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2、叶绿素的提取

在研钵中放入几片（约5g）菠菜叶（新鲜的或冷冻的都可以。

如果是冷冻的，解冻后包在纸中轻压吸左水分）。

加人10mL2:

1石油醚和乙醇混合液，适当研磨。

将提取液用滴管转移至分液漏斗中，加人10mL饱和NaCl溶液（防止生成乳浊液）除去水溶性物质，分去H2O层，再用蒸馏水洗涤两次。

将有机层转入干燥的小锥形瓶中，加2g入无水Na2SO4干燥。

干燥后的液体倾至另—锥形瓶中（如溶液颜色太浅，可在通风柜中适当蒸发浓缩）。

“叶绿素提取和分离”实验改进（3）

1．提取液的改进

除丙酮外，也可用酒精替代，结果大致相同。

和酒精相比，丙酮有一定毒性，因而不妨换一下；另外一种提取液是：

在加入丙酮2～3ml后，再加入2ml石油醚，可以提高胡萝卜素提取效果，色素带分离现象更明显。

2．层析液的改进

层析液是一种脂溶性很强的有机溶剂，教材上给出了两种层析液配方：

一种是93号汽油，另外一种为20份石油醚，2份丙酮，l份苯混合而成。

采用下列配方实验效果也不错：

（1）四氯化碳加少许无水硫酸钠；

（2）95％的酒精；

（3）9份95％酒精加1份苯；

（4）20份汽油，2份丙酮，2份石油醚，1份苯。

其中，采用配方（4）效果最好，配方

（2）经济而且简便一些，但效果有一定折扣。

3．设立对照实验

设立一个空白对照组，在其他条件完全相同的情况下，一个画滤液细线，而另外一个不画，结果进行对照，消除“不同色带是层析液在滤纸上扩散后留下的颜色”的怀疑。

这样同时也培养严谨的实验作风，体现生物学科研的基本原则。

为了强调不要使层析液浸没滤液细线的意义，也可以设立这样一个浸没滤液细线的对照组，结果会发现色素被溶解下来，而无法分离。

4．实验方法探索

本实验不仅可用条形滤纸进行层析，还可以采用圆形滤纸层析办法：

取平面培养皿1只，铺一层细纱（厚约0．5cm），将滤纸剪为圆形放人培养皿中，在圆形滤纸中央点上滴2滴色素提取液，静置约1min，然后依次滴35滴层析液，每滴中间间隔30s，然后盖上培养皿盖，几分钟后，可以观察结果会得到近似同心圆的4个色素环，由内而外分别是黄绿色、蓝绿色、黄色、橙黄色。

此实验关键有两点：

一是几次滴液体要在同一点上，否则不能形成圆环；二是滴层析液的量和时间要掌握好，否则会影响效果，甚至失败。

“叶绿体中色素的提取和分离”实验改进

（2）

1．提取色素

为了得到墨绿色的色素滤液，于实验前2～3天，取质地柔软、深绿色的草本植物的叶片放在通风处阴干。

研磨时，所取叶片要除去粗的叶脉和叶柄。

向研钵中加入少量二氧化硅和碳酸钙，进行研磨。

待研磨充分后，再加入少量氯化钠和适量丙酮，就出现了深绿色的液体，液体经脱脂棉过滤后就得到了墨绿色的色素滤液。

2．划滤液细线

用毛细吸管吸取色素滤液，采用毛笔的执笔方式握住毛细吸管，悬腕，沿滤纸条上的铅笔划线作快速的划动，重复2～3次，就可以得到细、匀、齐的滤液细线。

3．分离色素

（1）采用小试管法取长15cm、直径15mm的小试管，试管塞用橡皮塞。

在橡皮塞的中央用刀片刻一细槽，然后将划过滤液细线的滤纸条无色素的一端，插入橡皮塞的细槽中。

向小试管内加入3．5ml层析液，将滤纸条慢慢地垂直插入层析液中，橡皮塞要塞紧小试管。

注意滤液细线不能没及层析液。

（2）采用培养皿法不用滤纸条，也不划滤液细线，而取直径为10cm的干燥圆形定性滤纸，用毛细吸管吸取色素滤液，在滤纸的中央点成圆形的色素斑。

重复4～5次。

然后取一枚缝衣针，穿一条细棉线，在棉线末端打个结，将针穿过滤纸上的色素斑中心，在距线结约4cm处剪断棉线。

取直径l0cm的培养皿一套，向培养皿底中加入5ml层析液。

把上述圆形滤纸扣在培养皿底上面，无线结的一面朝下，棉线则浸没在层析液中。

再将培养皿盖盖在滤纸上。

采用该方法，可以看到色素随层析液由线结处向周围均匀扩散。

因此得到的4条色素带呈同心环状，十分清晰。

而且层析时，滤纸上的色素不会没及层析液中，点色素斑比划滤液细线容易得多，实验效果非常显著。

纸层析

定义：

以滤纸为固定相支持物的层析分离系统

首先要了解什么叫分配层析；分配层析是利用混合物中各组分在两种不同溶剂中的分配系数不同而使物质分离的方法。

分配系数是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中的溶解达到平衡时，该溶质在两种溶剂中所具有浓度之比。

不同的物质因其在各种溶剂中的溶解度不同，因而也就有不同的分配系数。

分配层析中应用最广泛的多孔支持物是滤纸，其次是硅胶、硅藻土、纤维素粉、淀粉和微孔聚乙烯粉等。

下面主要介绍纸层析。

　　纸层析是以滤纸为惰性支持物。

滤纸纤维和水有较强的亲和力，能吸收22％左右的水，而且其中6~7％的水是以氢键形式与纤维素的羟基结合，在一般条件下较难脱去，而滤纸纤维与有机溶剂的亲和力甚弱，所以一般的纸层析实际上是以滤纸纤维的结合水为固定相，以有机溶剂为流动相，当流动相沿纸经过样品时，样品点上的溶质在水和有机相之间不断进行分配，一部分样品随流动相移动，进入无溶质区，此时又重新分配，一部分溶质由流动相进入固定相（水相）。

随着流动相的不断移动，各种不同的部分按其各自的分配系数不断进行分配，并沿着流动相移动，从而使物质得到分离和提纯。

　　纸层析是以滤纸作为支持物的分配层析。

滤纸纤维与水有较强的亲和力，能吸收22%左右的水，其中6%～7%的水是以氢键形式与纤维素的羟基结合。

由于滤纸纤维与有机溶剂左右的亲和力很弱，故而在层析时，以滤纸纤维及其结合的水作为固定相，以有机溶剂作为流动相。

纸层析对混合物进行分离时，发生两种作用：

第一种是溶质在结合于纤维上的水与流过滤纸的有机相进行分配（即液—液分离）；第二种是滤纸纤维对溶质的吸附及溶质溶解于流动相的不同分配比进行分配（即固—液分配）。

虽然混合物的彼此分离是这两种因素共同作用的结果。

　　在实际操作中，点样后的滤纸一端浸没于流动相液面之下，由于毛细管作用，有机相即流动相开始从滤纸的一端向另一端渗透扩展。

当有机相沿滤纸经点样处时，样品中的溶质就按各自的分配系数在有机相与附着于滤纸上的水相之间进行分配。

一部分溶质离开原点随着有机相移动，进入无溶质区，此时又重新进行分配；一部分溶质从有机相进入水相。

在有机相不断流动的情况下，溶质就不断地进行分配，沿着有机相流动的方向移动。

因样品中各种不同的溶质组分有不同的分配系数，移动速率也不一样，从而使样品中各组分得到分离和纯化。

　　可以用相对迁移率（Rf）来表示一种物质的迁移：

　　Rf＝组分移动的距离/溶剂前沿移动的距离

　　＝原点至组分斑点中心的距离/原点致溶剂前沿的距离

　　在滤纸、溶剂、温度等各项实验条件恒定的情况下，各物质的Rf值是不变的，它不随溶剂移动距离的改变而变化。

Rf与分配系数K的关系：

Rf＝1/（1+αK）。

　　Α是由滤纸性质决定的一个常数。

由此可见，K值越大，溶质分配于固定相的趋势越大，而Rf值越小；反之，K值越小，则分配于流动相的趋势越大，Rf值越大。

Rf值是定性分析的重要指标。

在样品所含溶质较多或某些组分在单相纸层析中的Rf比较接近，不易明显分离时，可采用双向纸层析法。

该法是将滤纸在某一特殊的溶剂系统中按一个方向展层以后，即予以干燥，再转向90，在另一溶剂系统中进行展层，待溶剂到达所要求的距离后，取出滤纸，干燥显色，从而获得双向层析谱。

应用这种方法，如果溶质在第一溶剂中不能完全分开，而经过第二种溶剂的层析能得以完全分开，大大的提高了分离效果。

纸层析还可以与区带电泳法结合，能获得更有效的分离方法，这种方法称为指纹谱法。

叶绿素提取的实验中，研磨叶片时为什么要加碳酸钙？

棉塞塞紧试管口的作用？

橡皮塞行吗？

碳酸钙是为了防止研磨中色素被破坏

棉塞是为了防止乙醇挥发

研钵中研磨叶片提取叶绿体色素时，至少要破坏几层磷脂分子，才能使色素分子溶于无水乙醇中?

答案5层。

哪5层？

色素存在于叶绿体的类囊体薄膜上，而叶绿体是双层膜结构的细胞器，所以要使色素溶于乙醇中，需要破坏一层细胞膜和叶绿体的双层膜，总共就3层磷脂双分子层，或6层磷脂分子层，数不出5来的。

叶绿素提取实验

实验中的提取液为什么是绿色的？

因为叶绿体中包含有叶绿素a、叶绿素b、叶黄素和类胡萝卜素这四种色素，其中叶绿素a和叶绿素b占的比重较大，它们的颜色都是绿色的，所以提取液就呈现绿色

叶绿素提取研磨叶片时，如果加入碳酸钙过多，会对实验有何影响？

？

叶绿素的提取中加入碳酸钙的原理是什么？

a'ming问：

在提取过程中用碳酸钙的目的是为了防止色素的破坏，其中的原理是什么？

：

钙离子取代镁离子，形成物理性质不变化学更稳定的化合物。

：

中和酸！

在酸的作用下，叶绿素中的镁可被H+所取代而成褐色的去镁叶绿素！

而且，除了代换Mg外，可使去镁叶绿素迅速分解出叶绿醇，并形成去镁叶绿酸，使溶液呈褐绿色，化学反应式如下：

（C32H30ON4Mg）COOCH3COOC20H39+2HCl=（C32H32ON4）COOCH3COOC20H39+MgCl2

叶绿素a去镁叶绿素a

（C32H32ON4）COOCH3COOC20H39+H2O=（C32H32ON4）COOCH3COOH+C20H39OH

去镁叶绿素a去镁叶绿酸a叶绿醇

山东秦莉：

在实验中加入少许二氧化硅的目的是为了研磨充分。

加入少许碳酸钙的目的是为了防止在研磨过程中，叶绿素受到破坏。

具体的情况是这样的：

叶绿体中的色素所处的环境具微碱性，实验中，由于研磨会使细胞结构遭到破坏，细胞液（具微酸性）流出，酸性的细胞液就会直接接触叶绿体中色素，致使叶绿素的分子结构遭到破坏，使叶绿素失镁，呈黄褐色，所以加入少许碳酸钙是为了中和细胞液的酸性，可起到保护叶绿素的作用

防止叶绿素的变化

叶绿素是一种天然色素，对光热、酸碱等比较敏感。

因此，在加工或贮藏过程中常易褪色或变色，对蔬菜成品感官质量影响巨大。

叶绿素的防护：

①碱处理。

将蔬菜在0.01%的氢氧化钠等稀碱溶液中浸泡20分钟-30分钟，叶绿素生成叶绿酸盐、叶绿醇等，颜色仍为鲜绿色。

但这种方法保绿时间不太长，会导致营养成分的严重损失。

②用铜或锌取代叶绿素中的镁。

可选用醋酸铜、硫酸锌溶液，浓度以0.1315%最好，ph值为9，浸泡30分钟。

生成铜和锌的衍生物可以长期保持绿色。

铜比锌活性高，取代反应速度快，但铜的残留量受质量标准限制，而锌的安全性较高，护绿效果也不差，成本也较低，可优先考虑使用锌制剂来保护蔬菜的绿色。

纸层析的问题

1.书上说固定相是滤纸吸附的水，流动相是有机溶剂，这里说的水和有机溶剂都是来自于展开剂吗？

所以展开剂必须包含水和有机溶剂是吧？

2.为什么点样的时候要点的小一点，而且要多次，点大了就没有现象吗？

为什么？

3.原理上的问题，我查了资料，说纸层析是因为各组分的溶解度不同，然后再流动相和固定相中分配不同，那为什么这样就能分离了呢？

而且我们实验做出来，比如铜离子和铁离子，最终两条色带是离开原点有一定距离的，为什么？

1.纸层析的话，固定相是滤纸纤维中所包含的水分，（你应该知道，做纸层析色谱的话，滤纸之前都是要经过处理的。

用化学试剂浸泡什么的，具体情况具体分析）所以这里说的水并不来自展开剂。

展开剂中也不是必须包含水和有机溶剂。

2.要是在纸层析色谱上点样太大的话，跑样的时候，会拖尾的。

要是只点很少的话，点又不容易观察，所以要多试几次确定点样量。

3.老实说，你这个问题有点纠结。

你是下了功夫的，可以看出。

那就请你想象一下哦，物质A共有10，在a点处流动相分配了7，在固定相分配了3；而流动相不断向上走（毛细效应），新的流动相在a点处又分配了原在固定相上的3中的0.7，即又分配走了2.1，现在固定相上就剩0.9了。

同时，a点稍稍往上一点的b点，固定相就分配到了流动相跑过来7的0.3，即2.1。

所以这个点就是这样一点一点往上爬行的。

同理，由于物质B和物质A的分配系数不一样