加酸的作用：
由于酸中带阳离子和带阴电荷的糖蜜胶体相互作用，胶体凝结形成絮片状物，在澄清桶中沉淀。
加酸能使部分双糖转化成单糖。
加入的硫酸、磷酸和石灰乳作用产生硫酸钙沉淀，而且加硫酸后可释出挥发酸，可在沸腾和通风时驱除掉。
加热同样能使胶体蛋白凝固，便于沉淀，同时加热主要起灭菌作用。
通风的作用；
通入空气可使有害气体氧化驱除，如一氧化氮、二氧化硫、硫化氢等，同时通风可驱除挥发酸，如不通风或通风不足，杂质不能在糖液处理时氧化沉淀，而带到发酵罐中，在发酵通风氧化时，产生的沉淀留在发酵罐中，这种沉渣和酵母的密度相似，因此在离心机分离时沉渣和酵母不能分离，而使酵母带上深灰色。
糖蜜处理的质量与成本要求（质量分析方法及成本核算方式见附录1）：
钙的含量<
0.02%
胶体含量<
0.1%
处理后成本增加<
25%
发酵糖转化率≥85%
发酵糖转化率计算公式为（处理前后样品中糖的测定参见附录3）：
处理后还原糖总量—处理前还原糖总量
糖蜜中发酵糖的转化率=
处理前总糖量—处理前还原糖总量
灰份含量（测定方法参见附录4）
三、糖蜜处理的方法
糖蜜处理方法有许多种，要求学生自行查阅资料，了解相应的处理方法的原理及适用条件，并从中选取一种合适的处理方法对糖蜜进行处理。
以下方法仅供参考。
1．糖蜜处理量的计算：
根据发酵工艺要求的最后发酵体积及发酵液的菌体浓度要求，结合菌体对糖蜜的得率常数，计算所需的总糖量，再乘以放大系数1.2，作为最后需要糖蜜总量。
2．一次处理法
（1）糖蜜加水稀释至15—17oBx。
（2）加0.5%（按糖蜜重量计）工业用浓硫酸和0.5%磷酸（磷酸按45%计）（调pH在2.0至3.0之间）。
（3）加热煮沸
（4）通风0.5—1小时，使温度降到90℃左右。
（5）加石灰乳使pH至4.8—5.1，澄清16—24小时（若沉淀不完全，可用离心去除）。
3、二次处理法（适于含杂质较多的糖蜜）
（2）加0.5%（按糖蜜重量计）工业用浓硫酸和0。
5%磷酸（磷酸按45%计），澄清16—24小时。
清液加热通风后，加石灰乳使pH至4.8--5.1，再澄清16—24小时备用。
4．糖蜜的检测
糖蜜处理前应检测的指标：
锤度（水份）、灰份、总发酵糖、还原糖；
糖蜜处理后应检测的指标：
锤度、灰份、胶体、总还原糖。
（处理方法见附录1。
）
酵母生产工艺流程
在进入酵母生产之前，首先必须熟悉相关的发酵设备的操作规程和注意事项，相关内容见附录2。
一、酵母发酵工艺原理
工艺的基本要求：
1种子质量
APH值
B细胞浓度（以每毫升多少个细胞表示或以OD值表示）
C镜检状况
D种龄
2接种量
3发酵温度
4发酵PH值
5通风比1.5-2.5
6流加时残糖10-13h
7发酵周期
8发酵结束时细胞浓度（以每毫升多少个细胞表示或以OD值表示）
9发酵结束镜检状况
10放罐时残糖<
0.5
11湿酵母（含水75%）对蔗糖的得率>
1.50g湿酵母/g蔗糖
12初步成本计算：
元/吨湿酵母（含水75%）
13.放罐体积7L
把一定量的种子酵母接种到培养液内进行生长繁殖，并连续加入培养液和通入空气控制一定pH和温度，经过8~12小时的通风流加满罐后，发酵成熟送去分离收集酵母。
通风流加法间歇生产酵母的培养过程分为四个时期：
1、酵母的适应期（前发酵期）
酵母菌种加入发酵罐由静止状态到出芽状态需要一个适应的时期，在酵母细胞的原生质内发生复杂的生化过程。
当酵母菌种和培养基混合时，酵母立刻吸收其中的养分，培养基中约50%的糖分可以进入细胞。
在适应期结束时，酵母具备了形成芽体的能力。
2、酵母的繁殖期（生长对数期）
将糖液和营养液继续加入发酵罐，同时提高通气量，酵母的数量迅速增加。
在最初的2~~3小时，酵母出芽旺盛，酵母成族存在，很少见到衰老细胞。
在以后的2~~3小时内，酵母出芽能力仍然旺盛，但有一些细胞已停止出芽（衰老），酵母形态以成双为主，少数以单个存在。
3、酵母的成熟期（稳定期）
在最后的2~~3小时内，酵母的出芽率下降，衰老细胞和幼小的细胞都积聚在培养基内，酵母数量增长放慢，其原因是①酵母密度大，耗氧大，而氧的供应不能满足需要；
②在培养基中某种养分耗竭，酵母的生长受到限制；
③酵母代谢副产物积聚在培养基内，妨碍酵母的生长。
在成熟期，衰老细胞和幼小细胞共存。
衰老细胞中有大的空泡，容易在溶解氧高时发生自溶，所以需要降低通风量。
二、酵母生产工艺流程
1、糖蜜处理
糖蜜→称量→加水稀释→加硫酸、磷酸→加热煮沸→通风→加石灰调pH→澄清16-24小时→备用
2、营养盐配制：
磷酸、硫酸镁、硫酸铵称量→加水溶解→调pH→备用
盐的用量自行查阅资料确定，参考用量为磷酸盐0.05%，硫酸镁0.04%-0.05%，硫酸铵0.3%。
4、菌种扩大培养
首先要求根据接种量确定所需种子液的总体积，在实验操作过程中根据下述工艺扩培的比例关系，或放大，或缩小。
酵母菌种→10ml麦芽汁培养→100ml麦芽汁培养→300ml麦芽汁+300ml糖蜜培养→发酵罐种子
5、发酵罐发酵
糖蜜培养基，通风
↓
种子→发酵罐→糖蜜培养基流加→发酵10~~12小时→成熟→放罐→
→离心分离→酵母洗涤→常温真空干燥→干酵母
三、发酵工艺条件
发酵时间：
10~12小时温度：
30~33℃浓度：
8-10oBx
酸碱度：
PH4.2~4.5残糖（还原糖）：
03~0.5克/100ml
风量：
1.5~2.5m3/m3发酵液/分
四、发酵工艺操作
先在发酵罐内加入最终稀释糖液要求达到基液浓度时所需总水量的60~70%（注意：
要求加入水量盖过温度测量探针）→加入10%糖液（对总量计）+10%营养液（对总量）→实罐灭菌冷却→接种酵母→按表1-1进行通风，流加培养基，每2小时取一次样分析残糖和菌体浓度及镜检（检验方法见附录3）→流加完毕后→继续通风1小时→发酵成熟
表1—1发酵条件控制
项目编号
发酵时间小时
糖液%
营养盐%
风量m3/m3发酵液/分
发酵前0
10
开始发酵1
0~1
5
1
2
1~2
1.5
3
2~3
15
2
4
3~4
12
2~2.5
4~5
2.5
6
5~6
7
6~7
8
7~8
9
8~9
9~10
总计
10小时
100%
发酵流加培养基
（1）~（9）号分别按上表比例量取糖液和营养液混合后分装入250毫升三角瓶中→115℃20分钟灭菌→冷却→备用。
另外，以上表格仅供参考，要求学生自行设计补料量和补料次数，般1-2次，开始投料问题要求盖过发热棒和温度计，大约需要5L。
采样：
从发酵第四小时开始采样，检测酵母细胞数、酵母细胞大小、酵母染色率、发酵液的浓度等项目，做好记录，绘制酵母生长曲线图。
五、酵母的产品质量控制
酵母的质量标准包括酵母的色泽、气味、杂质、水分、发酵力等5个方面，发酵完后，要查阅相关资料，确定产品上述参数的分析方法，并分析酵母产品的质量。
活性干酵母（ActiveDryYeast）是一种具有发酵活性的干生物制剂，实质是；
“没有生命活动但同时又是活着的生物”，它具有发酵能力，含水分低、保藏时间长，运输、使用方便等优点。
广泛地应用于面包、葡萄酒、酒精生产。
（一）、酵母的分离和洗涤目的：
发酵结束后，应在很短时间内把酵母从发酵醪中分离出来，用1—2倍的自来水洗涤分离浓缩的酵母乳2—3次，以除去酵母分泌的代谢产物、杂菌（细菌）和酵母细胞表面吸附的色素等物，从而使分离浓缩的酵母乳成为12—16%浓度的乳白色至乳白黄色。
酵母分离机分离的性能；
转速3000—6000转/分。
（二）、酵母的压榨
经过酵母分离机分离洗涤的酵母乳，为含水分在85%左右的流动性液体，如需要较长时间的储藏，必须使酵母乳压榨成含水分70%的固体酵母，才能便于储藏。
酵母的压榨使用板框过滤机
（三）、酵母的干燥；
1、干酵母干燥
利用真空干燥箱干燥。
2、干酵母质量标准
色泽：
淡黄至淡黄色；
气味：
具有酵母的特殊气味，无败臭味；
杂质：
无异物；
粒度：
颗粒。
酵母片压片工艺流程
一、干酵母片（TabellaeSaccharomycetisSicci）的处方
本品含蛋白质应为干酵母标示量的38%以上。
常用制品：
每片含干酶母
（1）0.3g
（2）0.5g。
[原料与用量]每100片用量
干酵母粉30g
氢氧化铝lg
砂糖18.62g
饴糖0.5g
香料滑石粉1g
滑石粉1g
硬脂酸镁0.08g
二、制法
将饴糖加入砂糖中一起磨粉，过80目筛，加入其它原辅料粉子,混合均匀，过40目筛，然后压片，即得。
（1）干醉母粉的形状对片剂成型有很大影响，对粉末直接压片影响更大，球形酵母弹性大，易产生顶裂现象，所以多选择多边形酵母粉为原料。
（2）本品除可用氢氧化铝、饴糖、砂糖、滑石粉做干粘合剂和助流剂外，还可以选择羧甲基纤维素（CMC）、糖粉、黄糊精做干粘合剂，用氢氧化铝、三硅酸镁或铝镁原粉（药用）做助流剂，进行粉末直接压片。
（3）香料滑石粉配方：
滑石粉1000g
柠檬香精8g
桔子香精8g
香草香精60g
混合均匀，过16目筛备用。
三、单冲压片机的安装与调试
单冲压片机是实验室常用的小型压片机械（图1），构造简单，使用方便，其安装与调试过程如下：
首先装好下冲头，旋紧下冲固定螺丝。
旋动片重调节器，使下冲在较低的部位。
再将模圈装入模板，族紧模圈固定螺丝，然后仔细地将模板固定在机座上（冲头的周边锋利部位容易因碰撞而损坏，故在整个装拆过程中都应小心）。
调节出片调节器，使下冲头上升到恰与模圈相齐平。
再装上冲并旋紧上冲固定螺丝，转动压力调节器，使上冲处在压力低的部位，缓慢地用手摇转压片机的转轮使上冲逐渐下降，观察其是否正好在冲模的中心位置。
如不在中心位置，应上升上冲头（不得将上冲头强制地冲入模孔，更不应使上下冲相接），稍微松动一点模板固定螺丝，移动模板位置直至上冲头恰在模圈模孔的中心位置。
旋紧固定螺丝，装好饲料靴和加料斗，并加入颗粒。
用手转动转轮，如感到不易转动时，不得用力硬转，应小心倒转少许，然后旋动压力调节器使之适当上升减小压力。
称其平均片重，调节片重调节器，使压出的片重与应压片重相等，同时调节压力调节器，使压出的片剂有一定的硬度。
在上述一切操作均较顺利后，开动电动机进行试压，枪查片重和崩解时间，达到要求后方可正式压片。
单冲压片机压片过程如图2
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