脑缺血再灌注动物模型的制备及评判文档格式.docx

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动物模型;

大鼠

　　[ABSTRACT]Objective:

Toinvestigatetheapplicationofthreekindsofcerebralischemiareperfusionanimalmodelaccordingtothedegreeofinjury.Methods:

Thebilateralcommoncarotidarteryocclusion（BCCO）,cerebralmiddlecerebralarteryocclusion（MCAO）bystringfasteningmethod,globalischemia（GI）byfourarteryocclusionwereusedtoestablishcerebralischemiareperfusionanimalmodel.ThedegreeofbraininjurywasevaluatedthroughtheexpressionofMAP2inhippocampalCA1regionandtheMorriswatermaze.Results:

TheresultoftheexpressionofMAP2indicatedtheinjuryofGIgroupwasthemostsevere,andthedamageofBCCOgroupwasthemostwiththenormalgroup,thebehaviorchangeofreperfusionwasthesignificantintheMCAOandGIgroups.Conclusion:

Thethreeanimalmodelsshouldbeappliedindifferentresearches.TheBCCOmodelcouldbeusedinpreventionofmildischemia.TheMCAOmodelcouldbeusedinthechangeofcerebralfunctionandthedrugevaluation.TheGImodelcouldbeusedinrecoveryaftercerebralischemia.

　　[KEYWORDS]Cerebralischemia;

Cerebralinjury;

　Animal;

Rat

　　脑血管疾病是世界上严峻危害人类健康的三大疾病之一,发病率已达到104.53/10万。

缺血性脑血管疾病（ICVD）发病率有逐年增高趋势,死亡率可达56.6%～80%,即便存活,也留有严峻的后遗症阻碍生活质量。

因此,成立适合的动物脑缺血及缺血再灌注模型来模拟人类脑血管疾病并对之进行研究,是深切研究其病变发生、进展和预后的基础，也是当前神经科学的热点课题之一。

　　大鼠具有脑血管解剖结构和功能与人类相近似、品种品系相对标准、良好的种内纯合性等特点，目前大多利用大鼠成立脑缺血再灌模型，可是对各类模型的制作成效未见文献报导。

本文采纳双侧颈总动脉阻断再灌模型（BCCO）、线栓法大脑中动脉脑缺血再灌模型（MCAO）、四血管法全脑缺血再灌模型（GI）等3种经常使用的局灶性脑缺血再灌动物模型，观看不同脑损伤情形下的形态学改变，并评判其行为学，旨在探讨不同模型的适应性。

　　1材料与方式

　　实验动物及分组

　　健康雄性Wistar大鼠，6月龄，体重（200±

50）g，经Morris水迷宫挑选后，分为正常对照组（Normal），双侧颈总动脉结扎20min再灌注组（BCCO），线栓法大脑中动脉脑缺血再灌模型组（MCAO），四血管法全脑缺血再灌模型组（GI），每组6只。

　　Morris水迷宫测试

　　Morris水迷宫测试程序采纳定位航行实验：

天天4次，共3d，均在10:

00am～5:

00pm之间完成。

将大鼠头朝池壁轻轻放入水中，计时动物自入水至找到平台时刻为暗藏期，同时观看搜索站台的轨迹。

记录大鼠后8次测试的暗藏期，以平均暗藏期的90%区间作为挑选学习经历功能正常大鼠的标准。

　　动物模型制备

　　BCCO模型：

大鼠用2%的戊巴比妥mL/100g）麻醉，颈正中切口逐层切开皮肤及皮下组织，分离胸锁乳突肌，切断二腹肌前腹，暴露颈总动脉（commoncarotidartery，CCA），颈内动脉（internalcarotidartery，ICA）和颈外动脉（externalcarotidartery，ECA），分离双侧颈总动脉约1cm，用动脉夹夹闭20min后，解除动脉夹，恢复脑血流，再灌7d，在处死前做Morris水迷宫测试。

　　MCAO模型：

参照Longa等[1]和罗勇等[2]报导的方式,采纳经颈内动脉线栓法制备大鼠右边MCAO致局灶性永久性脑缺血模型。

大鼠用2%的戊巴比妥mL/100g）麻醉，仰卧位固定，颈正中切口，暴露右边CCA、ICA和ECA，探查ECA在颈部发出第1分支（甲状颈干）处，在其远心端约cm处结扎并切断ECA，确保ECA残端长度很多于cm;

结扎并切断ECA与ICA之间的交通支。

用动脉夹临时阻断CCA及ICA血流，用眼科剪于ECA残端作一纵行小切口，用直径约mm的尼龙线，烧灼头端使其成为直径约为mm的线栓，将线栓从右边ECA残端插入ICA;

轻轻牵拉ECA残端，使其与ICA成一条直线，调整线栓角度，使线栓弧度水平向外，与颈前正中线呈45度水平向外的夹角，移去夹闭ICA的动脉夹，轻轻将线栓送入颅内。

从CCA分叉处送入ICA约～cm时通常可遇阻力，大鼠呼吸、心跳突然加速，部份大鼠尿失禁，据此作为大脑中动脉起始处栓塞成功的标志。

栓塞成功后，用丝线结扎ECA残端，移去夹闭CCA的蛙心夹，观看无活动性出血后关闭切口。

缺血20min后，将栓线抽至颈内动脉起始部恢复脑血流，再灌7d，在处死前做Morris水迷宫测试。

　　GI模型：

参考Pulsinelli方式，采纳改良的四血管夹闭方式制备四血管阻塞全脑缺血模型[3，4]。

大鼠用2%的戊巴比妥mL/100g）麻醉，仰卧位固定，颈正中切口，暴露CCA和与之伴行的神经,钝性分离出CCA，用棉线环CCA成1cm的线环。

双侧线环彼此交叉埋于皮下，缝合切口。

大鼠转移到立体定位仪上,俯卧。

头向下倾斜30度固定。

剪去头颈部的毛,消毒。

在枕骨下沿背正中切口,分离肌肉,找到第1颈椎后弓上的横突孔,用电凝针插入2～3mm，灼断孔中的椎动脉,使之永久性阻塞。

电凝完毕,缝合切口，大鼠放回饲养笼中,让其自然苏醒,禁食留宿,自由饮水。

以上手术24h后,大鼠在清醒状态下仰卧固定,从头打开颈部切口,用动脉夹夹闭双侧颈总动脉,使大鼠脑部供血完全阻断,大鼠挣扎数秒后于30～60s内昏迷,解除固定,可见大鼠四肢上举,翻正反射消失,痛觉反映消失,双侧瞳孔散大,眼球呈灰白色,躯体可呈角弓反张。

缺血20min后，解除动脉夹，恢复脑血流，再灌7d，在处死前做Morris水迷宫测试。

　　组织制备

　　用2%戊巴比妥钠mL/50g体重）腹腔注射麻醉后，迅速开胸暴露心脏，灌注固定后取脑，后固定2～4h后，别离置于15%和30%蔗糖梯度溶液中直至标本沉底。

冰冻切片机作持续冠状切片，取海马和齿状回互包平面，片厚30μm，用小鼠抗MAP2单克隆抗体作ABC免疫组织化学染色，用正常羊血清朝替一抗作阴性对照。

　　统计学处置

　　用HPIAS高清楚度彩色病理图像测量系统测定海马CA1区神经元胞浆MAP2反映产物的OD值，并减去同一张切片的背底OD值，即矫正的OD值（COD值），每例标本检测3张切片，每张切片检测3个视野。

实验数据用SPSS统计软件分析，采纳单因素方差分析比较样本均数。

　　2结果

　　水迷宫检测

　　正常大鼠定位航行实验暗藏期稳固，在5s左右可找到平台。

BCCO组大鼠搜索策略以直线式搜索策略为主，其暗藏期与正常组比较略有增加，且波动较大，可是无统计学意义（P&

gt;

。

MCAO组和GI组均有暗藏期增加，与正常对照组有统计学意义（P&

lt;

，其搜索策略转变成边缘式和随机式为主。

见表1。

表1各组动物Morris水迷宫暗藏期注：

各组比较F=，P&

;

*与Normal组比较P&

　　海马MAP2免疫组织化学染色

　　正常组海马CA1区MAP2要紧在神经元树突表达，突起滑腻而且完整（图1A）;

而核周质弱表达。

BCCO组可观看到海马CA1区神经元树突MAP2的表达增加，突起断裂不完整，粗细不一致（图1B）;

GI组突起表达加倍紊乱，可观看到螺旋样变（图1C）;

MCAO组突起表达有断裂，不完整（图1D）。

统计分析说明，MAP2表达COD值在各组之间不同有显著性（F=，P&

，见表2。

表2大鼠海马CA3区MAP2免疫染色COD值注：

*与Normal组比较P&

　　3讨论

　　缺血性脑血管病的实验动物模型是研究缺血性脑损伤和脑爱惜必不可少的工具，有关大鼠局灶性脑缺血再灌注模型已成立多种方式。

DeReuck等[5]的研究提示，脑血管储蓄功能的下降致使全脑代谢储蓄消耗是血管性痴呆发生的可能机制;

动物空间经历能力下降，是由于血管结扎致使局部脑血流下降而阻碍与学习经历有关的结构。

孙莉等[6]采纳双侧颈总动脉结扎模型发觉，结扎致使实验动物水迷宫测试成绩下降，而且这种下降随结扎天数的延长而加大。

赵宪林等[7]用这种方式结扎时刻长达4月，结果发觉30只结扎鼠中有25只痴呆鼠，呈轻、中度痴呆别离是9只、13只。

本实验也说明，在双侧颈总动脉结扎再灌后，形态学和行为学方面有所改变。

　　大鼠全脑缺血再灌注模型，它的解剖学基础在于大鼠腹侧的脊髓动脉有必然向脑干的返支，四血管闭塞期间能够维持脑干的血液供给，使得大鼠在一按时刻内能够存活下来。

由于全脑缺血对大鼠的脑组织损伤严峻，而再灌注，不仅没有使损伤的脑组织得以恢复，反而由于细胞内Ca2+超载、一氧化氮和氧自由基等作用使损伤程度进一步加深[8]。

本实验也证明全脑缺血后引发脑形态学和学习经历能力的严峻损伤，是研究血管性痴呆的良好模型。

　　大鼠中动脉（MCA）阻塞为临床上缺血性脑血管病的多发部位，故MCA阻断模型被普遍应用于脑梗塞的研究。

其中，血管内直接插线闭塞法成立大鼠局灶性脑缺血/再灌注模型具有不开颅、损伤小、操作简便、不需特殊设备、缺血区部位较恒定、可准确操纵缺血和再灌注时刻、易操纵局部条件、全身阻碍小等优势，被普遍用于脑缺血/再灌注的研究中。

目前对该模型有较多的研究,刘亢丁等[9]以为该模型大鼠体重应操纵在250～300g;

马常升等[10]发觉,当大鼠体重为190～239g时,宜选择插线的直径为mm,体重为239～300g时,插线直径宜为mm;

徐佳等[11]研究模型栓线插入的深度以为,要取得成动的模型栓线插入深度最少要达到1.65cm。

与全脑缺血模型相较,MCAO模型可形成特定部位的脑梗死并进行再灌注,对全身阻碍较小,与人脑梗死的发病情形更相似,因此目前应用更为普遍。

其中,栓线法因其缺血部位恒定、能准确操纵缺血后再灌注时刻等优势,适用于脑缺血及再灌注多方面的研究。

　　通过对各组再灌后的行为学检测，分析发觉3组之间行为学有明显区别，关于在行为学的基础上结合MAP2染色来评判脑缺血再灌注模型的脑损伤程度。

观看发觉，不同模型缺血坏死程度不同，结合行为学评分咱们以为，不同的缺血再灌模型的应用范围应有所偏重，不同的脑缺血模型的应用不同，双侧缺血模型可用于轻微缺血的预防，线栓法应用于局部损伤后脑功能改变及医治药物评判，全脑缺血再灌注动物模型是研究缺血损伤后恢复相对理想的模型，关于慢性脑缺血、脑缺血的药物及一些特殊领域的研究具有较高的价值。

　　各类脑缺血动物模型的制备方式各有优缺点，研究者应依如实验目的及研究方向做出相应的选择。

目前,脑缺血动物模型的研究在制备方式、实验条件的操纵等方面都取得了专门大进展,而且转基因小鼠的显现,超声、MR、MRA、介入等新技术的进展及其在模型制备中的应用,在专门大程度上增进了脑缺血模型的研究。

但还有很多问题尚待解决,如如何更好地操纵脑梗死灶的部位和范围,更准确地操纵缺血和再灌注时刻等。

脑缺血动物模型的日趋完善,将为人们更深刻熟悉ICVD发病机制,研究新的医治计谋等提供更准确的信息。

【参考文献】

　　1LongaEZ,WeinsteinPR,CarlsonS,etal.Reversiblemiddlecerebralarteryocclusionwithoutcraniectomyinrats[J].Stroke,1989,20

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　　2罗勇,董为伟.Wistar大鼠插线法局灶性脑缺血/再灌注模型的实验研究[J].重庆医科大学学报,2002,27

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　　3PulsinelliWA,BrierleyJB.Anewmodelofbilateralhemisphericischemiaintheunanesthetizedrat[J].Stroke，1979，10（3）:

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　　4GongL,GaoTM,LiX，etal.EnhancementinactivitiesoflargeconductancecalciumactivatedpotassiumchannelsinCA1pyramidalneuronsofrathippocampusaftertransientforebrainischemia[J].BrainRes,3000，884（12）:

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　　5DeReuckJ,DecooD,HasenbroekxMC，etal.Acetazolamidevasoreactivityinvasculardementia:

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　　6孙莉，吴江，王守春，等.慢性前脑缺血大鼠学习、经历功能的研究[J].中风与神经疾病杂志，2002,19

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　　7赵宪林，李东培，方秀斌,等.血管性痴呆大鼠海马神经元超微结构的研究[J].解剖科学进展，2000,6

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　　8张国瑾,赵增荣.国外脑血管疾病研究进展[M].北京:

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　　9刘亢丁,苏志强,李毅平,等.实验性局灶性脑缺血再灌注动物模型的改良及评判[J].中风与神经疾病杂志,1997,14

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　　10马常升,马文领,戴维国,等.插线法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的研究[J].解剖学杂志,1999,22（3）:

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　　11佳,葛林宝,徐明曙,等.大鼠栓线法MACO模型中插入深度的研究[J].上海实验动物科学,2002,22（4）:

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