8超薄切片与半薄切片.docx
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8超薄切片与半薄切片
第8讲半薄/超薄切片技术
取材→固定→脱水→渗透→包埋→聚合→修块→切片→染色
背景：
肉眼
光学显微镜
透射电镜
分辨率
0.2mm
0.2µm
0.2nm
应用范围
可观察头发丝、双面刀刀刃的厚度
可观察细胞的结构（最大有效倍数:
1000）
可观察细胞内的结构,分辨DNA、蛋白质等生物大分子、单个金属原子（放大倍数可达百万倍）
观察半薄切片
观察超薄切片
⏹现有的透射电镜生物制品制备技术分为两类：
一类是透射电镜的基本制备技术，包括超薄切片和负染色法；
另一类是生物制品特殊技术，包括冷冻蚀刻法、冰冻割断术、电镜细胞化学术、免疫电镜术、电镜放射自显影技术、X线微区分析技术等。
基本概念
一、生物样品制备技术的重要性
1、决定电镜图像分辨率的两个因素
1）电镜本身的分辨本领
2）样品的结构和反差，而样品的结构与反差在很大程度取决于样品制备技术
2、电镜样品应具备的基本条件
1）样品必须彻底干燥；
2）样品要进行提高反差处理
2）样品要进行提高反差处理
4）样品耐受电子束的轰击
5）充分保存好生物样品的超微结构
二、TEM样品制备技术分类
1、超薄切片技术（普通）
2、冷冻超薄切片技术
3、冷冻置换和低温包埋技术
4、金属投影技术
5、表面复型技术
6、冷冻（断裂）蚀刻及复型技术
7、免疫电镜技术
8、电镜细胞化学技术7、8、9是TEM，SEM共有
9、电镜放射自显影技术
三、超薄切片技术概述
1、超薄切片
★样品厚度在10～100nm之间的切片，超薄切片TEM专用
石蜡切片h=10m（5~50m）
2、制作超薄切片的必要性
1）增加电子透射能力
2）电镜的场深大，切片太厚，上下结构重
叠,使得图像不清楚
3）减少色差
4）减少样品对电子的吸收
3、对超薄切片的要求
⑴细胞的细微结构保存良好，没有明显的物质凝聚、丢失、添加等人工效应
⑵切片厚度500～700Å为宜,小于1000Å
太薄：
高，反差低
太厚：
低，反差好，结构重叠，电子甚至
不能穿透
⑶切片应耐电子束的强烈照射，不变形，升华
⑷切片能够适当被染色，保证一定的反差
⑸切片均匀，无皱褶、刀痕，无染色剂或其他
化学物质的沉淀
普通超薄切片技术：
1、取材二、固定三、脱水四、渗透与包埋五、超薄切片六、电子染色
一、取材
1、含义：
指从生物体上取下要观察的组织块。
注意：
由于水解酶的作用可引起细胞自溶
2、取材操作规则:
快,小,冷,准,稳,轻（防损伤）
⑴快：
动作迅速,快取,投入固定液
⑵小：
样品体积小,动1mm3,植宽1，长3～4mm
⑶冷：
0～4℃
⑷准：
取的部位准，有代表性、目的性
⑸轻：
操作轻巧，避免拉、锯、压
A、按样品类别分为：
⑴动物材料
麻醉→解剖→戊二醛预固定（0～4℃，2％～5％）
在预冷的玻板上细切（1mm3）→戊二醛前固定
（1～3h）→漂洗（10～30min）→1％锇酸后固定
（1～2h）
⑵植物材料
叶片宽1，长3～4，有时需脱蜡
根茎果实1mm3
⑶单细胞：
洗去有机成分→固定→预包埋→切块
B、按取材地点分为：
⑴野外取材：
冰壶
⑵实验室室内取材
1.2取材方法
材料放在洁净的韧性较大的纸上→滴上预冷的固定液→用刀片将组织切下并修小
→用牙签或镊子将组织块移至盛有预冷的固定液的小瓶中。
植物材料的取材可以先切成薄片，经适当固定后再切成小方块继续固定。
二、固定
（一）固定的基本知识
1、概念：
用化学或物理方法迅速将细胞、组织杀死,同时把从细胞间的联系到细胞器的分子结构等全部组织的活体形态、精细结构及其组成真实的保存下来.
2、常用的固定方法
⏹化学方法：
锇酸（OsO4）,戊二醛（C5H8O2）,甲醛（HCHO），高锰酸钾KMnO4、重铬酸钾、丙烯醛
⏹物理方法：
冷冻，干燥，高温
3、固定的目的
⑴把细胞中的动态系统定格，要求生命过程立即停止,细胞和它周围组织中的半液体内含物立即凝固而不分解,接近细胞有机体的生活状态
⑵防止以后的制备过程中丢失或添加成分
⑶使其在电镜下有良好的电子反差
4、固定的标准
细胞内膜结构线条清晰连续不断，细胞基质无明显溶泡和颗粒凝集
5、固定液的作用：
1）组成：
固定液：
固定剂＋缓冲液
2）作用：
⑴破坏细胞的酶活性系统
⑵稳定细胞物质成分，并保存之
⑶接近细胞生活状态的渗透压,使细胞不收缩或膨胀
⑷在组分的分子之间建立交联，提供骨架稳定细胞器的空间构型
⑸提供一定的电子反差
（二）常用的固定剂
1、常用、理想固定剂应具备的条件
1）渗透力强，穿透速度快，能迅速达到组织块的各部位，立即杀死细胞，以尽量减小死后变化
2）稳定细胞成分和结构，使各种结构成分凝固或变性，以保证后续的各种处理中物质不溶解、不丢失
3）使细胞不变形，保持各种结构生活时形状，不产生人工假象，以保证电镜图像的真实性。
4）能保存一定的酶活性,以供细胞化学的测定
5）最好提供一定的反差,并有防腐作用
2、理想固定剂
1）锇酸（OsO4）
优点：
⑴几乎和细胞内所有成分发生化学结合
⑵对氮具有较强亲和力，对含有蛋白质的细胞结构固定作用良好
⑶可保存脂肪,形成脂肪-锇复合物
⑷Z=76，增加膜的反差
⑸对磷脂蛋白、核蛋白保护很好
锇酸缺点：
⑴不能固定糖元、碳水化合物、核酸，对微管固定效果差
⑵酶的钝化剂，不能用于细胞化学研究
⑶分子量大,渗透能力差，要求组织块小
⑷固定时间不宜过长
⑸可与乙醇、醛类氧化还原反应生成沉积
⑹有挥发性、剧毒
2）戊二醛（C5H8O2）
优点：
⑴固定迅速，样品块可以大于1mm3
⑵能保存糖元、蛋白质、核蛋白，核酸，尤其对微
管，内质网等固定效果最好，对细胞内结构有较
强的亲和力
⑶可长时间固定（<7天），适于野外取材
⑷不易使酶失活，适于细胞化学研究
⑸不挥发，但容易经皮肤吸收，对呼吸道粘膜有
刺激性
缺点：
⑴不保存脂肪
⑵无电子染色作用
⑶对缓冲液的要求严格
双固定法：
指用戊二醛对样品前固定，漂洗后使用锇酸对样品进行后固定，这种使用两种化学试剂分别前后对样品进行固定的方法称为双固定法。
3）甲醛（HCHO）：
甲醛＋戊二醛
滲透速度快、固定迅速，对酶活性的保护优于
戊二醛，经济方便
4）高锰酸钾（KMnO4）
磷脂蛋白，对神经髓脂质很好，细胞膜性结
构、叶绿素固定良好。
（3）甲醛-Formaldehyde
优点：
渗透组织的能力比戊二醛强，对于致密组织（种子）固定作用好；
细胞精细结构保存质量不如戊二醛，但酶活性的保存优于戊二醛；
缺点：
不能较好的固定细胞基质，脱水后大部分细胞基质将丢失；
＊常用多聚甲醛－戊二醛的混合固定液。
（4）高锰酸钾
优点：
强氧化剂，较好固定脂蛋白;
对神经髓鞘、叶绿体及其他各种膜结构的研究均可作为固定剂；
只用于某些常用固定剂难以固定的植物和酵母样品，且一般不需要用锇酸后固定.
（3）缓冲液和附加剂
1、缓冲液：
一种仿效细胞外液成分，对细胞富有生理保护功能的溶液
2、缓冲液主要作用
⑴维持稳定的pH值
⑵提供适当的渗透压
⑶提供适当的离子成分使样品不抽提，不沉淀
3、附加剂：
▪调节渗透压，NaCL,CaCL2，蔗糖，葡萄糖
4.常用缓冲液
（1）磷酸盐缓冲液：
储备A液（0.2M）:
磷酸氢二钠
（Na2HPO4.2H2O）35.61g加水定容1000ml
储备B液（0.2M）:
磷酸二氢钠
（NaH2PO4.2H2O）27.6g加水定容1000ml
0.1M磷酸缓冲液（PBS），由储备A液（0.2M）和储备B液（0.2M）按上表比例合成，然后稀释定容到100ml。
优点：
对细胞无毒害，便宜，易于大量配置
缺点：
易产生沉淀，不稳定，易受到细菌污染
⑵．巴比妥盐
对锇酸适用，戊二醛不能，不长期保存
⑶．二钾胂酸盐
可长期保存，有毒，有臭味
（4）、固定
1、固定液的配制
2、固定的方法：
1）按固定液的成分划分为：
⑴单固定：
戊二醛或锇酸单次固定1～3小时
⑵双固定：
前固定（戊），漂洗，后固定（锇）
⑶多重固定：
用三种以上的固定剂对样品进行固定
2）按固定方式分为：
a.浸泡固定b.体外固定
c.原位固定d.灌流固定
3、固定注意事项：
1）固定液的浓度:
戊二醛1-5%,锇酸1-3%
浓度低→固定时间长→细胞质的抽提,组织肿胀
浓度高→易损细胞微结构,OsO4或KMnO4可使蛋白质分子氧化而断裂
2）固定液的渗透压：
渗透压低→细胞器或整个细胞膨胀
渗透压高→细胞收缩
3）pH值：
植物6.8～7.1,动7.2～7.4
4）固定的温度：
0～4℃
但低温对细胞微丝、微管有害
5）组织块的大小：
0.5～1mm3
6）固定液的用量，一般为组织块的500倍
三、漂洗、脱水
3.1漂洗
目的:
组织固定后脱水前的漂洗:
清除残留固定剂,减小固定剂和脱水剂之间的反应，避免沉淀物干扰超微结构的观察.
双重固定中,在锇酸固定前的漂洗:
避免锇酸与戊二醛反应生成细小而致密的饿沉淀，破坏细胞结构.
3.2脱水
目的：
将组织内的游离水彻底清除,保证包埋介质完全渗入组织内部。
方法：
用一种和水及包埋剂均能相混溶的液体来取代水,常用的脱水剂是乙醇和丙酮。
三脱水（dehydrate）
1.定义：
用适当的有机溶剂取代组织和细胞中的
游离态水分的过程。
2.脱水的原因：
⑴包埋时一般使用非水溶性包埋剂，为了更好的包埋样品，提高包埋质量必须对样品脱水；
⑵湿样品反差低、必须干燥；
⑶含水样品在高真空下容易被破坏。
3.脱水的原则：
逐级梯度脱水（80%及以前4℃）
30％→50％→70％→80％→90％→95％（每次5~15min）→100％（2~3次，每次15min）→100％环氧丙烷（乙醇脱水时必须的一步骤,15min）
4.常用的脱水剂：
乙醇、丙酮、甲醇、乙二醇、聚乙二醇、环氧丙烷、包埋剂的单体。
5.脱水注意事项:
⑴脱水要彻底
⑵更换液体动作要迅速
⑶脱水时间不宜过长
⑷固定后的样品要充分漂洗
附加步骤：
块染（BlockStaining）
在脱水前或脱水时对组织块进行的染色叫块染。
（在切成片之后的染色可称为“片染”）
脱水前染色：
双固定→漂洗→0.5％~4%的醋酸双氧铀染色，1h,4℃→脱水
脱水时染色：
脱水至70％乙醇→硝酸铅的70％乙醇饱和溶液中2h,4℃→70％乙醇漂洗→继续脱水
四、渗透与包埋
目的：
使包埋剂逐步渗透到组织细胞内部,以便与
细胞外的包埋剂同时聚合，以保证切出优质
的超薄切片。
步骤：
渗透，包埋，聚合
（一）、渗透（Infiltrate）
渗透：
用另一种溶液或混合液逐渐取代组织内的脱水剂（或前介质），使细胞内外所有的空隙
被渗透液填充。
脱水剂的比例↘包埋剂↗→纯包埋剂
脱水剂:
包埋剂＝3:
1→1:
1→1:
3
→纯包埋剂
渗透时间表（小时）
脱水剂：
包埋剂
动物材料
植物材料
体外培养细胞
3：
1
1
1
0.5
1：
1
1～4
1～12
0.5~1
1：
3
1～2
2～12
0.5
二、
升级会员 