发酵技术专题复习资料Word格式.docx

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1928年，Fleming发现了青霉素，开创了好气性发酵工程，建立了通风搅拌技术。

1940年，Florery和Chain：

碘黄青霉基中得到了纯品青霉素，继而放线菌链霉素，金、土、卡那、红、新、庆大.等相继发现。

1984年达9000多种。

1945年，抗生素工业（发酵工业正式兴起1956年，Watson和Crick发现DNA双螺旋结构，为微生物遗传学及育种技术的研究带来极大发展。

1956年，日本的士下祝郎利用发酵法制造出了Glu。

至今22种氨基酸用发酵法生产，其中18种直接发酵，4种用酶转化法生产。

发酵工业的工程技术发展史第一个转折点微生物纯种分离培养技术建立自然发酵时期：

知其然而不知其所以然，如厌气性酒类，好气性醋。

微生物纯种分离培养技术，开创了人为控制微生物时代，减少了腐败现象，实现了无菌操作；

发明了简便的密封式发酵罐；

人工控制条件，提高发酵效率，稳定产品质量。

第二个转折点通气搅拌的好氧发酵工程技术建立（深层液态发酵）20世纪40年代，由于二战暴发，刺激了抗生素发酵工业的兴起，成功建立起深层通气培养法及整套工艺，包括向发酵罐内通入大量无菌空气、通过搅拌使空气分布均匀、培养基的灭菌和无菌接种、通氧量、pH、培养物供给等均已解决，刺激了有机酸、酶制剂、维生素、激素等的大规模生产。

第三个转折点人工诱变育种和代谢控制发酵工程技术的建立以动态生物化学和遗传学为基础，将微生物进行人工诱变，选育高产菌株，实现有选择地大量生产目的产物。

该技术先在氨基酸生产上获得成功，而后在核苷酸、有机酸、抗生素等其它产品中得到应用。

第四个转折点发酵动力学、发酵的连续化自动化工程技术的建立发酵罐的大型化、多样化、连续化和自动化方面有了极大发展。

发酵过程的基本参数包括T、Ph、罐压、溶O2、Eh、空气流量、泡沫、CO2含量等均可自动记录和控制。

（在线测试探头等）第五个转折点微生物生物合成和化学反应合成相结合工程技术的建立针对单纯发酵法的缺陷，利用发酵法生产前体，用化学合成法得到终产品或反之。

如Amyno法生产酱油。

发酵食品的渊源及其文化内涵发酵是一门古老而又现代的技术，结合了神秘的传统、古老的文化和变化无穷的生物技术。

文化底蕴深厚、产品形态多种多样、技术手段推陈出新、理论研究和技术创新永无止境。

最早的发酵产品据记载起源与5000BC。

据记载最早的发酵食品应是酒类，通常认为是wine,因为大自然中具备了野生果类和酵母菌，条件适宜情况下即行发酵。

在神话传说中亦有猿猴酿酒之说。

由于自然界中资源的多样性（F、M），便有了多种多样的发酵食品。

4000BCBeer，至古埃及即出现了麦芽糖化。

5000-6000BCwine、黄酒、白酒、Cheese4000BCBeer，至古埃及即出现了麦芽糖化。

（酱油、调味品）白酒：

农业社会粮食节余，生霉、发酵、蒸馏而得古老的发酵食品自产生以来，长时间内停留在自然酿造阶段。

即知其然而不知其所以然，通常以经验掌握。

由于节气、环境的变化即决定了产品的成败，因此食品酿造甚至被赋予很多神秘色彩，甚至出现了对曲的顶礼膜拜，与一些祭祀活动也连起来。

由于其发酵的机理一直未能充分揭示，因此发酵技术也迟迟未能进一步发扬光大和合理调控。

直到巴斯德、科赫等人的工作成果推动了微生物发酵及工艺调控的推陈出新。

难以解决的实际问题尽管如此，食品发酵与酿造仍然有许多难以解决的实际问题，例如许多工程方面的研究经验还不足，还没有归纳为系统的理论，许多产品的发酵过程中的问题尚难以解决，很多问题有待研究探讨。

丝状真菌的发酵（霉菌、放线菌）：

由于没有完善的理论指导，因而还没有满意的设计和放大方法，而霉菌、放线菌又是发酵工业中占重要地位的菌类。

连续发酵的理论虽然研究很多，但许多生产实际问题仍然未能解决，由于菌种的突变、微生物的复杂性和多样性以及试验工艺条件的不稳定性和局限性等问题，除了酵母、啤酒、酒精、丙酮、丁醇、葡萄糖酸的发酵和活性淀粉的处理采用连续发酵外，大规模生产上极少采用。

发酵与酿造的研究对象1、按产业部门来分：

酿酒工业传统酿造工业有机酸发酵工业酶制剂发酵工业：

淀粉酶中95%以上为霉菌、细菌淀粉酶氨基酸发酵工业功能性食品生产工业：

低聚糖、真菌多糖、红曲等食品添加剂生产工业：

黄原胶、海藻糖菌体制造工业：

单细胞蛋白、酵母等维生素发酵工业：

Vc、VB2、VB12核苷酸发酵工业：

ATP、IMP、GMP2、按产品性质来分：

代谢产物发酵：

产品包括初级代谢产物、中间代谢产物、次级代谢产物。

1、初级代谢产物：

微生物生长不同阶段产生不同的代谢产物，对数生长期形成的产物往往是细胞自身生长所必需的，如氨基酸、核苷酸、蛋白质、脂类、糖类等。

2、次级代谢产物：

微生物细胞生长进入稳定期，有些微生物合成的在对数生长期不能合成的、对细胞代谢没有明显意义但具有明显优势的化合物。

酶制剂发酵：

1894年，日本高峰（Takanin）利用霉菌高峰淀粉E（胞内或胞外）E分离提取E制剂固定化酶（中国的曲酒可以看成是复合酶制剂的生产）。

生物转化发酵：

生物转化是指利用生物细胞中的一种或多种酶，作用于一些化合物的特定部位（基团），使它转变成结构相类似但具有更大经济价值化合物的生化反应。

其特点是：

反应特异性强。

如：

LACLASCP、藻类、食用菌类（冬虫夏草、蜜环菌、灵芝、茯苓、香菇、云芝）与化学工业相比，食品发酵与酿造的特点：

安全简单原料广泛反应专一代谢多样易受污染菌种选育我国发酵食品的工艺特色：

1、采用多种原料，且多以淀粉质原料为主。

2、多菌种混合发酵，且多以霉菌为主的微生物群。

（国外多以细菌、乳酸菌）3、工艺复杂、多用曲：

董酒生产制的曲用72味中药。

曲（Koji）4、多为固态发酵：

醅、醪食品发酵与酿造与现代生物技术的关系生物技术的四大技术体系之一发酵技术的两大核心：

生物催化剂（其最有效、稳定、方便的生物催化剂形式是整体生物细胞，目前最广泛采用的是微生物细胞）生物反应系统现代生物技术即应用生物体（微生物、动物细胞、植物细胞）或其组成部分（细胞器、酶），在最适合条件下，生产有价值的产物，或进行有益过程的技术。

它是一门涉及分子生物学、细胞生物学、遗传学、微生物学、化学、物理学、工程学的多学科、综合性的科学技术。

生物技术是靠基因工程、细胞工程、发酵工程、酶工程和生化工程这五大技术体系支撑起来的。

现代发酵技术已超越了微生物工程的范畴。

由此可见，发酵工程（包括酶工程）与细胞工程、基因工程谁也离不开谁，发酵工程（包括酶工程）需要基因工程、细胞工程为他提供最良好的生物细胞（或酶），而基因工程、细胞工程得到的最良好的细胞（或酶）必须要经过发酵工程（包括酶工程）才能实现其价值。

若采用的生物催化剂是酶、休止细胞、死细胞或固定化细胞，则反应系统比较简单，只需考虑温度、PH等容易控制的条件。

若采用的是生物活细胞，则要为该细胞提供最优生长、最优形成产物的可控系统和环境，使温度、pH、通气、搅拌、罐压、溶解氧、二氧化碳含量等物理、化学条件得到有效的维持和控制，从而使该生物细胞呈现出最佳的性能，生成和积累大量产物。

这就充分反映出生化工程是发酵工程转化为生产力必不可少的重要环节。

发酵与酿造工程中常用技术微生物技术制片染色和显微技术、无菌操作技术、纯种分离和培养技术、合成培养基技术、育种技术、深层液态发酵技术、菌种保藏技术化学技术产物分离技术、提取精制技术食品发酵与酿造发展趋势及研究热点利用基因工程技术有选择地创造物种（新型微生物资源）。

固定化酶和固定化细胞的生产和应用。

生物传感器的研究与设计，发展发酵与酿造的过程控制技术。

生物代谢产物的分离提取和纯化技术大规模的连续发酵工艺的建设和优化。

1972年，美国Berg和Jackson等人将猿猴病毒基因组SV40DNA、噬菌体的Gene及Ecoli半乳糖探纵子在体外重组获得成功。

人们的第一反应是禁止。

（可能为自然界创造一个不可预知的危险物种，导致人类灭顶之灾。

）安全可靠性（分子医学：

基因治疗免疫缺陷症1990，1991人类基因组）现代发酵工程与发酵工业发酵已经从过去简单的生产酒精类饮料、生产醋酸和发酵面包发展到今天成为生物工程的一个极其重要的分支，成为一个包括了微生物学、化学工程、基因工程、细胞工程、机械工程和计算机软硬件工程的一个多学科工程。

现代发酵工程不但生产酒精类饮料、醋酸和面包，而且生产胰岛素、干扰素、生长激素、抗生素和疫苗等多种医疗保健药物，生产天然杀虫剂、细菌肥料和微生物除草剂等农用生产资料，在化学工业上生产氨基酸、香料、生物高分子、酶以及维生素和单细胞蛋白等。

发酵工程主要指在最适发酵条件下，发酵罐中大量培养细胞和生产代谢产物的工艺技术

（1）有严格的无菌生长环境：

包括发酵开始前采用高温高压对发酵原料和发酵罐以及各种连接管道进行灭菌的技术；

在发酵过程中不断向发酵罐中通入干燥无菌空气的空气过滤技术；

（2）在发酵过程中根据细胞生长要求控制加料速度的计算机控制技术；

（3）种子培养和生产培养的不同的工艺技术。

（4）在进行任何大规模工业发酵前，必须在实验室规模的小发酵罐进行大量的实验，得到产物形成的动力学模型，并根据这个模型设计中试的发酵要求，最后从中试数据再设计更大规模生产的动力学模型。

（5）由于生物反应的复杂性，在从实验室到中试，从中试到大规模生产过程中会出现许多问题，这就是发酵工程工艺放大问题。

是指利用生物的生命活动产生的酶，无机或有机原料进行酶加工，获得产品的工业。

发酵工业的范围1、以微生物细胞为产物的发酵工业2、以微生物代谢产物为产品的发酵工业3、以微生物酶为产品的发酵工业4、生物转化或修饰化合物的发酵工业5、微生物废水处理和其他微生物产物：

微生物细胞，酶，药物活性物质，特殊化学物质和食品添加剂生产微生物细胞物质定义：

是以获得具有多种用途的微生物菌体细胞为目的的产品的发酵工业，包括单细胞的酵母和藻类、担子菌，生物防治的苏云金杆菌以及人、畜防治疾病用的疫苗等。

特点：

细胞的生长与产物积累成平行关系，生长速率最大时期也是产物合成速率最高阶段，生长稳定期产量最高。

微生物酶发酵酶的特点：

易于工业化生产，便于改善工艺提高产量。

分类：

胞内酶和胞外酶生物合成特点：

需要诱导作用，或遭受阻遏、抑制等调控作用的影响，在菌种选育、培养基配制以及发酵条件等方面需给予注意。

微生物代谢产物发酵包括初级代谢产物、中间代谢产物和次级代谢产物。

对数生长期形成的产物是细胞自身生长所必需的，称为初级代谢产物或中间代谢产物。

各种次级代谢产物都是在微生物生长缓慢或停止生长时期即稳定期所产生的，来自于中间代谢产物和初级代谢产物。

微生物的生物转化定义：

是利用生物细胞对一些化合物某一特定部位（基团）的作用，使它转变成结构相类似但具有更在经济价值的化合物。

最终产物是由微生物细胞的酶或酶系对底物某一特定部位进行化学反应而形成的。

微生物特殊机能的利用利用微生物消除环境污染利用微生物发酵保持生态平衡微生物湿法冶金利用基因工程菌株开拓发酵工程新领域。

发酵工业的特征发酵过程中离不开微生物的作用1、发酵原料的选择及预处理2、微生物菌种的选育及扩大培养3、发酵设备选择及工艺条件控制：

常温、常压。

种子扩大培养和发酵采用不同的工艺。

4、发酵产物的分离提取5、发酵废物的回收和利用

（1）发酵所用的原料通常以淀粉、糖蜜或其他农副产品为主，只要加入少量的有机和无机氮源就可进行反应。

可以利用废水和废物等作为发酵的原料进行生物资源的改造和更新。

（2）微生物菌种是进行发酵的根本因素，通过变异和菌种选育，可以获得高产的优良菌株并使生产设备得到充分利用，也可以因此获得按常规方法难以生产的产品。

（3）发酵过程一般来说都是在常温常压下进行的生物化学反应，反应安全，要求条件简单。

（4）发酵对杂菌的污染的防治至关重要。

反应必需在无菌条件下进行。

（5）由于生物体本身所具有的反应机制，能够专一地和高度选择性地对某些较为复杂的化合物进行特定部位地氧化、还原等化学转化反应，也可以产生比较复杂的高分子化合物（6）发酵过程是通过生物体的自动调节方式来完成的，反应的专一性强，因而可以得到较为单一的代谢产物。

（7）工业发酵与其他工业相比，投资少，见效快，并可以取得较显著的经济效益。

（8）除利用微生物外，还可以用动植物细胞和酶，也可以用人工构建的遗传工程菌进行反应。

发酵方法的类别与流程1）类别：

根据对氧的需要区分：

厌氧和有氧发酵根据培养基物理性状区分：

液体和固体发酵根据从微生物生长特性区分：

分批发酵和连续发酵工业发酵步骤和工艺流程

（1）用作培养菌种及扩大生产的发酵罐的培养基的配制

（2）培养基、发酵罐以及辅助设备的消毒灭菌（3）将已培养好的有活性的纯菌株以一定量转接到发酵罐中（4）将接种到发酵罐中的菌株控制在最适条件下生长并形成代谢产物（5）将产物抽提并进行精制，以得到合格的产品（6）回收或处理发酵过程中产生的废物和废水发酵原料的预处理原料不同处理方法也有所差异。

1.淀粉利用前需变成糊精或葡萄糖法：

酸水解（高压、耐酸）、酶水解法2.糖蜜加热杀菌和用水冲稀，也可加酸处理后再补充无机盐3.碳氢化合物：

石油脱蜡一定馏分的石油经冷却脱蜡而获得的凝固点在-10的油，加入适量无机盐进行接种发酵菌种斜面培养菌种：

已有的优良生产菌种和选育的新菌种方法：

一般都是由保存于冷冻管及砂土管或冰箱中的斜面菌种开始，在正式使用前要先转接到新鲜斜面培养基上活化后，再用于种子扩大培养。

种子扩大培养扩大培养的方法可以根据需要采用固体培养或液体培养两级不同方式。

固体种子扩大培养一般采用传统的制曲工艺，一般先用克氏瓶或匣子瓶进行扩大，再转接到曲盘扩大培养。

需氧微生物：

将克氏瓶表面培养的菌种接到装有液体培养基的三角瓶中，在摇庆上振荡培养。

厌氧微生物：

将有菌种的试管斜面或克氏瓶转接到三角瓶液体培养基中静置培养。

微生物发酵和控制发酵方式可分为固体发酵和液体发酵两种。

固体发酵：

适合于传统发酵工艺及乡镇企业用来生产比较简单的产品。

液体深层发酵：

适合于大规模工业化生产。

影响发酵的因素很多，如温度、pH、通风、搅拌、罐压力等等，必须适当地控制影响发酵的各种条件，掌握发酵的动态，并进行杂菌的检查和产物测定，使整个发酵过程顺利进行。

发酵产物的分离提取利用菌体：

离心沉淀或板框压滤法使菌体与醪液分开，也可以用喷雾干燥法直接做成粉剂。

酒精发酵醪蒸馏塔蒸馏；

抗菌素及有机酸根据产物的不同特性，采用离子交换树脂吸附处理、脱色过滤、减压浓缩等方法提取精制。

获得的产物都要按照有关部门制定的国家标准进行质量检验和性能测定，符合要求后才为合格产品。

菌种选育与保存专题1、发酵工程工业生产水平的三个决定要素：

1、生产菌种的性能2、发酵和提取工艺3、生产设备2、菌种筛选分离的的具体步骤：

1、样品采集2、增值分离3、纯种分离4、生产性能测定3、筛选工作程序：

调查研究实验设计采样（大自然中）第一次增值培养与平板分离（保留原种斜面）第二次增值培养与平板分离（保留原种斜面）定量与半定量初筛（1瓶1株）第三次平板分离（保留原种斜面）复筛（第三次菌种保藏）（若不纯）第四次平板分离（保留原种斜面）在复筛（初步工艺条件摸索种子培养）较优菌种（1株3至5瓶）毒理试验与保藏，探究生产性能。

4、筛选因素：

菌的营养特性（发酵培养基容易得到并便宜）、生长温度、稳定性、产物得率与在培养液中的浓度、对设备的适应性、产物容易从培养液中分离（36是高产菌特征）5、菌种采集：

根据菌种的营养类型（在枯木中找纤维素菌）、根据菌种的生理特性（火山岩中找高温菌）6、富集（GN）（enrichment）：

是在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种，以利分离到所需的菌株。

7、富集方法：

提供有利条件（温度、氧气、pH、糖盐）、加入某种抗生素（分离真菌+链霉素、分离细菌放线菌+制霉菌素）PS:

所需菌型的生长会改变培养基性质、移植几次后放固体培养基中培养、移植时间在菌种确定优势时8、选择培养基法：

固定营养成分，从而抑制杂菌。

例:

0.2%果胶作为唯一碳源选择果胶酶菌9、固体平板生化分离法特点：

1、大量杂菌初筛方法2、根据生理特性与代谢产物分3、效率高10、透明圈;

适用于：

培养基浑浊、分离水解酶。

效果:

目的菌则会出现透明圈，透明圈大小反应生产能力（不一定准确）。

例：

pH89琼脂培养基（含不溶性蛋白）碱性蛋白酶芽孢杆菌。

碳酸钙机酸菌、美兰聚赖氨酸产生菌11、变色圈：

加入显色剂或指示剂。

果胶酶菌0.2%刚果红。

降脂菌中性红（6.88.0，红黄）呈红色；

降脂菌罗丹明B，荧光圈12、生长圈：

生产氨基酸、核苷酸、维生素菌。

方法：

将待检菌涂布于高浓度工具菌（营养缺陷型）并缺少所需营养物的平板上进行培养。

若某菌株能合成平板所需的营养物，在该菌株的菌落周围便会形成一个混浊的生长圈。

例如：

产嘌呤菌嘌呤缺陷型细菌13、抑菌圈：

抗生素菌。

将待检菌涂布于高浓度工具菌（抗生素敏感菌）平板上进行培养14、随机分离法：

各种营养成分成为限制因子的培养基，使用聚合符合型生长因子限制成分，避免使用容易同化的C与N，确定辅因子，加入pH缓冲剂15、抗生素菌分离：

抑菌圈法、扩散法、生物自显影法。

抗肿瘤药物产生菌：

利用微生物筛选作用于DNA的抗肿瘤药物的方法。

酶抑制剂产生菌：

与病理有关。

生长因子产生菌：

生长圈。

16、营养缺陷型菌株的筛选：

影印培养法（一系列培养皿的相同位置上能出现相同菌落的一种接种培养方法,分别用完全培养基和基本培养基，滤纸影印）、夹层培养法（完全小的，基本大的）、逐个检出法17、抗性突变株的筛选：

梯度培养皿法（梯度一边有药品，一边没有，看位置）18、筛选抗噬菌体突变株：

噬菌体涂布法19、温度敏感突变型（TS菌株）筛选（高温敏感型、低温敏感型）（非必须基因突变温度敏感菌，必须基因突变温度敏感菌）许可温度（permissivetemperature）（GN）保持原来正常性状的温度。

非许可温度（non-permissivetemperature）（GN）显现突变型性状的温度。

.一个在CM和MM非许可温度下，一个在MM许可温度下。

20、抗反馈调节突变株：

抗结构类似物突变的方法21、组成型突变株的筛选：

抑菌圈22、菌种的选育（GN）：

应用微生物遗传和变异理论，用人工方法（或自然）造成变异，再经过筛选以得到人们所需菌种的过程。

目的:

不断提高发酵工业产品的产量和质量，增加新产品和适应工艺改革的要求。

方向：

“吃粗粮”、耐高温、生长快、代谢旺、产量高、质量好、无毒性。

23、选育方法：

自然选种、诱变育种、杂交育种、原生质融合、基因工程育种24、自然选育（GN）在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程。

自发突变（GN）某些微生物在没有人工参与下所发生的那些突变，但这决不意味着这种突变是没有原因的。

原因包括多因素低剂量（短波辐射、低剂量诱变物质，微生物代谢产物诱变）的诱变效应和互变异构效应，劣多良少，25、自然选育步骤：

单孢子悬浮液稀释平板分离挑选些许进行生产能力测验复筛生产能力测定26、自然选育优点：

简单易行；

缺点：

效率低、进展慢，很难使生产水平大幅度提高。

27、诱变育种（GN）（主流方法）：

人为地利用物理或化学等因素，使诱变对象细胞内的遗传物质发生变化，引起突变，并通过筛选获得符合要求的变异菌株的一种育种方法。

28、诱变育种步骤：

菌种采集（敏感、变异幅度大，初性状好；

最好选用已经生产选育、变异出良好性状的自发突变菌；

）单孢子悬浮液（生理状态、生长状态一致，在对数期，because要细胞均匀接触诱变剂、避免杂菌）诱变剂的选择（物理诱变：

紫外线（260nm，胸腺嘧啶二聚体），xr射线、快中子（无电荷）等。

化学诱变：

硫酸二乙酯（DES）、亚硝基胍（NTG）（诱发营养缺陷型突变，在浓度为30ug/ml、温度为28C和时间为60min的条件下进行处理）、亚硝酸（NA）（在pH4.5的醋酸缓冲液中使用，脱去碱基中的氨基）、氮芥（NM）（极易挥发油状，使用时与碳酸氢钠作用，造成染色体畸形）、羟胺、ICR类等）。

剂量：

诱变效应呈山峰状。

诱变处理（单一诱变，复合诱变（多种先后，同种先后，多种同时）中间培养（表型迟延现象、生理性、分离性；

诱变后的一小时内必须进行新的蛋白质合成，这个变异才有效，完全培养基中培养）突变分离初筛与复筛（产量最高的1-2个菌株）（第一次1诱变至100-50-5，第二次5诱变至40-50-5）生产能力测定29、杂交育种：

转导：

（transduction）（GN）由噬菌体将一个细胞的基因传递给另一细胞的过程。

它是细菌之间传递遗传物质的方式之一。

其具体含义是指一个细胞的DNA或RNA通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中。

转化：

（GN）质粒转移。

接合（GN）：

两个细胞融合接触，遗传物质互换。

30、放线菌杂交育种（基因重组似细菌，育种方法似霉菌）：

1、在放线菌杂交重组过程中，异核体的作用不大。

只有经部分染色体转移途径形成的部分结合子，才是亲本间遗传信息传递和基因重组的关键。

2、放线菌的杂交只发生在具有一定感受态菌株之间31、接合（GN）由两个基因型不同的直接亲本菌丝体混合培养，体细胞间接触和融合，使两个遗传类型不一致的细胞核，在双方细胞增殖过程中部分染色体进行转移和遗传信息交换。

部分结合子：

部分与全部接合32、杂合系：

呈线性、不封闭、染色体末端具有串联的重复体。

在复制过程中，开口的环状染色体上基因再一次交换，由于位置不同而成为杂