细胞生物学实验Word文档格式.docx
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⑵1%、1/3000中性红溶液(装入棕色滴瓶)
称取0.5g中性红溶于50mlRinger液,稍加热(30~40℃)使之很快溶解,用滤纸过滤,装于棕色瓶于暗处保存,否则易氧化沉淀,失去染色能力。
临用前,取已配制好的1%中性红溶液1ml,加入29mlRinger溶液混匀,制成1/3000中性红液装入棕色瓶备用。
⑶1%、1/5000詹纳斯绿B溶液(装入棕色滴瓶)
称取0.05g詹纳斯绿B溶于5mlRinger溶液中,稍加热(30~40℃),使之溶解,用滤纸过滤后,即为1%原液。
取1%原液1ml加入49mlRinger溶液,即成1/5000工作液,装入瓶中备用。
最好现用现配,以保持它的充分氧化能力。
[实验步骤]
(一)线粒体的超活染色与观察
线粒体是细胞进行呼吸作用的场所,其形态和数量随不同物种、不同组织织器官和不同的生理状态而发生变化。
詹纳斯绿B是一种毒性较小的碱性染料,可专一性地对线粒体进行超活染色。
这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用,使染料始终保持氧化状态(即有色状态),呈蓝绿色;
而线粒体周围的细胞质中,这些染料被还原为无色的色基(即无色状态)。
洋葱鳞茎表皮细胞线粒体的超活染色观察
1)用吸管吸取1/5000詹纳斯绿B染液,滴一滴于干净的载玻片上,然后撕取一小片洋葱鳞茎内表皮,置于染液中,染色10-15分钟。
2)用吸管吸去染液,加一滴Ringer液,注意使内表皮细织展平,盖上盖玻片进行观察。
3)先用低倍镜进行观察,找到细胞后,即可转入高倍镜继续观察,在高倍镜下,可见洋葱表皮细胞中央被一大液泡所占据,细胞核被挤至一侧贴细胞壁处。
在它的周围有致密的原生质体,在原生质中有被染成蓝绿色的小颗粒。
此即线粒体。
仔细观察细胞质中线粒体的形态与分布。
(二)液泡系的超活染色与观察
液泡系是指同一细胞内,许多大小相同或不同的液泡所组成的一个系统。
存在于动物细胞和植物细胞。
在植物细胞中,液泡有一个演进的过程。
在动物胚胎或幼年细胞中,液泡大部分集中分布在细胞核的顶部上方,形成一个液泡区。
中性红为弱碱性染料,对液泡系的染色有专一性,只将活细胞中的液泡系染成红色,细胞核与细胞质完全不着色,这可能与液泡中某些蛋白质有关。
黄豆根尖细胞液泡系的中性红染色观察:
1、用双面刀片把初生的黄豆幼苗根尖(约1-2cm长)小心切一纵切面(切片应尽量切薄),放入载玻片上的1/3000中性红染液滴中,染色5-10分钟。
2、吸去染液,滴一滴Ringer液,盖上盖玻片,并用镊子轻轻地压下盖玻片,使根尖压扁,利于观察。
3、在高倍镜下,先观察根尖部分的生长点的细胞,可见细胞质中散在很多大小不等的染成玫瑰红色的圆形小泡,这是初生的幼小液泡。
然后,由生长点向延长区观察,在一些已分化长大的细胞内,液泡的染色较浅,体积增大,数目变少。
在成熟区细胞中,一般只有一个淡红色的巨大液泡,占据细胞的绝大部分,将细胞核挤到细胞一侧贴近细胞壁处。
实验二细胞凝集反应
【实验目的】
1、初步掌握细胞凝集原理。
2、观察细胞凝集现象。
【实验原理】
细胞膜是双层脂镶嵌蛋白质结构,脂和蛋白质又能与糖分子结合为细胞表面的分枝状糖外被。
目前认为:
细胞间的联系、细胞的生长和分化、免疫反应和肿瘤发生都和细胞表面的分枝糖分子有关。
凝集素是一类含糖并能与糖专一结合的蛋白质,它具有凝结细胞和刺激细胞分化的作用。
凝集素使细胞凝集是由于它与细胞表面的糖分子连接,在细胞间形成“桥”的结果,加入与凝集素互补的糖可以抑制细胞的凝集。
【仪器、材料与试剂】
显微镜、离心机、天平
土豆、鸡血(一份鸡血加两份阿氏液置4OC冰箱冷藏)、载玻片、盖玻片、滴管、离心管
3、试剂:
1)PBS缓冲液:
称取NaCl7.2g、Na2HP041.48g、KH2PO40.43g,加蒸馏水定容到1000m1,调Ph值到7.2。
2)阿氏液:
葡萄糖2.02g,氯化钠0.42g,柠檬酸钠0.80g,柠檬酸0.055g,蒸馏水加到1000ml,置4OC冰箱中保存。
3)0.9%生理盐水
【实验步骤】
1、称取土豆去皮块茎2g,加10m1PBS缓冲液,浸泡2h,浸出的粗提液中含有可溶性土豆凝集素。
2、制备2%的红细胞:
(制备流程如下)
鸡血(一份鸡血加两份阿氏液)
混匀取15ml,离心(2000rpm)10’
弃上清取沉淀
加0.9%生理盐水,混匀,离心(2000rpm)10’,重复2—3次
弃上清取沉淀,滴管滴加5ml生理盐水,混匀,取0.5ml悬液
以生理上盐水定容到25ml,制成2%鸡红细胞备用
3、用滴管吸取土豆凝集素和2%红细胞各一滴,置载玻片上,充分混匀,静置20分钟后于低倍显微镜下观察血球凝集现象。
4、对照实验:
PBS液加2%血细胞液。
【作业】
用简图表示血细胞凝集现象。
实验三叶绿体的提取
1、通过本实验掌握用差速离心法分离叶绿体的技术。
2、了解细胞器制备一般程序。
细胞器的分离一般采用差速离心法,细胞经过破碎后,在适当的介质中进行差速离心,利用细胞各组分质量大小不同,在不同离心力的作用下,即可得到所需的组分。
离心机、台秤、显微镜
菠菜叶(或小麦叶、玉米叶、向日葵、、豌豆叶)、研钵一付、双层纱布、玻璃漏斗、烧杯(200m1)2个、滴管1支、50ml量筒1个、擦镜纸、盖玻片、载玻片、吸水纸(可用卫生纸代替)
(1)配制0.5M的蔗糖(分子量:
342.30)水溶液
(2)磷酸钾缓冲液:
将KH2P04(分析纯,分子量:
136.09)溶于部分上述
(1)液中,使其浓度为0.1M,pH调至7.4。
(3)完全介质:
将EDTA-Na2(分子量:
372.28)溶于B上述
(2)液中,使其浓度为0.01mol/L,pH调至7.4。
【实验方法与步骤】
1、将叶片洗净吸干后,称取鲜重10g,剪成1-2cm2小块。
2、加入20ml完全介质,在研钵中充分研碎。
3、用双层纱布过滤残渣。
4、汁液在1000rpm下离心5分钟,弃去沉淀(完整细胞、核)。
5、上清在2000rpm下离心12分钟,大部分叶绿体在这次离心中沉淀。
弃去上清液。
6、将沉淀悬浮于15mL蔗糖液中,再以2000rpm,离心12分钟,所得沉淀即为纯化叶绿体。
7、将沉淀悬浮于约3ml蔗糖液中。
8、制片,在高倍镜下观察
9、在光学显微镜下观察叶绿体形态及大小
10、对照实验:
用过程(3)中的滤液制片观察完整细胞,与所得叶绿体形态及大小相比较。
绘制所观察到的叶绿体
实验五红细胞膜(Ghost)的制备
掌握从哺乳动物红细胞中分离细胞质膜的步骤和方法。
哺乳动物的红细胞膜在分离状态下,一般称为“血影”(ghost),由于哺乳动物的红细胞中没有通常真核细胞内所含有的任何细胞器,经过制备,容易得到纯净的细胞膜。
从哺乳动物红细胞中分离细胞质膜:
第一步是将血液放入加有抗凝剂的容器内,用低速离心的方法从血液中分离出红细胞,然后用等渗缓冲液重复洗涤多次,去除血浆;
第二步将洗净的红细胞转移到低渗缓冲液中,使红细胞膨胀而溶血,最后将溶血的红细胞经过反复洗涤,高速离心,去除血红蛋白和其他细胞内含物,而获得纯净的红细胞膜。
冰冻离心机
兔血(每6ml血液加1毫升肝素-pH7.4等渗磷酸盐缓冲液<
配方见下>
)、烧杯、玻棒、滴管、量筒、冰浴装置(容器盛水在冰箱中冷冻成冰)
1)5mM,pH7.4等渗磷酸盐缓冲液(其中含有0.15MNaCl)
贮液A:
称取0.780gNaH2PO4.2H2O,用蒸馏水定容至1000ml。
贮液B:
称取1.79gNa2HPO4.12H2O,用蒸馏水定容至1000ml。
工作液:
取190ml贮液A加810ml贮液B,再称取8.76gNaCl溶于其中。
置冰箱中预冷。
2)10mM,pH7.4低渗Tris-HCl缓冲液
称取2.42gTris,用蒸馏水定容至1000ml。
量取0.84ml36-38%盐酸,用蒸馏水稀释至1000ml。
取250ml贮液A加207ml贮液B,用水稀释至近1000ml,用6N盐酸调pH至7.4,再定容至1000ml。
3)肝素-pH7.4等渗磷酸盐缓冲液
将肝素溶在pH7.4等渗磷酸盐缓冲液中,每毫升含肝素500单位。
(一)红细胞的制备和洗涤
1、用滴管取0.5ml血液,于冰冻离心机中,4OC,3000rpm离心20min,使红细胞沉淀。
用吸管吸尽血浆及沉淀的红细胞表层的绒毛状沉淀层。
2、将红细胞放入三倍(1.5ml)预冷的pH7.4等渗磷酸盐缓冲液中,用吸管吹吸使其悬浮,于4OC,5000rpm离心15min,除去上清液及沉淀表层。
(二)溶血及红细胞膜的洗涤
1、在洗净的红细胞中,按1:
40的比例加入预冷的pH7.4低渗Tris-HCl缓冲液,边加边搅拌,置冰浴装置中1小时,使之完成溶血。
2、于4OC,9000rpm离心20min,使红细胞膜沉淀,获得白色的红细胞膜。
3、将所得到的红细胞膜悬浮在2-3滴pH7.4等渗磷酸盐缓冲液中。
(三)细胞膜的镜检
取少量膜样品悬浮液,在相差显微镜下观察,纯净的膜为扁圆形,白色,膜表面略有皱纹。
实验六光镜下植物细胞骨架的观察—
考马斯亮蓝R250染色法
掌握观察植物细胞内细胞骨架的一种方法:
考马斯亮蓝R250(CoomassieblueR250)染色法
真核细胞胞质中有错综复杂的纤维网,称为细胞骨架(cytoskeleton),根据纤维的直径分为微丝(MS)、微(MT)、中间纤维(IF)。
此外还散布着一些比微丝还细的纤维。
用适当浓度的非离子去垢剂Tritox-100处理植物细胞时,可抽提掉胞质中除骨架蛋白以外的其他蛋白,保留下来的细胞骨架经考马斯亮蓝R250染色后,可在光镜下清晰地观察到它的网状结构。
温箱(或恒温水浴锅)、显微镜
新鲜、幼嫩的洋葱鲜茎内表皮、烧杯、刀片、镊子、滴管、载玻片、盖玻片、吸水纸、擦镜纸、香柏油、洗镜液
1)6mM,pH6.5磷酸缓冲液(内含5mMKCl)
称取2.149gNa2HPO4.12H2O,用蒸馏水定容至1000ml。
称取0.936gNaH2PO4.2H2O,用蒸馏水定容至1000ml。
取685ml贮液A加315ml贮液B,再称取0.372gKCl溶于其中。
2)M缓冲液[其中EGTA又名乙二醇双(α-氨基乙苯)醚四乙酸,EDTA即乙二胺四乙酸]
咪唑50mM3.404g
氯化镁0.5mM0.101g
EGTA1mM0.380g
EDTA0.1mM0.029g
DTT1mM0.155g
加蒸馏水至1000ml
3)1%Tritonx-100(用M缓冲液液配制):
取5mlTritonx-100于M缓冲液中,加热后定容至500ml。
4)3%戊二醛(用6mM,pH6.5磷酸缓冲液配制)
5)0.2%考马斯亮兰R250
考马斯亮兰R2500.6g
甲醇139.5ml
冰醋酸21ml
蒸馏水139.5ml
混匀,装入棕色滴瓶中备用。
6)蒸馏水
1、用镊子撕取洋葱鳞茎的内表皮(取材时注意不要用靠近边缘的内表皮),大小约0.5~1cm,放入10mL,PH6.5的磷酸缓冲液中。
2、将材料取出,用1%Tritonx-lOO处理20-30min,
3、用M缓冲液洗3-5次,每次5min。
4、用3%戊二醛固定0.5-1h。
5、用pH6.5的磷酸缓冲液洗3-5次,每次5分钟,将材料置于载玻片上,滤纸吸去残液。
6、用0.2%考马斯亮兰R250染色30min(在载玻片上进行)。
7、用蒸馏水冲洗数遍。
8、加滴蒸馏水制片,在高倍镜或油镜下观察,可见到与核联系的细胞骨架及靠近细胞壁的网状结构,呈深蓝色。
绘制洋葱鳞茎内表皮细胞的细胞骨架图像
实验四红细胞膜(Ghost)的制备
实验五光镜下植物细胞骨架的观察—
1、用镊子撕取洋葱鳞茎的内表皮(取材时注意不要用靠近边缘的内表皮),大小约0.5~1cm,放入10mL,PH6.5的磷酸缓冲液中。
2、将材料取出,用1%Tritonx-lOO处理20-30min,
3、用M缓冲液洗3-5次,每次5min。
实验六RNA的细胞化学反应——Unna反应
掌握显示细胞内RNA和DNA的主要细胞化学方法以及了解RNA和DNA在细胞内的一般分布状况。
1989年Pappenheim首创了甲基绿-派洛宁染色法。
1902年Unna对这一方法进行了改良。
1940年Brachet研究证明甲基绿和派洛宁对DNA和RNA有选择性的染色效果。
这是一种利用碱性染料显示细胞内RNA的标准方法之一。
其原理是:
利用DNA和RNA对碱性染料的亲合力有差异,而进行选择性染色,即RNA被Unna试剂中的派洛宁染成红色,DNA被Unna试剂中的甲基绿染成绿色。
【实验器材和试剂】
1.实验材料
洋葱鳞茎
2.实验器材
显微镜、镊子、刀片、载玻片、盖玻片、酒精灯、滤纸、染色缸、吸水纸
3.实验试剂
Unna试剂:
甲液:
5%的派洛宁水溶液2ml;
2%的甲基绿水溶液6ml;
蒸馏水16ml
乙液:
1MPH48的醋酸盐缓冲液。
配制方法为:
A液:
6ml冰醋酸+100ml蒸馏水
B液:
135g醋酸钠+100ml蒸馏水
取A液40ml加B液60ml即为乙液。
乙液以现配为好。
甲液和乙液分别保存在4℃冰箱中备用。
用时甲、乙两液混匀即成Unna试剂。
丙酮
正丁醇
二甲苯
加拿大树胶
明胶粘片剂:
明胶1g,蒸馏水100ml,苯酚2g,甘油15ml。
配法:
将蒸馏水加热至36℃,再依次加入明胶、苯酚、甘油(可在36℃水浴锅中进行,明胶在36℃溶解度最大),待充分溶解后,过滤,贮存于有玻璃塞的瓶中备用。
注意配好后不要放在冰箱中。
70%酒精
95%酒精
无水酒精。
Carnoy固定液
5%三氯醋酸
【实验内容与方法】
1.在干净的载玻片上涂以一极薄的明胶粘片剂,滴一滴蒸馏水,用镊子撕下小片洋葱表皮置于蒸馏水之上,使之展开。
2.片子置于酒精灯火焰上烘烤,待蒸馏水蒸发后,洋葱表皮即粘在载玻片上。
3.立即将片子放入carnoy固定液中固定15分钟。
4.取出固定材料,用无水酒精将片子上的醋酸冲洗干净,然后将片子经95%、70%酒精(各5分钟),然后移入蒸馏水中。
将装片分为实验组和对照组。
5.对照组用5%三氯醋酸于90℃处理15min,用蒸馏水冲洗5min。
6.将实验组和对照组装片均浸入Unna试剂中染色30分钟。
7.用蒸馏水冲洗数秒钟,以洗去多余的染液,但冲洗时间不宜过长,否则派洛宁会被洗掉,然后用吸水纸将片子上的水分吸干。
8.片子浸入纯丙酮中分色3-20秒。
9.蒸馏水洗片刻,镜检
10.将制作较好的装片移入正丁醇和二甲苯混合液(1:
1)中10-30秒。
11.在纯二甲苯中透明5-15分钟
12.用加拿大树胶封片,即成永久装片。
13.镜检。
【注意事项】
商品甲基绿常混有甲基紫,会影响染色效果,应该用氯仿将甲基绿中的甲基紫成分洗脱干净。
方法是将市售甲基绿泡入氯仿中,用力振摇,静置后过滤,反复多次直到氯仿中无甲基紫色出现为止。
洗去甲基紫后干燥备用。
【作业与思考】
1.用彩色笔绘出反应结果的细胞图,并注明不同颜色的部位表示有什么物质存在。
2.验交永久装片一张。