生物样品的制备与提取文档格式.docx
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③固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性；
④各种物理性质：
如分子的大小、穿膜的能力、带电的情况、等电点、在电场中的行为、离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数等；
⑤其它化学性质，如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性；
⑥对其他生物分子的特殊亲和力；
⑦在细胞内的定位等。
生物大分子和生物小分子的分离纯化方法多种多样，主要是利用它们之间在物理、化学及生物特异性的差异，如分子的大小、形状、酸碱性、溶解性、溶解度、极性、电荷和与其它分子的亲和性等。
各种方法的基本原理基本上可以归纳为两个方面：
一是利用混合物中几个组分分配系数的差异，把它们分配到两个或几个相中，如盐析、有机溶剂沉淀、层析和结晶等；
二是将混合物置于某一物相（大多数是液相）中，通过物理力场的作用，使各组分分配于不同的区域，从而达到分离的目的，如电泳、离心、超滤等。
目前纯化蛋白质等生物大分子的关键技术是电泳、色谱和高速与超速离心。
由于生物大分子不能加热熔化和汽化，因而所能分配的物相只限于固相和液相，在此两相之间交替进行分离纯化。
在实际工作中往往要综合运用多种方法，才能制备出高纯度的生物大分子。
制备物的均一性（即纯度）的鉴定，通常只采用一种方法是不够的，必须同时采用2～3种不同的纯度鉴定法才能确定。
如蛋白质和酶制成品纯度的鉴定最常用的方法是：
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦电泳，如能再用高效液相色谱（HPLC）和毛细管电泳（CE）进行联合鉴定则更为理想，必要时再做N－末端氨基酸残基的分析鉴定。
核酸的纯度鉴定通常采用琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳，但最方便的还是紫外吸收法，即测定样品在pH7.0时260nm与280nm的吸光度（A260和A280），从A260/A280的比值即可判断核酸样品的纯度。
2.2生物材料的选择
生物材料来源于动物、植物和微生物及其代谢产物。
应尽可能选择选择含量高、来源丰富、制备工艺简单、成本低的生物材料，但往往这几方面的要求不能同时具备，含量丰富但来源困难，或含量来源较理想，但材料的分离纯化方法繁琐，流程很长，反倒不如含量低些但易于获得纯品的材料，由此可见，必须根据具体情况，抓住主要矛盾决定取舍。
植物材料的选材应注意季节性、地理位置和生长环境等。
动物材料的选材要注意其年龄、性别、营养状况、遗传素质和生理状态等。
动物在饥饿时，脂类和糖类含量相对减少，有利于生物大分子的提取分离。
微生物材料的选材要注意菌种的代数和培养基成分等之间的差异，例如在微生物的对数期，酶和核酸的含量较高，可获得较高的产量。
2.3激光捕获显微切割技术
激光捕获显微切割技术（laser-capturemicrodissection，LCM）是在显微状态或显微镜直视下通过显微操作系统对欲选取的材料（组织、细胞群、细胞、细胞内组分或染色体区带等）进行切割、分离，获取均匀性很好的目标细胞，以用于后续研究的显微分离收集技术。
2.3.1LCM的特点
（1）LCM可以从任何组织中快速、精准地分离出纯的特异细胞及细胞群。
每次粘附的直径在7.5～30µ
m可调，既能分离任何形状的单细胞，又能分离大面积组织。
因此利用显微切割技术可以分离收集到像核仁和包涵体及染色体特异区带这样细微的对象。
（2）利用显微切割技术是在组织细胞或染色体的原位取材，因此所取材料的定位清楚，所研究对象的历史背景明确。
例如何杰金氏淋巴瘤中瘤组织成分多样，特征性的瘤细胞（R-S细胞及其变异型）占细胞成分的2%左右，且呈散在性分布,如果常规地用组织匀浆的方式从组织中提取蛋白质或核酸，则既包含了来自瘤细胞的成分，又包含了来自淋巴细胞、浆细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、组织细胞等多种非瘤细胞的成分，这样所提的蛋白质或核酸来自何种细胞并不清楚，而如果用显微切割技术则可以选择我们需要的细胞，以使研究对象的历史背景明确。
（3）显微切割技术可以保证所取材料一定层次上的同质性。
虽然流式细胞技术也是一种强有力的同质细胞分离技术，但是它只能处理悬浮液中的细胞，不可能用于各种处于固态的组织中的同质细胞的分离；
而且，流式细胞技术需要各种特殊的标记物才能完成分离。
因此，可以认为，LCM是对流式细胞技术的一种重要的完善和补充。
由于LCM的取材具有高度的均匀性，因此与从其它制备来源的样品细胞所得到的研究结果相比，其获取的数据更为精确和具有代表性。
（4）LCM适用于H&
E染色、免疫组化、荧光标记等多种染色方式，可以与多种分子生物学、免疫学及病理学技术结合使用。
LCM分离的特异细胞或组织可以进行测序、PCR、QPCR、生物芯片、质谱、二维凝胶电泳等分析。
因此，在蛋白质组学、基因组学以及分子生物学的研究中，LCM日益受到重视，已成为许多深入研究工作中起始的重要一步。
2.3.2LCM的仪器与基本操作（略）
2.3.3LCM的实例
激光捕获显微切割的材料可以是以各种方式贴附于固相支持物上的各种组织细胞成分，如石蜡组织切片、冰冻组织切片、细胞铺片、细胞爬片、细胞甩片、培养细胞、常规制备的染色体等。
2.4细胞的破碎
除了某些细胞外的多肽激素和某些蛋白质与酶以外，对于细胞内或多细胞生物组织中的各种生物分子的分离纯化，都需要事先将细胞和组织破碎，使其充分释放到溶液中，并不丢失生物活性。
不同的生物体或同一生物体的不同部位的组织，其细胞破碎的难易不一，使用的方法也不相同，如动物脏器的细胞膜较脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有较坚固的纤维素、半纤维素组成的细胞壁，要采取专门的细胞破碎方法。
（表2.1）
表2.1各种细胞破碎方法的应用范围
细胞破碎方法
剧烈程度
应用对象
机械法
研磨法
剧烈
固体组织细胞、微生物细胞
组织捣碎法（匀浆法）
物理法
反复冻融法
温和
细菌细胞、组织培养细胞
超声波处理法
悬浮细胞
压榨法
微生物细胞、含有细胞壁的细胞
冷热交替法
细菌细胞或病毒
化学与生物化学方法
自溶法
组织及各种细胞
溶胀法
血细胞、组织培养细胞
酶解法
植物细胞、细菌细胞、真菌细胞
2.5生物大分子的提取
“提取”是在分离纯化之前将经过预处理或破碎的细胞置于溶剂中，使被分离的生物大分子充分地释放到溶剂中，并尽可能保持原来的天然状态不丢失生物活性的过程。
这一过程是将目的产物与细胞中其它化合物和生物大分子分离，即由固相转入液相，或从细胞内的生理状况转入外界特定的溶液中。
影响提取的因素主要有：
目的产物在提取的溶剂中溶解度的大小；
由固相扩散到液相的难易；
溶剂的pH值和提取时间等。
一种物质在某一溶剂中溶解度的大小与该物质的分子结构及使用的溶剂的理化性质有关。
一般地说，极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性溶剂；
碱性物质易溶于酸性溶剂，酸性物质易溶于碱性溶剂；
温度升高，溶解度加大；
远离等电点的pH值，溶解度增加。
提取时所选择的条件应有利于目的产物溶解度的增加和保持其生物活性。
2.5.1水溶液提取
蛋白质和酶的提取一般以水溶液为主。
稀盐溶液和缓冲液对蛋白质的稳定性好，溶解度大，是提取蛋白质和酶最常用的溶剂。
用水溶液提取生物大分子应注意的几个主要影响因素是：
（1）盐浓度（即离子强度）：
离子强度对生物大分子的溶解度有极大的影响，有些物质，如DNA-蛋白复合物，在高离子强度下溶解度增加，而另一些物质，如RNA-蛋白复合物，在低离子强度下溶解度增加，在高离子强度下溶解度减小。
绝大多数蛋白质和酶，在低离子强度的溶液中都有较大的溶解度，如在纯水中加入少量中性盐，蛋白质的溶解度比在纯水时大大增加，称为“盐溶”现象。
但中性盐的浓度增加至一定时，蛋白质的溶解度又逐渐下降，直至沉淀析出，称为“盐析”现象。
（2）pH值：
蛋白质、酶与核酸的溶解度和稳定性与pH值有关。
过酸、过碱均应尽量避免，一般控制在pH=6～8范围内，提取溶剂的pH应在蛋白质和酶的稳定范围内，通常选择偏离等电点的两侧。
碱性蛋白质选在偏酸一侧，酸性蛋白质选在偏碱的一侧，以增加蛋白质的溶解度，提高提取效果。
例如胰蛋白酶为碱性蛋白质，常用稀酸提取，而肌肉甘油醛-3-磷酸脱氢酶属酸性蛋白质，则常用稀碱来提取。
（3）温度：
为防止变性和降解，制备具有活性的蛋白质和酶，提取时一般在0℃～5℃的低温操作。
但少数对温度耐受力强的蛋白质和酶，可提高温度使杂蛋白变性，有利于提取和下一步的纯化。
（4）防止蛋白酶或核酸酶的降解作用：
在提取蛋白质、酶和核酸时，常常受自身存在的蛋白酶或核酸酶的降解作用而导致实验的失败。
为防止这一现象的发生，常常采用加入抑制剂或调节提取液的pH、离子强度或极性等方法使这些水解酶失去活性，防止它们对欲提纯的蛋白质、酶及核酸的降解作用。
例如在提取DNA时加入EDTA络合DNAase活化所必须的Mg++。
（5）搅拌与氧化：
搅拌能促使被提取物的溶解，一般采用温和搅拌为宜，速度太快容易产生大量泡沫，增大了与空气的接触面，会引起酶等物质的变性失活。
2.5.2有机溶剂提取
一些和脂类结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶难溶于水、稀盐、稀酸、或稀碱中，常用不同比例的有机溶剂提取。
常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、正丁酮等，这些溶剂可以与水互溶或部分互溶，同时具有亲水性和亲脂性，其中正丁醇在0℃时在水中的溶解度为10.5％，40℃时为6.6％，同时又用具有较强的亲脂性，因此常用来提取与脂结合较牢或含非极性侧链较多的蛋白质、酶和脂类。
例如植物种子中的玉蜀黍蛋白、麸蛋白，常用70％～80％的乙醇提取，动物组织中一些线粒体及微粒上的酶常用丁醇提取。
有些蛋白质和酶既溶于稀酸、稀碱，又能溶于含有一定比例的有机溶剂的水溶液中，在这种情况下，采用稀的有机溶液提取常常可以防止水解酶的破坏，并兼有除去杂质提高纯化效果的作用。
例如，胰岛素可溶于稀酸、稀碱和稀醇溶液，但在组织中与其共存的糜蛋白酶对胰岛素有极高的水解活性，因而采用6.8％乙醇溶液并用草酸调溶液的pH为2.5～3.0，进行提取，这样就从下面三个方面抑制了糜蛋白酶的水解活性：
①6.8％的乙醇可以使糜蛋白酶暂时失活；
②草酸可以除去激活糜蛋白酶的Ca++；
③选用pH2.5～3.0，是糜蛋白酶不宜作用的pH值。
以上条件对胰岛素的溶解和稳定性都没有影响，却可除去一部分在稀醇与稀酸中不溶解的杂蛋白。
2.6生物大分子的分离与纯化
由于生物体的组成成分是如此复杂，数千种乃至上万种生物分子又处于同一体系中，因此不可能有一个适合于各类分子的固定的分离程序，但多数分离工作关键部分的基本手段是相同的。
为了避免盲目性，节省实验探索时间，要认真参考和借鉴前人的经验，少走弯路。
常用的分离纯化方法和技术有：
离心法、沉淀法（包括：
盐析、有机溶剂沉淀、选择性沉淀等）、色谱法、等电聚焦制备电泳法等。
本节以介绍离心法和沉淀法为主。
2.6.1离心技术
离心技术（CentrifugeTechnique）是根据颗粒在作匀速圆周运动时受到一个外向的离心力的行为而发展起来的一种分离技术。
这项技术应用很广，诸如分离出化学反应后的沉淀物，天然的生物大分子、无机物、有机物，在生物化学以及其它的生物学领域常用来收集细胞、细胞器及生物大分子物质。
离心技术具有比较温和、分离样品量大等特点，在生物学、医学、制药工业等方面是最常用的技术之一。
2.6.1.1离心力与相对离心力
离心作用是根据在一定角度速度下作圆周运动的任何物体都受到一个向外的离心力进行的。
离心力（centrifugalforce，Fc）等于离心加速度ω2X与颗粒质量m的乘积，即：
Fc=mω2X，其中ω是旋转角速度，以弧度秒-1为单位；
X是颗粒离开旋转中心的距离，以cm为单位；
m是质量，以克为单位。
由于各种离心机转子的半径或者离心管至旋转轴中心的距离不同，离心力因而会发生变化，因此在文献中常用相对离心力（relativecentrifugalforce，RCF）或“数字×
g”表示离心力，只要RCF值不变，一个样品可以在不同的离心机上获得相同的结果。
RCF就是实际离心场转化为重力加速度的倍数。
RCF=F离心力/F重力=mω2X/mg=ω2X/g=1.118×
10－5·
n·
X
式中X为离心转子的半径距离，以cm为单位；
g为地球重力加速度（980cmsec-2）；
n为转子每分钟的转数（rpm）。
一般情况下，低速离心转速以rmin-1表示，高速离心以重力加速度g表示。
在计算颗粒的相对离心力时，应注意离心管与中心轴之间的距离，即离心半径r（cm）的长度，离心管所处的位置不同，沉降颗粒所承受的离心力也不同。
因此，超速离心常用重力加速度的倍数（×
g）代替转速（rmin-1），这样可以真正反映颗粒在离心管中所受到的离心力。
离心力的数据通常是指相对离心力的平均值，也就是指离心管中点的离心力。
为了便于相对离心力和转速之间换算，人们对半径、相对离心力和转速三者之间进行换算，设计了相对离心力的转换列线图。
2.6.1.2沉降系数、沉降速度与K系数
2.6.1.3离心技术的分类
按照实际工作的需要，目前已设计出许多离心方法，综合起来大致可分三类：
①平衡离心法。
根据粒子大小、形状不同进行分离，包括差速离心法和速率区带离心法。
②等密度离心法又称等比重离心法，依粒子密度差进行分离。
等密度离心法和上述速率区带离心法又合称为密度梯度离心法。
③经典式沉降平衡离心法，用于对生物大分子分子量的测定、纯度估计、构象变化研究等。
（1）差速离心法
它利用不同的粒子在离心力场中沉降的差别，在同一离心条件下，沉降速度不同，通过不断增加相对离心力，使一个非均匀混合液内的大小、形状不同的粒子分部沉淀。
操作过程中一般是在离心后用倾倒的办法把上清液与沉淀分开，然后将上清液加高转速离心，分离出第二部分沉淀，如此往复加高转速，逐级分离出所需要的物质。
差速离心的分辨率不高，沉淀系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开，常用于其他分离手段之前的粗制品提取。
（2）速率区带离心法
这种方法是根据分离的粒子在梯度液中沉降系数s的不同，使具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内分成一系列区带，达到彼此分离的目的。
在离心前，于离心管内先装入密度梯度介质（如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等），待分离的样品铺在梯度液的顶部、离心管底部或梯度层中间，同梯度液一起离心。
离心后在近旋转轴处（X1）的介质密度最小，离旋转轴最远处（X2）介质的密度最大，但最大介质密度必须小于样品中粒子的最小密度，即ρP>
ρm。
梯度液在离心过程中以及离心完毕后，取样时起着支持介质和稳定剂的作用，避免因机械振动而引起已分层的粒子再混合。
由于ρP>
ρm，可知s>
0，因此该离心法的离心时间要严格控制，既要有足够的时间使各种粒子在介质梯度中形成区带，又要控制在任一粒子达到沉淀前结束离心。
如果离心时间过长，所有的样品可全部到达离心管底部；
离心时间不足，样品还没有分离。
由于此法是一种不完全的沉降，沉降受物质本身大小的影响较大，一般是应用在物质大小相异而密度相同的情况。
常用的梯度液有Ficoll、Percoll及蔗糖。
（3）等密度离心法
这种方法是根据颗粒密度的不同来进行分离的。
在离心前，预先配制介质的密度梯度液，此种密度梯度液包含了被分离样品中所有粒子的密度，待分离的样品铺在梯度液顶上或和梯度液先混合，离心开始后，梯度液由于离心力的作用逐渐形成管底浓而管顶稀的密度梯度，与此同时，原来分布均匀的粒子也发生重新分布。
当管底介质的密度大于粒子的密度，即ρm>
ρP时，粒子上浮；
在管顶处ρP>
ρm时，则粒子沉降，最后粒子进入到一个它本身的密度位置即ρP＝ρm，此时dx/dt为零粒子不再移动，粒子形成纯组份的区带。
区带与样品粒子的密度有关，而与粒子的大小和其他参数无关，因此只要转速、温度不变，则延长离心时间也不能改变这些粒子的成带位置。
2.6.2沉淀法
沉淀是溶质从溶液中析出的过程。
沉淀法操作简便、成本低廉，是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。
此方法的基本原理是根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的，不同溶解度的产生是由于溶质分子之间及溶质与溶剂分子之间亲和力的差异而引起的，溶解度的大小与溶质和溶剂的化学性质及结构有关，溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶液的pH值、离子强度和极性都会使溶质的溶解度产生明显的改变。
通过沉淀，将目的生物大分子转入固相沉淀或留在液相，而与杂质得到初步的分离。
在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法是：
①中性盐沉淀（盐析法）：
多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。
②有机溶剂沉淀：
多用于蛋白质和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分离纯化。
③选择性沉淀（热变性沉淀和酸碱变性沉淀）：
多用于除去某些不耐热的和在一定pH值下易变性的杂蛋白。
④等电点沉淀：
用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质的沉淀，但此法单独应用较少，多与其他方法结合使用。
⑤有机聚合物沉淀：
是发展较快的一种新方法，主要使用PEG聚乙二醇（Polyethyeneglycol，PEG）作为沉淀剂。
2.6.2.1中性盐沉淀（盐析法）
在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐析”。
除了蛋白质和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用盐析法进行沉淀分离，20％～40％饱和度的硫酸铵可以使许多病毒沉淀，43％饱和度的硫酸铵可以使DNA和rRNA沉淀，而tRNA保留在上清液中。
盐析法应用最广的还是在蛋白质领域，已有八十多年的历史，其突出的优点是：
①成本低，不需要特别昂贵的设备。
②操作简单、安全。
③对许多生物活性物质具有稳定作用。
由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，因而盐析操作也要求在低温下（0～4℃）进行。
（1）中性盐的选择
常用的中性盐中，最重要的是（NH4）2SO4，其突出的优点是溶解度大，即使是在低温条件下，仍有相当高的溶解度，这是其他盐类所不具备的。
（2）盐析的操作方法
（3）盐析的影响因素
①蛋白质的浓度。
中性盐沉淀蛋白质时，溶液中蛋白质的实际浓度对分离的效果有较大的影响。
通常高浓度的蛋白质用稍低的硫酸铵饱和度即可将其沉淀下来，但若蛋白质浓度过高，则易产生各种蛋白质的共沉淀作用，除杂蛋白的效果会明显下降。
对低浓度的蛋白质，要使用更大的硫酸铵饱和度，其共沉淀作用小，分离纯化效果较好，但回收率会降低。
通常认为比较适中的蛋白质浓度是2.5％～3.0％，相当于25～30mgmL-1。
②pH值。
蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度就越大。
改变pH值可改变蛋白质的带电性质，因而就改变了蛋白质的溶解度。
远离等电点处溶解度大，在等电点处溶解度小，因此用中性盐沉淀蛋白质时，pH值常选在该蛋白质的等电点附近。
③温度。
对于多数无机盐和小分子有机物，温度升高溶解度加大，但对于蛋白质、酶和多肽等生物大分子，在高离子强度溶液中，温度升高，它们的溶解度反而减小。
在低离子强度溶液或纯水中蛋白质的溶解度大多数还是随浓度升高而增加的。
在一般情况下，对蛋白质盐析的温度要求不严格，可在室温下进行。
但对于某些对温度敏感的酶，要求在0℃～4℃下操作，以避免活力丧失。
2.6.2.2有机溶剂沉淀法
（1）基本原理
有机溶剂可以使许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和小分子生化物质发生沉淀作用，其作用的原理主要是降低水溶液的介电常数。
溶剂的极性与其介电常数密切相关，极性越大，介电常数越大，如20℃时水的介电常数为80，而乙醇和丙酮的介电常数分别是24和21.4，因而向溶液中加入有机溶剂能降低溶液的介电常数，减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，增加了蛋白质分子间的相互作用，导致蛋白质溶解度降低而沉淀。
另一方面，由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏了蛋白质分子的水膜，因而发生沉淀作用。
有机溶剂沉淀法的优点是：
①分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。
②沉淀不用脱盐，过滤比较容易（如有必要，可用透析袋脱有机溶剂）。
其缺点是对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行。
（2）有机溶剂的选择和浓度的计算
（3）有机溶剂沉淀的影响因素
①温度：
多数蛋白质在有机溶剂与水的混合液中，溶解度随温度的降低而下降。
值得注意的是大多数生物大分子如蛋白质、酶和核酸在有机溶剂中对温度特别敏感，温度稍高就会引起变性，且有机溶剂与水混合时产生放热反应，因此有机溶剂必须预先冷至较低温度，操作要在冰盐浴中进行，加入有机溶剂时必须缓慢且不断搅拌以免局部过浓。
一般规律是温度越低，得到的蛋白质活性越高。
②样品浓度：
样品浓度对有机溶剂沉淀生物大分子的影响与盐析的情况相似，即低浓度样品要使用比例更大的有机溶剂进行沉淀，且样品的回收率低，具有生物活性的样品易产生稀释变性。
但对于低浓度的样品，杂蛋白与样品共沉淀的作用小，有利于提高分离效果。
反之，对于高浓度的样品，可以节省有机溶剂，减少变性的危险，但杂蛋白的共沉淀作用大，分离效果下降。
通常，使用5～20mgmL-1的蛋白质初浓度为宜，可以得到较好的沉淀分离效果。
③pH值：
有机溶剂沉淀适宜的pH值，要选择在样品稳定的pH值范围内，而且尽可能选择样品溶解度最低的pH值，通常是选在等电点附近，从而提高此沉淀法的分辨能力。
④离子强度：
离子强度是影响有机溶剂沉淀生物大分子的重要因素。
以蛋白质为例，盐浓度太大或太小都有不利影响，通常溶液中盐浓度以不超
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