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DNA聚合酶
作用实质
都是催化两个核苷酸之间形成磷酸二酯键
是否需模板
不需要
需要
连接DNA链
双链
单链
作用过程
在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
将单个核苷酸加到已存在的核酸片段上，形成磷酸二酯键
作用结果
将存在的DNA片段连接成重组DNA分子
合成新的DNA分子
（三）运载体——分子运输车
1、条件：
能在宿主细胞中保存下来并大量复制，有一个至多个限制性核酸内切酶切割点，有特殊的遗传标记基因，便于筛选。
2、种类：
质粒（常用）、γ噬菌体的衍生物、动植物病毒。
3、质粒是能够自主复制的双链小型环状DNA分子。
4、作用：
（1）作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞内；
（2）利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。
【基础训练】1、切取某动物合成生长激素的基因，用某方法将此基因转移到鲇鱼的受精卵中，从而使鲇鱼比同类个体大了3～4倍，此项研究遵循的原理是（D）
2、如图示一项重要生物技术的关键，字母X可能代表（C）
A、不能合成胰岛素的细菌
B、能合成抗体的人类细胞
C、能合成胰岛素的细菌
D、不能合成抗生素的人类细胞
3、如图为利用生物技术获得生物新品种的过程，据图回答：
（1）在基因工程中，A→B为DNA扩增（PCR）技术，利用的原理是DNA复制，其中①为DNA解旋过程。
（2）加热至94℃的目的是使DNA中的氢键断裂，这一过程在细胞内是通过解旋酶的作用来完成的。
（3）当温度降低时，引物与模板末端结合，在DNA聚合酶的作用下，引物沿模板链延伸，最终合成两条DNA分子，此过程中原料是4种脱氧核苷酸，遵循的原则是碱基互补配对原则。
（4）目的基因导入绵羊受体细胞常用显微注射技术。
（5）B→D为抗虫棉的培育过程，其中④过程常用的方法是农杆菌转化法，要确定目的基因（抗虫基因）导入受体细胞后，是否能稳定遗传并表达，需进行检测和鉴定工作，请写出在个体生物学水平上的鉴定过程：
让害虫吞食转基因棉花的叶子，观察害虫的存活情况，以确定性状。
【高考战场】
4、（07广东卷）现有一长度为1000碱基对（by）的DNA分子，用限制性核酸内切酶EcoRI酶切后得到的DNA分子仍是1000by，用KpnI单独酶切得到400by和600by两种长度的DNA分子，用EcoRI、KpnI同时酶切后得到200by和600by两种长度的DNA分子。
该DNA分子的酶切图谱正确的是（D）
5、（07全国卷2）下列有关基因工程中限制性内切酶的描述，错误的是（C）
A、一种限制性内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列B、限制性内切酶的活性受温度影响
C、限制性内切酶能识别和切割RNAD、限制性内切酶可从原核生物中提取
【作业练习】
第80节基因工程的原理和技术
【课标要求】了解基因工程的基本原理；
描述重组DNA技术的基本步骤。
【高考预测】基因工程原理及基本操作程序。
【知识整理】
一、获得目的基因
（一）从自然界已有的物种中分离出来，如可从基因文库中获取。
（二）人工合成目的基因：
常用的方法为化学合成法。
（三）利用聚合酶链式反应（PCR）技术扩增目的基因：
通过PCR技术可对已获取的目的基因进行扩增，以获取大量的目的基因。
二、形成重组DNA分子（如右上图）
三、将重组DNA分子导入受体细胞
生物种类
植物细胞
动物细胞
微生物细胞
常用方法
农杆菌转化法
显微注射技术
Ca2＋处理法
受体细胞
体细胞
受精卵
原核细胞
转化过程
将目的基因插入Ti质粒的T—DNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA→表达
将含有目的基因的表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物
Ca2＋处理细胞→微生物细胞壁的通透性增加→重组质粒与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子
四、筛选含有目的基因的受体细胞
（一）原理：
质粒上有抗生素的抗性基因。
（二）方法：
利用选择培养基筛选。
（三）举例：
五、目的基因的表达
（一）场所：
含重组DNA分子的受体细胞。
（二）标志：
表现“目的基因”控制的性状。
【基础训练】1、在培育转基因植物的研究中，卡那霉素抗性基因（kanr）常作为标记基因，只有含卡那霉素抗性基因的细胞才能在卡那霉素培养基上生长。
如图为获得抗虫棉的技术流程。
请据图回答：
（1）A过程是基因工程操作步骤中的形成重组DNA分子过程。
（2）B过程及其结果体现了质粒作为载体必须具备的两个条件是具有标记基因；
能在宿主细胞中复制并稳定保存。
（3）C过程的培养基除含有必要营养物质、琼脂和激素外，还必须加入卡那霉素。
在此过程中，培养基的成分和物理性质都会对器官的发生有一定影响，但起决定作用的是植物激素（生长素和细胞分裂素的配比）。
（4）若将该转基因植株的花药在卡那霉素培养基上做离体培养，则获得的再生植株群体中抗卡那霉素型植株占100%。
（5）有人担心转基因生物会对生态系统的稳定性造成破坏，请你结合抗虫棉的培育成功来说明转基因植物的种植有利于环境保护的理由。
种植抗虫植物，可以大大减少农药的使用量，减轻环境污染。
2、在受体细胞中能检测出目的基因是因为（C）
A、质粒与目的基因重组后能够复制B、目的基因上具有标记
C、质粒上具有某些标记基因D、以上都不正确
3、1976年，美国的H.Boyer教授首次将人生长抑制素释放因子基因转入大肠杆菌，并获得表达，这是人类第一次获得转基因生物，此文中的表达是指该基因在大肠杆菌中（B）
A、能进行DNA复制B、能进行转录和翻译
C、能控制合成生长抑制素释放因子D、能合成人的生长激素
【高考战场】4、（07海南卷）已知SARS是由一种RNA病毒感染所引起的疾病。
SARS病毒表面的S蛋白是主要的病毒抗原，在SARS病人康复后的血清中有抗S蛋白的特异性抗体。
某研究小组为了研制预防SARS病毒的疫苗，开展了前期研究工作。
其简要的操作流程如下：
（1）实验步骤①所代表的反应过程是逆转录。
（2）步骤②构建重组DNA分子A和重组DNA分子B必须使用限制性核酸内切酶和DNA连接酶，后者的作用是将限制性核酸内切酶切割的载体和S蛋白基因连接起来。
（3）如果省略步骤②而将大量扩增的S蛋白基因直接导入大肠杆菌，一般情况下，不能得到表达的S蛋白，其原因是S蛋白基因在大肠杆菌中不能复制，也不能合成S蛋白基因的mRNA。
（4）为了检验步骤④所表达的S蛋白是否与病毒S蛋白有相同的免疫反应特性，可用大肠杆菌中表达的S蛋白与SARS康复病人血清进行抗原—抗体特异性反应实验，从而得出结论。
（5）步骤④和⑥的结果相比，原核细胞表达的S蛋白与真核细胞表达的S蛋白的氨基酸序列相同（相同、不同），根本原因是表达蛋白质所用的基因相同。
5、（07江苏卷）很久以前科学家在土壤中发现了某种细菌能制造一种对昆虫有毒的蛋白质，当时许多人就想把编码这一蛋白质的基因（抗虫基因）转移到农作物中，以降低昆虫对农作物造成的危害。
20世纪90年代，美国科学家采用基因工程技术首次培育出抗虫玉米新品种。
下图为这一转基因玉米的主要培育过程。
（1）获得特定目的基因的途径除了从该细菌中直接分离抗虫基因外，还可以人工合成。
将目的基因与运载体结合时必须用同种限制性核酸内切酶和DNA连接酶。
在基因工程中，常用的运载体有质粒（或动植物病毒或噬菌体等）等，而作为运载体必须具备相应的条件，例如应具有标记基因以便进行筛选。
（2）由转基因玉米细胞经过脱分化（或去分化）形成愈伤组织，然后发育成胚状体和试管苗。
若要制备转基因玉米的人工种子，可选择上述实验过程中的胚状体再包裹合适的人造种皮等。
6、（09安徽卷）2008年诺贝尔化学奖授予了“发现和发展了水母绿色荧光蛋白“的三位科学家。
将绿色荧光蛋白基因的片段与目的基因连接起来组成一个融合基因，再将该融合基因转入真核生物细胞内，表达出的蛋白质就会带有绿色荧光。
绿色荧光蛋白在该研究中的主要作用是（C）
A、追踪目的基因在细胞内的复制过程B、追踪目的基因插入到染色体上的位置
C、追踪目的基因编码的蛋白质在细胞内的分布D、追踪目的基因编码的蛋白质的空间结构
7、（09浙江卷）下列关于基因工程的叙述，错误的是（D）
A、目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物
B、限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶
C、人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性
D、载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达
8、（09广东卷）钱永健先生因在研究绿色荧光蛋白方面的杰出成就而获2008年诺贝尔奖。
在某种生物中检测不到绿色荧光，将水母绿色荧光蛋白基因转入该生物体内后，结果可以检测到绿色荧光。
由此可知（C）
A、该生物的基因型是杂合的
B、该生物与水母有很近的亲缘关系
C、绿色荧光蛋白基因在该生物体内得到了表达
D、改变绿色荧光蛋白基因的1个核苷酸对，就不能检测到绿色荧光
9、（09重庆卷）下表有关基因表达的选项中，不可能的是（D）
基因
表达的细胞
表达产物
A
细菌抗虫蛋白基因
抗虫棉叶肉细胞
细菌抗虫蛋白
B
人酪氨酸酶基因
正常人皮肤细胞
人酪氨酸酶
C
动物胰岛素基因
大肠杆菌工程菌细胞
动物胰岛素
D
兔血红蛋白基因
兔成熟红细胞
兔血红蛋白
10、（09上海卷）
科学家运用基因工程技术将人胰岛素基因与大肠杆菌的质粒DNA分子重组，并且在大肠杆菌体内获得成功表达。
图示a处为胰岛素基因与大肠杆菌质粒DNA结合的位置，它们彼此能结合的依据是（D）
A、基因自由组合定律B、半保留复制原则
C、基因分离定律D、碱基互补配对原则
11、（09天津卷）水稻种子中70％的磷以植酸形式存在。
植酸易同铁、钙等金属离子或蛋白质结合排出体外，是多种动物的抗营养因子，同时，排出的大量磷进入水体易引起水华。
（1）磷元素除了形成植酸外，还可以出现在下列_____________分子或结构中（多选）。
A、核糖B、ATPC、核糖体D、核膜
（2）种植芦苇能有效抑制水华的发生，表明芦苇与引起水华的藻类关系是_____________。
（3）植酸酶可降解植酸，在谷物类饲料中添加植酸酶可提高饲料的_____________利用率。
（4）酵母菌中植酸的活性较高。
下图是从不同类型酵母菌的发酵液中提取植酸酶的工艺流程。
据图回答：
①植酸酶________________（Ⅰ/Ⅱ）属于分泌蛋白。
②若植酸酶Ⅰ和Ⅱ的肽链组成不同，其差异体现在__________________。
③提纯的植酸酶需做活性条件测定。
右图为测定结果。
图中的自变量可为____________________________（答一种）；
因变量可以通过测定______________________来表示。
（5）为从根本上解决水稻中的高植酸问题，可将植酸酶基因导入水稻，培育低植酸转基因水稻品种。
下图是获取植酸酶基因的流程。
①图中基因组文库____________（小于/等于/大于）cDNA文库。
②B过程需要的酶是______________；
A、C过程中_____________（可以/不可以）使用同一种探针筛选含目的基因的菌株。
③目的基因Ⅰ和Ⅱ除从构建的文库中分离外，还可以分别利用图中_________。
和_________为模板直接进行PCR扩增，该过程中所用酶的显著特点是_________________________。
（6）已获得的转植酸酶基因水稻品系植酸含量低，但易感病，下图为选育低植酸抗病水稻品种的过程。
图中两对相对性形状分别由两对基因控制，并独立遗传。
采用图的育种过程，需从______________代开始筛选，经筛选淘汰后，在选留的植株中低植酸抗病纯合体所占的比例是______________。
选留植株多代自交，经筛选可获得低植酸抗病性状稳定的品性。
答案：
（1）BCD
（2）竞争关系（3）营养成分
（4）①I②氨基酸的种类、数量和排列顺序不同
③温度（或PH）单位时间内植酸的降解量（或植酸降解产物的生成量）
（5）①大于②逆转录酶可以③DNAcDNA耐高温（6）F21/9
12、（09福建卷）转基因抗病香蕉的培育过程如图所示。
质粒上有PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ等四种限制酶切割位点。
请回答：
（1）构建含抗病基因的表达载体A时，应选用限制酶，对进行切割。
（2）培养板中的卡那霉素会抑制香蕉愈伤组织细胞的生长，欲利用该培养筛选已导入抗病基因的香蕉细胞，应使基因表达载体A中含有，作为标记基因。
（3）香蕉组织细胞具有，因此，可以利用组织培养技术将导入抗病基因的香蕉组织细胞培育成植株。
图中
、
依次表示组织培养过程中香蕉组织细胞的。
（1）PstⅠ、EcoRⅠ含抗病基因的DNA、质粒
（2）抗卡那霉素基因
（3）全能性脱分化、再分化
13、（09江苏卷）苏云金杆菌（Bt）能产生具有杀虫能力的毒素蛋白。
上图是转Bt毒素蛋白基因植物的培育过程示意图（ampr为抗氨苄青霉素基因），据图回答下列问题。
（1）将图中①的DNA用HindⅢ、BamHⅠ完全酶切后，反应管中有种DNA片段。
（2）图中②表示HindⅢ与BamHⅠ酶切、DNA连接酶连接的过程，此过程可获得种重组质粒；
如果换用Bstl与BamHⅠ酶切，目的基因与质粒连接后可获得种重组质粒。
（3）目的基因插入质粒后，不能影响质粒的。
（4）图中③的Ti质粒调控合成的vir蛋白，可以协助带有目的基因的T—DNA导人植物细胞，并防止植物细胞中对T—DNA的降解。
（5）已知转基因植物中毒素蛋白只结合某些昆虫肠上皮细胞表面的特异受体，使细胞膜穿孔，肠细胞裂解，昆虫死亡。
而该毒素蛋白对人类的风险相对较小，原因是人类肠上皮细胞。
（6）生产上常将上述转基因作物与非转基因作物混合播种，其目的是降低害虫种群中的基因频率的增长速率。
（1）4
（2）21（3）复制（4）DNA水解酶（5）表面无相应的特异性受体（6）抗性
14、（09上海卷）人体细胞内含有抑制癌症发生的P53基因，生物技术可对此类基因的变化进行检测。
（1）目的基因的获取方法通常包括______和________。
（2）上图表示从正常人和患者体内获取的P53基因的部分区域。
与正常人相比，患者在该区域的碱基会发生改变，在上图中用方框圈出发生改编的碱基对，这种变异被称为
_。
（3）已知限制酶E识别序列为CCGG,若用限制酶E分别完全切割正常人和患者的P53基因部分区域（见上图），那么正常人的会被切成________个片段，而患者的则被切割成长度为________对碱基和________对碱基的两种片段。
（4）如果某人的P53基因部分区域经限制酶E完全切割后，共出现170、220、290和460碱基对的四种片段，那么该人的基因型是________（以P+表示正常基因，Pn表示异常基因）。
（1）从细胞中分离通过化学方法人工合成
（2）见下图
基因碱基对的替换（基因突变）
（3）3460220（4）P+P-
第81节基因工程的应用
【课标要求】认识基因工程在遗传育种、疾病治疗和生态环境保护领域的应用；
认识基因治疗的基本原理及应用前景；
在“设计基因工程方案解决生活中疑难问题”的活动中培养学生解决问题能力和综合表达能力。
【高考预测】设计某一转基因生物的培育过程；
基因工程的应用及取得成果的典型实例。
【知识整理】一、基因工程与遗传育种
类型
遗传育种
基因工程
实例
转基因植物
所需时间较长，无法
完成远缘亲本的杂交
所需时间较短，无远
缘亲本难杂交的限制
①抗逆性，抗病虫害的植物
②优良品质植物
转基因动物
费时，费力
所需时间较短
①生长速度较快的转基因鱼、猪等
②具有抗病能力的转基因鸡和牛等
二、基因工程与疾病治疗
（一）基因工程药物
药物
成分
用途
传统方法
胰岛素
蛋白质
治疗胰岛素依赖型
糖尿病
从猪和羊的胰腺
中提取
通过基因工程技术利用大肠杆菌
生产
干扰素
糖蛋白
治疗病毒性肝炎和
肿瘤
从人血液中提取
通过人白细胞干扰素基因在受体
细胞中的克隆和表达获取
乙型肝
炎疫苗
预防乙型肝炎
无
通过基因工程技术利用酵母菌或
哺乳动物细胞生产
（二）基因治疗
1、含义：
向目标细胞中引入正常功能的基因，以纠正或补偿基因的缺陷，达到治疗的目的。
2、事例：
重度免疫缺陷症的基因治疗（如右图）。
三、基因工程与生态环境保护
（一）利用细菌发酵和转基因植物生产具有生物可降解的新型塑料。
（二）改造分解石油的细菌，提高分解石油能力。
（三）生产转基因微生物，吸收环境中的重金属，降解有毒化合物和处理工业废水。
【基础训练】1、继哺乳动物乳腺生物反应器研究成功后，膀胱生物反应器的研究也取得了一定进展。
最近，科学家培育出一种转基因小鼠，其膀胱上皮细胞可以合成人的生长激素并分泌到尿液中，请回答：
（1）将人的生长激素基因导入小鼠受体细胞，常用方法是显微注射法。
（2）进行基因转移时，通常要将外源基因转入受精卵（或早期胚胎）中，原因是受精卵（或早期胚胎细胞）具有全能性，可使外源基因在相应组织细胞中得以表达。
（3）转基因小鼠的膀胱上皮细胞合成的人的生长激素的成分是蛋白质，此过程包括转录和翻译。
（4）在研制膀胱生物反应器时，应使外源基因在小鼠的膀胱上皮细胞中特异表达。
（5）为使外源基因在后代长期保持，可将转基因小鼠体细胞的细胞核转入去核的卵细胞中构成重组细胞，使其发育成与供体具有相同性状的个体，该技术称为核移植（或克隆）。
2、在人类的遗传病中，有一种重症联合免疫缺陷病（简称SCID），这种患者缺乏正常的人体免疫功能，只要稍被细菌或病毒感染，就会发病死亡。
经研究证实，SCID病人细胞的一个常染色体上编码腺苷酸脱氨酶（简称ADA）的基因ada发生了突变。
目前，人们已经找到了治疗该疾病的方案。
如图：
（1）载体必须具备的条件是（ABC）
A、能在宿主细胞中复制并保存
B、具有多个限制性核酸内切酶切割位点，以便与外源基因连接
C、具有标记基因，便于进行筛选
D、是环状形态的DNA分子
（2）在图示过程中，所用到的基因操作工具分别是限制性核酸内切酶、DNA连接酶、载体。
（3）研究人员将ADA注入淋巴细胞，而不是其他细胞，其原因是腺苷酸脱氨酶是人体免疫系统发挥正常功能所必需的，而淋巴细胞才能产生抗体等免疫物质。
（4）图中的治疗方法是体外（“体内”或“体外”）基因治疗法，这是对基因工程生物技术的应用。
请列举除了在医学领域，该生物技术在其他领域的一些成就。
（举两例）如抗虫转基因植物，抗逆转基因植物等。
3、干扰素是治疗癌症的重要药物，它必须从血液中提取，每升人血中只能提取0.5μg，所以价格昂贵。
美国加利福尼亚的某生物制品公司用如下方法生产干扰素。
如图所示：
从上述方式中可以看出该公司生产干扰素运用的方法是（B）
A、个体间的杂交B、基因工程C、细胞融合D、器官移植
【高考战场】4、（06广东卷）下列关于基因工程应用的叙述，正确的是（B）
A、基因治疗就是把缺陷基因诱变成正常基因B、基因诊断的基本原理是DNA分子杂交
C、一种基因探针能检测水体中的各种病毒D、原核基因不能用来进行真核生物的遗传改良
5、（06江苏卷）基因工程又叫基因拼接技术。
（1）在该技术中，用人工合成方法获得目的基因的途径之一是：
①以目的基因转录的信使RNA（mRNA）为模板，逆转录（反转录）成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA（目的基因）。
（2）基因工程中常用的受体细胞有细菌、真菌、动植物细胞。
若将真核基因在原核细胞中表达，对该目的基因的基本要求是除去内含子。
（3）假设以大肠杆菌质粒作为运载体，并以同一种限制性核酸内切酶切割运载体与目的基因，将切割后的运载体与目的基因片段混合，并加入DNA连接酶。
连接产物至少有3种环状DNA分子，它们分别是运载体自连的、目的基因片段自连的、运载体与目的基因片段相连的环状DNA分子。
6、（10浙江卷）在用基因工程技术构建抗除草剂的转基因烟草过程中，下列操作错误的是（A）
A、用限制性核酸内切酶切割烟草茶叶病毒的核酸B、用含除草剂的培养基筛选转基因烟草细胞
C、用DNA连接酶连接经切割的抗除草剂基因和载体D、将重组DNA分子导入原生质体
7、（10福建卷）红细胞生成素（EPO）是体内促进红细胞生成的一种糖蛋白，可用于治疗肾衰性贫血等疾病由于天然EP0来源极为有限，目前临床使用的红细胞生成素主要来自于基因工程技术生产的重组人红细胞生成素（rhEPO）期间要生产流程如右图。
（1）图中①所指的是技术。
（2）图中②所指的物质是，③所指的物质是。
（3）培养重组CHO细胞时，为便于清除代谢产物，防止细胞严物积累对细胞自身造成危害，应定期更换。
（4）检测rhEPO外活性需用抗rhEPO单克隆抗体。
分泌单克隆抗体的细胞，可由rhEPO免疫过的小鼠B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合而成。
（1）PCR
（2）mRNArhEPO（3）培养液（4）杂交瘤
8、（10全国2）下列叙述符合基因工程概念的是（C）
A、B淋巴细胞与肿瘤细胞融合，杂交瘤细胞中含有B淋巴细胞中的抗体基因
B、将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株
C、用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株
D、自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上
9、（10广东卷）新技术的建立和应用对生物学发展至关重要
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