微生物工程全解Word下载.docx
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7.葡萄糖效应：
培养基中同时含有葡萄糖和乳糖，微生物先利用葡萄糖、葡萄糖利用完后才利用乳糖，出现两次菌体生长旺盛时期，若加入乳糖酶诱导物，也不产生乳糖酶，而是在葡萄糖利用完后才产生。
8.杂交育种将两个基因型不同的菌株经吻合或接合使遗传物质重新组合，从中分离和筛选具有新性状的菌株。
9.酵母繁殖方式：
酵母为单细胞型真菌，一般以出芽方式生殖，在通常情况下，繁殖体为双倍体，但经过特定条件的诱导，可使其产生单倍体孢子并可出芽产生单倍体繁殖体。
单倍体细胞具α及ε2两种交配型。
两种交配型细胞经其细胞壁上特定的凝聚因子诱导而进行交配，恢复为双倍体；
同一交配型细胞之间，则因细胞壁上凝集因子的存在而不能进行交配。
在生活过程中，酵母细胞还可以形成三倍体、四倍体、多倍体或非整倍体细胞。
一般而言，杂交育种运用了酵母的单双倍生活周期，将不同基因型和相对的交配型的单倍体细胞经诱导杂交而形成二倍体细胞，经筛选便可获得新的遗传性状。
8.但由于原生质体结构与生理活性均未发生改变，故在适宜的条件下，可以再生出细胞壁进行细胞分裂。
9.基因工程技术提高抗生素产量的主要手段
1.增加限速酶的基因拷贝数
2.增加正调节基因,去除负调节基因
3..增加抗性基因的拷贝数
10.抗性基因的作用是避免抗生素产生菌被自身产生的代谢产物所杀灭。
其作用可通过三条途径实现：
抗性基因产物（酶）将抗生素作用的底物加以修饰;
将抗生素的分子结构加以修饰,使其失活;
将抗生素分子排出细胞外。
11.链霉菌产生的次级代谢产物常常是一组结构相似的混合物。
每个化合物称为它的一个组分。
多组分产生的分子基础是因为次级代谢产物的合成酶对底物的选择性不强以及合成途径中分支途径的存在。
12.基因工程的简要步骤：
目的基因的准备；
载体系统；
基因与载体连接；
转化；
重组体的筛选和表达产物的鉴定
第3章培养基
1.碳水化合物：
单糖，双糖，多聚糖（分别为葡萄糖，蔗糖，淀粉等）
除糖份外，含有较多的杂质，其中有些是有用的，但是许多都会对发酵产生不利的影响，需要进行预处理
2.脂肪：
豆油、花生油、菜籽油有机酸、有机醇：
甲醇、乙醇、甘油、山梨醇、有机酸盐（CH3COONa＋2O2→2CO2+H2O+NaOH）烷烃类：
石油产品
3.无机氮源：
如NH4Cl、（NH4）2SO4、NH4NO3、（NH4）3PO3等
速效营养物质：
分子量小，能迅速被菌体吸收利用的物质。
NaNO3+4H2→NH3+2H2O+NaOH
（NH4）2SO3→2NH3+H2SO3
生理酸性物质：
经微生物代谢后，能够产生酸性物质的营养成分。
生理碱性物质：
经微生物代谢后，能够产生碱性物质的营养成分。
4.有机氮源：
黄豆饼粉，玉米浆，花生饼粉，蛋白胨，酵母膏，玉米蛋白粉
迟效营养物质：
分子量大，不能迅速被菌体吸收利用的物质。
酵母膏→B因子→使阻断菌恢复产生抗生菌（利福霉素）的能力
5.能被微生物直接利用，以构成次级代谢产物结构的一部分，而其本身结构没有大的变化，这种物质称为前体。
6.孢子培养基
用途：
制备大量的优质孢子
要求：
营养物质的浓度要低，特别是有机氮源的含量要低
7.种子培养基
供种子发芽、生长繁殖菌丝体
营养成分比较丰富其中氮源、维生素的含量偏高，但总的浓度偏稀，以利菌丝的生长
8.发酵培养基
生长菌丝体，并大量合成代谢产物
营养要求：
①营养物质适当的丰富和完全；
②营养成分的浓度和黏度适中；
③维持较稳定的pH；
④原材料相对稳定；
⑤不影响分离提取过程和产品质量
9.灭菌操作
葡萄糖与含氨基的物质反应形成5－羟甲基糖醛和棕色的类黑精（焦化）对微生物有一定的毒性。
磷酸盐与Ca2+、Mg2+、NH4＋等反应形成沉淀或络合物。
10.各种营养物质的比例：
①速效营养物质与迟效营养物质的配比要满足不同微生物，不同生长阶段和生产阶段的需要。
过高：
有利于生长，过低：
不利于次级代谢产物合成。
②碳氮源比例
斜面便于长孢子；
种子利于长菌丝；
发酵前期利于长菌丝，中后期利于合成和积累目标产物。
此外C/N比等应与环境因素结合考虑，为对溶氧条件较好的设备，对通气较足的配置可采用菌丝较浓的C/N比。
对溶氧较差、通气不足的设备可采用菌丝较稀的C/N比。
③
生理酸碱性物质的比例
酸性抗生素发酵环境一般呈酸性（低于pH7），中性及碱性抗生素发酵环境一般呈中碱性（pH≥7）。
第4章生产菌种的制备和保藏
1.生产菌种的制备过程
菌种→母斜面→子斜面→摇瓶菌丝→种子罐→发酵罐
2.种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。
这些纯种培养物称为种子。
3.一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数。
4.影响孢子质量的因素
培养基：
营养成分、灭菌的质量、斜面培养基的含水量
培养温度和湿度的影响：
菌体生长温度范围宽些28~37℃，孢子形成温度窄27、28℃
培养时间过短：
孢子不成熟；
低温保藏时、易死亡
过长：
菌体代谢活力降低，产量低
保藏时间：
一般不超过一星期。
接种量：
在母斜面上形成单菌落，在子斜面上形成一层菌落
5.种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。
7.双种：
两个种子罐接种到一个发酵罐中。
倒种：
一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。
8.菌种保藏原理：
将微生物菌种保存在不利于微生物活跃生长和代谢的不良环境中，如干燥、低温、缺氧、黑暗、营养饥饿等等，使微生物代谢速率极为缓慢或处于休眠状态。
而一旦恢复所保存菌种生长的正常环境和营养条件，即可获得具有高生理活性和保持原种优良性状的菌种培养物。
9.菌种保藏的方法有多种多样，常用方法简介如下：
斜面低温保藏法、液体石蜡封藏法、沙土管保藏法、甘油低温保存法、真空冷冻干燥保藏法、液氮超低温保藏法
10.真空干燥冷冻保藏法
通过在减压条件下使冻结的细胞悬液中的水分升华，使培养物干燥。
此法是微生物菌种长期保藏的最为有效的方法之一。
冷冻干燥过程中必须使用冷冻保护剂，目前国内常用脱脂乳和蔗糖，国外尚有应用动物血清等的。
大部分微生物菌种可以在冻干状态下保藏10年之久而不丧失活力。
而且经冻干后的菌株无需进行冷冻保藏，便于运输。
11.保藏：
冷冻干燥后的培养物在低于5℃下保藏。
较低的保藏温度（-20～-70℃）对于培养物的长期稳定更好。
最常用的冷冻保护剂是二甲亚砜和甘油.
12.基因工程菌的保藏
由载体质粒等携带的外源DNA片段通常是遗传不稳定的、且很易丢失其外源质粒复制子。
质粒基因通常为宿主细胞生长非必需。
一般情况下当细胞丢失这些质粒时，生长速度会加快。
当培养基中加入抗生素时，抗生素提供了一有利于携带质粒的细胞群体的极有用的生长选择压。
而且在运用基因工程菌进行发酵时，抗生素的加入可帮助维持质粒复制与染色体复制的协调。
建议基因工程菌应保藏在含低浓度选择剂的培养基中。
经过一次解冻的菌株培养物不宜再用来保藏。
13.菌种复壮的方法：
自然选育、淘汰衰退个体、选择合适培养条件
第5章通风与搅拌
1.摄氧率：
r,OUR（oxygenuptakerate）
每小时每立升发酵液中微生物所摄取氧的量。
单位：
mmol（O2）/l·
h
2.呼吸伤：
发酵过程中微生物呼出的CO2分子数量与吸入的氧气分子数量的比值
呼吸商=[CO2]/[O2]=二氧化碳排出速率（mmolCO2/L·
h）/摄氧率（mmolO2/L·
h）
3.氧的传递速率：
OTR（oxygentransferrate）
OTR=KLa×
（C*-CL）
C*:
氧的饱和浓度，CL：
溶解氧浓度
4.体积氧传递系数KLa：
（1/h）
KLa=K×
[（P/V）α×
（Vs）β×
（ηapp）-ω]（经验公式）
P/V:
单位体积发酵所消耗的搅拌功率
Vs：
空气的流速
ηapp:
发酵液的表观黏度，
α，β，ω：
指数，与发酵罐的结构有关
5.空气流量
发酵生产中，一般以通风比来表示空气流量，通常以一分钟内通过单位体积培养液的空气体积比来表示（V／V·
m）。
例如，装有2.5m3培养液的发酵罐，若每分钟通入无菌空气1.25m3，则称为通气比为1:
0.5，或简称通风量为0.5（V／V·
6.呼吸强度：
每小时单位重量的菌体所摄取氧的量。
7.发酵平衡时
摄氧率=氧的传递速率即:
r（OUR）=OTRr=KLa×
（C*-CL）OTR=KLa×
（C*-CL）或KLa=r/（C*-CL）
当r=KLa×
（C*-CL）时溶解氧CL维持一定的数值
当r>
KLa×
（C*-CL）时溶解氧CL降低
当r<
（C*-CL）时溶解氧CL升高
8.搅拌影响溶氧系数主要有3个方面：
①
搅拌把通入的无菌空气打成细小气泡，增加气液接触面积，也增加气液接触时间；
②
搅拌造成的涡流运动使气泡螺旋运动上升，这也增加了气液表面的上升时间，利于氧的溶解；
搅拌所形成的湍流断面减少液膜的厚度，从而减少液膜阻力，增大了KLa。
9.通气对氧的溶解速率的影响
主要表现为气体的表面线速度（V）与溶氧系数（KLa）成正比，由于通气量增大，有利于提高溶氧速率。
但如果加大通气量而不维持原有搅拌功率，则由于增加通气量，使发酵液密度下降，从而导致搅拌功耗下降，而搅拌功耗对提高溶氧的影响将更为显著，因此，对提高溶氧并不十分有效。
第六章发酵工艺的控制
一.微生物发酵类型
根据投料方式：
分批发酵、补料分批发酵、连续发酵。
根据氧的需求：
需氧发酵、厌氧发酵。
根据菌体生长、碳源利用、合成动力学关系：
生长偶联型、部分生长偶联型、非生长偶联型。
1.Ⅰ型，生长产物合成偶联型
产物的形成与生长是平行的，产物合成速度与微生物生长速度呈线性关系，而且生长与营养物的消耗成准定量关系。
产物直接来源于产能的初级代谢。
如酒精、葡萄糖酸、乳酸发酵就属于此类型。
2.Ⅱ型，生长产物合成半偶联类型
产物的合成来自次级代谢，存在着与生长相联和不相联两个部分。
如柠檬酸、谷氨酸、赖氨酸、依康酸、丙酮、丁醇发酵
3.Ⅲ型，生产与产物合成非偶联类型
菌体生长和产物合成完全分开的，产物合成速度与碳源利用也不存在定量关系。
产物的合成是在菌体的浓度达到最高之后才开始的，如青霉素、链霉素、核黄素、糖化酶的发酵。
二.发酵过程中的代谢参数
1.物理参数：
温度、搅拌转数（r/min）、搅拌功率（KW）、粘度（Pa·
s）、浊度（％）、料液流量（L/min）。
罐压（Pa），1kg/cm2=98066.5Pa=0.098MPa表压：
0.02~0.05MPa
空气流量，绝对流量：
L/min相对流量：
L/（L·
min）或VVm
一般控制在0.5～1.0（m3空气/m3发酵液·
min）。
2.化学参数：
pH、溶解氧浓度（ppm或饱和度，％。
通常用饱和百分度表示）、氧化还原电位（mV）、废气中的氧浓度（Pa）、废气中的CO2浓度（%）
营养物质浓度
碳源（g/100ml）：
总糖、还原糖
斐林试剂法测还原糖
氮源（g/100ml）：
总氮、氨基氮：
总氮：
凯氏定氮法
氨基氮：
甲醛法
产物的浓度（µ
g（u）/ml）
折算重量单位：
能抑制50ml标准肉汤的葡萄球菌为一个单位。
1u＝0.6μg青霉素G钠盐
1mg青霉素G钠盐＝1667u
特定单位：
制霉菌素1mg＝3000u
杆菌肽1mg＝55u
酶活力用单位来表示。
每分钟能转化一微克分子底物的酶定量为一个活性单位。
化学法：
滴定法、比色法
产物浓度的测定物理法：
测定旋光度
生物法：
灵敏度高，结果较慢。
杯碟法（抑菌圈↑，抗生素浓度↑）：
抗生素浓度与抑菌圈的半径成一定数学关系
logM=（1/9.21DT）r2+log（C.4πDTH）
C、H、D、T是无法测量的，在实际计算中要设法消去。
一般的消去方法有二剂量法和标准曲线法。
二剂量法：
3.生物参数：
菌丝形态、菌体浓度
三.发酵过程中的代谢变化
1.初级代谢的代谢变化
初级代谢产物是菌体生长繁殖所必需的。
除对数期的微生物外，其他时期的微生物作为发酵种子均会出现延滞期。
延滞期的长短还会受菌体的生理状态和发酵条件的影响。
2.次级代谢产物的代谢变化
菌体生长分三个生理阶段：
菌体生长阶段、产物合成阶段、菌体自溶阶段。
四.各参数对发酵的影响及控制
1.菌体浓度对发酵的影响及控制
a.菌体比生长速率μ：
单位重量菌体每小时新生长出菌体的数量g（干）/g（干）·
h
b.为什么要控制细胞的浓度？
细胞浓度对发酵的影响：
①在一定条件下,发酵产物的产量与菌体浓度成正比dP/dt=Qp×
X
dP/dt:
每小时每立升发酵液的产物量,g/L·
h
Qp：
每小时每克微生物菌体产生的产物量g/g·
X：
菌体浓度g/L
②菌体浓度过大则降低发酵产物的产量
c.影响菌浓的因素：
微生物种类、基质抑制效应、其他环境条件（温度；
pH值；
渗透压；
水分活度）
d.控制菌体浓度的方法
①确定合适的培养基成分与浓度
②通过补料控制菌体的生长
③补加无菌水降低菌体浓度
④改变培养温度控制菌体生长速度
2.基质浓度对发酵的影响及其控制
3.温度对产物合成的影响
最适菌体生长温度和最适产物合成的温度往往不一致。
金色链霉菌：
温度低于30℃，合成金霉素的能力较强。
温度高于35℃，只合成四环素
在发酵后期降低发酵温度
温度的控制:
生产中，温度的控制是采用冷却水通入发酵罐的蛇管或夹套中，热交换保持恒温发酵的
4.pH对发酵的影响及控制
控制pH方法：
流加尿素和氨水
5.溶解氧对发酵的影响及其控制
6.CO2对发酵的影响及控制
7.补料对发酵的影响和控制
作用:
通过补料可以延长产物合成的时间,增加发酵产量
8.泡沫对发酵的影响和控制
培养过程的消泡措施：
机械法，消泡装置。
化学法，消泡剂表面活性剂
9.染菌的控制
五.发酵终点的判断
放罐的原则：
放罐时间有利于提高生产力、降低成本
放罐时间对后提取工艺的影响
第七章发酵动力学
第一节微生物反应过程概论
1.微生物反应过程的主要特征
特点：
多相：
气相、液相和固相
多组分：
培养基中多种营养成分，多种代谢产物，细胞内也具有不同生理功能的大、中、小分子化合物。
非线性：
细胞代谢过程用非线性方程描述。
复杂群体的生命活动
2.发酵动力学是以化学热力学（研究反应的方向）和化学动力学（研究反应的速度）为基础，对发酵过程各种物质的变化进行描述。
第二节微生物反应动力学的描述方法
2.4反应动力学描述的简化
动力学是对细胞群体的动力学行为的描述。
不考虑细胞之间的差别，而是取性质上的平均值，在此基础上建立的模型称为确定论模型，如果考虑每个细胞之间的差别，则建立的模型为概率论模型。
如果在考虑细胞组成变化的基础上建立的模型，称为结构模型，一般选取RNA、DNA、糖类及蛋白含量做为过程变量。
菌体视为单组分的模型为非结构模型，通过物料平衡建立超经验或半经验的关联模型。
2.5发酵动力学中常用的几个术语
1.得率（或产率，转化率，Y）：
包括生长得率（Yx/s）和产物得率（Yp/s）。
得率是指被消耗的物质和所合成产物之间的量的关系。
生长得率：
是指每消耗1g（或mol）基质（一般指碳源）所产生的菌体重（g），即Yx/s=ΔX／-ΔS。
产物得率：
是指每消耗1g（或mol）基质所合成的产物g数（或mol数）。
这里消耗的基质是指被微生物实际利用掉的基质数量，即投入的基数减去残留的基质量（S0-S）。
转化率：
往往是指投入的原料与合成产物数量之比。
基质比消耗速率（g（或mo1）／g菌体·
h）：
系指每克菌体在一小时内消耗营养物质的量。
它表示细胞对营养物质利用的速率或效率。
在比较不同微生物的发酵效率上这个参数很有用。
产物比生产速率（g（或mo1）／g菌体·
系指每克菌体在一小时内合成产物的量，它表示细胞合成产物的速度或能力，可以作为判断微生物合成代谢产物的效率。
发酵周期：
实验周期是指接种开始至培养结束放罐这段时间。
2.容量产率指的是单位时间内单位反应器容积的产物，是工业发酵的技术经济指标。
产物形成曲线的切线表示的是最大容量产率；
连接原点和产物形成曲线终点的连线．其斜率表示的是总的平均容量产率。
3.研究发酵动力学的步骤
各种理化参数→相互关系和变化规律→建立各种数学模型→验证
第三节发酵动力学
3.2分批发酵法
1.分批培养过程中细菌生长曲线
可分为调整期、对数生长期、平衡期和衰亡期四个阶段。
研究细胞的代谢和遗传宜采用生长最旺盛的对数生长期细胞。
在发酵工业生产中，使用的种子应处于对数生长期。
（1）.延滞期。
解决途径:
一是尽量选择处于指数生长期的种子。
二是扩大接种量。
（2）.指数生长期
细胞特点：
生长速率仅与微生物本身的比生长速率μ及发酵液中的生物量浓度X（g/L）相关。
限制性营养物质的浓度S、最大比生长速率μm、底物相关常数Ks、比生长速率μ
如果各种营养物质均大大过量的话，则μ=μm，这时便是指数生长期
（3）.稳定期
生物量增加十分缓慢
当微生物赖以生存的培养基中存在多种营养物质时，微生物将优先利用其易于代谢的营养物质
微生物的很多代谢产物，尤其是次级代谢产物，是在进入稳定期后才大量合成和分泌的。
（4）.死亡期
微生物细胞的死亡呈指数比率增加。
在发酵工业生产中．在进入死亡期之前应及时将发酵液放罐处理
2.分批发酵产物形成的动力学
（1）.生产连动型产物形成（I型发酵）
对于生产连动型的产物来说，调整发酵工艺参数，使微生物保持高的比生长速率，对于快速获得产物、缩短发酵周期十分有利。
（2）.部分生长连动型产物形成（II型发酵）
产物的形成只与发酵液中的菌体浓度有关。
对于这一类型发酵，只要能保证获得足够高浓度的生物量，就可以获得高速率的产物合成。
（3）.非生长连动型产物形成（Ⅲ型发酵）
3.3分批补料培养技术
定义：
分批补料培养技术，就是指在分批培养伊始，投入较低浓度的底物，然后在发酵过程中，当微生物开始消耗底物后，再以某种方式向培养系统中补加一定的物料，使培养基中的底物浓度在较长时间内保持在一定范围内，以维持微生物的生长和产物的形成，并避免不利因素的产生，从而达到提高容积产量、产物浓度和产物得率的目的。
3.4连续培养技术（开放系统）
1.定义：
所谓连续培养，是指以一定的速率向发酵液中添加新鲜培养基的同时，以相同的速率流出培养液，从而使发酵罐内的液量维持恒定不变，使培养物在近似恒定状态下生长的培养方法。
2.均匀混合的生物反应器
在这种反应器中，培养基经搅拌而混合均匀，反应器中的各部分培养基间不存在浓度梯度。
这种连续培养装置又可进一步分为恒化器和恒浊器两种。
（1）恒化器是一种设法使培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率条件下进行生长繁殖的一种连续培养装置。
（2）恒浊器在恒浊器中的微生物，始终能以最高生长速率进行生长
3.单级连续发酵的设计原则
对于正确设计一种连续发酵方案，重要的是选择适宜的稀释度D
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