基因工程复习Word下载.docx

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逆转录酶---打破了遗传学（生物学）中心法则，使真核基因的制备成为

可能（ppt）\基因工程载体的研究与应用（课本）

6怎样进行基因工程？

——3大步骤（DNA体外重组，重组DNA导入宿主细胞后扩增和表达，基因工程后处理）

7.基因：

具有遗传效应的dna片段（某些病毒、细菌以rna为遗传物质），可以产生或影响某种表型，可以由于突变生成等位基因变异体

8限制酶:

是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列并由此切割dna双链结构的限制性核酸内切酶，切断的双链dna都具有5’磷酸基和3’羟基末端

【基因工程说到的限制酶是Ⅱ型酶，具有此类酶的微生物限制－修饰系统分别由限制酶和甲基化酶来完成。

Ⅱ型酶分子量小，仅需Mg2＋作为催化反应的辅因子，识别与切割位点相同，产生特异的DNA片段】

9命名（1973年Smith原则、Ⅱ型酶）

#根据分离此酶微生物的学名，一般取3个字母

①第一个字母大写——该微生物属名前的第一个字母（课本说明斜体老师ppt未指明）

②第二、三个字母小写——该微生物种名前的2个字母（课本说明斜体老师ppt未指明）

③第四个字母大写有变种或品系的第一个字母

④罗马字母Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ表示从一种微生物中发现了几种限制酶，按发现顺序排列

10.Ⅱ型限制性核酸内切酶的识别序列的特点

①一般为4－6bp的双链dna片段，特异性强

②双重旋转对称的回文结构，即180°

旋转对称GAATTC

CTTAAG

③识别简并序列，是指序列中有核苷酸位可以是不同的核苷酸【GTYRACY=C或T，R=G或A，YR=CG或CA或TG或TA】

④识别位点与切割位点不同，但二者距离是一定的（某些酶识别位点在切割位点附近）

远距离裂解酶Distantcleavage：

先识别（搞清楚）滑行一段距离再切

11.Ⅱ型限制酶的切口类型

①形成平头末端－TC↓GA—

－AG↓CT—

②形成5′－粘性末端5′-GAATTC-3′

3′-CTTAAG-5′

③形成3′－粘性末端3′-GAATTC-5′

5′-CTTAAG-3′

【粘性末端（stickyend）】限制酶切割产生2个突出的末端，放在一起可自发形成双链

限制性内切酶切割方法

完全酶切，是指使用的内切酶在目标片段上的切点全部切开，切出来的片段大小不会因为酶量增加，或酶切时间加长而发生改变

部分酶切是指只对片段上一部分酶切位点产生切割。

这种一般是在建库，或者需要酶切基因组后，获得一定大小范围内的片段而使用的酶切方法

单酶切法：

一种限制酶酶切，产生n或n+1片段

双酶切法：

两种限制酶酶切一种DNA分子，应用于定向克隆，DNA分子限制性酶切图谱

12标准酶解体系的建立

一个单位的限制性核酸内切酶定义为：

在合适的温度和缓冲液中，在50微升反应体系中，1h完全降解1微克底物dna所需的酶量【课本】

或酶活力单位：

在最适反应条件下，1小时完全切割1ugDNA所需要的酶活性定为1个酶活力单位（U）

【ppt】

Ps:

一般推荐稍过量的酶（2~5倍）和较长的反应时间，加入的酶过量，贮存液中的甘油会影响反应，而且许多限制性核酸内切酶过量本身可导致识别序列的特异性下降

13限制性核酸内切酶酶解反应注意事项

①大多数厂家供应的酶为浓缩液，取用时注意酶量，可以使用前用缓冲液稀释（尽快用完）

②应分装成小份，避免反复冻融

③确保酶体积不超过反应总体积1/10，否则酶液中的甘油会限制酶活性

④多加酶，少加底物，确保反应彻底

⑤用同一种酶切割多个dna样品时，可先计算出所需酶的总量，然后取出酶并用相应的1×

缓冲液稀释，再将酶稀释液分别加入不同的dna样品中

14影响限制性核酸内切酶星号活性的因素（切割不专一）

#在某种特定条件下，不在原来识别序列切割而产生非特异性切割的特性，称为星号活性

产生原因：

（1.高浓度甘油（>

5%）

（2.碱性pH（过高）

（3.低盐浓度（低离子强度）

（4.内切酶用量过大

（5.含有机溶剂，如乙醇

（6.Mn2+、Cu2+和Zn2+等非Mg2+的二价阳离子存在

15影响限制酶活性的因素

①酶的纯度②dna样品纯度---蛋白质，醇、酚，EDTA、SDS等均会降低催化活性③dna甲基化程度④酶切反应的温度与时间⑤dna分子的构型（超螺旋等，线性DNA分子效率高于螺旋DNA分子）⑥反应缓冲液⑦星号活性

16同裂酶（isoschizomers）：

许多不同来源限制酶识别顺序相同，切割方式可同可不同，此即同裂酶【识别顺序与切割方式同；

识别顺序同，切割位点不同；

识别与切割相同，但其中一酶可以切“修饰”（甲基化*），另一酶不能】

同尾酶（isoaudumers）：

识别顺序不同，产生粘性末端相同的酶。

【DNA重组】

17.DNA物理图谱：

标明限制酶在DNA分子上的限制位点数，限制性片段的大小及排列顺序的图谱称之或称限制性图

18.DNA连接酶：

催化两条dna链之间形成3’，5’-磷酸二酯键，使两个断裂的dna片段连接起来，被连接的dna链必须是双螺旋dna分子的一部分

19.dna连接酶的催化反应：

（1）需要ATP、Mg2+作辅助因子；

（2）缺刻（Nick）DNA也可作该酶的底物。

（3）对粘性末端催化活性大于平头末端（酶量1：

100）

20.逆转录酶：

也称反转录酶或RNA依赖的DNA聚合酶，能够以mRNA为模板逆转录合成其互补dna链（cDNA）

可应用两种引物：

①寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷即oligo（dT），可特异性互补于mRNA3’末端的寡聚腺苷酸poly（A）

【受长度限制，准确度比较高】

②随机序列的核苷酸寡聚体，一般10个bp（多样性）

【不受所测序列长度的限制】

21.不同来源的逆转录酶具有：

①逆转录酶以mRNA为模板合成cDNA

②DNA依赖DNApolymerase以ssDNA为模板，从引物的3′－OHDNA片段，按5′→3′合成DNA链

③rna酶H活性能从5’或3’方向特异性地降解rna，底物为rna-dna杂交分子中的rna链

④DNA内核酸酶Mn2＋存在时，逆转录酶能切cccDNA，此活性无专一位点，对热不稳定

⑤DNA解旋酶类似unwinding

22.DNA聚合酶：

以DNA为模板合成DNA

23.大肠杆菌dna聚合酶Ⅰ：

单条多肽链，具有3种活性

（1）大亚基5′→3′DNA聚合酶活性以ssDNA为模板，沿引物3′－OH方向，按模板顺序从5′→3′延伸

（2）大亚基3′→5′外切酶活性即从游离的3′－OH末端降解ssDNA或dsDNA，其意义在于识别和消除不配对的核酸，保证DNA复制的忠实性。

其dsDNA外切活性可被5′→3′聚合活性所抑制

（3）小亚基5′→3′外切酶活性从游离的5’端降解dsDNA成单核苷酸或寡核苷酸，也降解DNA:

RNA杂交体RNA成分

24.E.coliDNApolⅠ（DNApolⅠ）在基因工程的应用：

（1）高比活性放射性探针的制备

分子探针：

500bp左右的dna或rna，标记有同位素32P或非同位素标记（地高辛），要与目的基因互补

制备过程：

Mg2+存在时，用低浓度的DNA酶Ⅰ处理双链DNA，使之随机产生单链断裂，这时DNA聚合酶Ⅰ的5’-3’外切酶活性和聚合酶活性可同时发生。

外切酶活性可以从断裂处的5’端除去一个核苷酸，而聚合酶则将一个单核苷酸添加到断裂处的3’端。

由于dna聚合酶Ⅰ不能使断裂处的5’-P和3’-OH形成磷酸二酯键而连接，所以，随着反应的进行，即5’端核苷酸不断去除，而3’端核苷酸同时加入，导致断裂形成的切口沿着dna链按合成的方向移动，这种现象称为切口平移

如果在反应体系加入放射性核素标记的核苷酸，则这些标记的核苷酸将取代原来的核苷酸残基，产生带标记的dna分子，即dna分子杂交探针

（2）用于分子克隆（填充缺口利于重组）

DNApolⅠ能填充DNA的小缺口区（Gappedregion）→以便有效在体外用于DNA分子重组，如：

①切割cccdsDNA分子作载体时②插入一段不具粘性末端的DNA片段或加入1个同源顺序ssDNA片段③此时用DNApolⅠ填充这个缺口④再用ligase（3’-OH,P-5′）连接，组成重组DNA分子

（3）DNA序列分析

DNApolⅠ是3种测测序法（Sanger双脱氧法（测序自动化原理同Sauger双脱氧法），化学降解法和加减法）中的关键试剂→每个方法的成败都取决于DNApolⅠ从融合引物复制的ssDNA的能力（详参DNA的序列测定），这里仅作简介。

①Sanger双脱氧法

DNApolⅠ参入了2’3’－双脱氧核苷酸到相应的融合了的引物中，从而终止了链的进一步延伸，这样每个大小不同片段都带有ddNTP。

经过PAGE测出DNA顺序。

一代测序：

Sanger双脱氧法

二代测序：

焦磷酸测序

②化学降解法

当Mg2＋被Mn2＋取代时，DNApolⅠ有参与相应NTP取代dNTP的能力，参与的这个NTP可以作为1个特殊切割位点而被降解，得到带有NTP末端的DNA片段，这是化学法测序的主要原理。

③加减法

主要原理是在限制使用dNTP条件下加入DNApolⅠ和T4诱导的DNApol同时反应。

在减法反应中从4个反应混合物中每4个dNTP中减去1个。

生长链沿着引物延伸至缺少的那个dNTP为止。

在加法反应中所用的dNTP只有1种，如dATP，通过DNApol3′→5′外切酶活性使链终止在带有A的3’末端用其它3种dNTP进行类似反应，这样通过加或减法8个混合物的电泳结果即可推出DNA链的顺序。

25大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的大片段－Klenow片段酶

基因工程很多情况下，E.coliDNApolⅠ可用它的1个大片段Klenow片段酶代替。

该酶是枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶降解E.coliDNApolⅠ所得到的。

（1.Klenow大片段是一条多肽链，MW76KD，保留了E.colipolⅠ的5′→3′DNA聚合酶，3′→5′外切酶活性。

（2.Klenow在基因工程用于：

-----补平用限制酶消化dsDNA得到的5’粘性末端（即3’延伸末端）

5’－G-OHKlenow,Mg2＋5’－GAATT

3’－CTTAADntp3’－CTTAA

-----同上，填平过程中，用32pdNTP标记DNA片段3’末端。

-----cDNA克隆中，用于合成cDNA的第二条链。

-----在Sanger双脱氧法ddNTP系统进行序列分析。

26末端脱氧核苷酸转移酶

TdT简称末端转移酶，一种不同寻常的DNA聚合酶，能在二价阳离子作用下，催化DNA的聚合作用，将脱氧核糖核苷酸加到DNA分子的3’-OH末端。

与dna聚合酶不同的是，这种聚合作用不需要模板，合适底物为：

带有3’-OH突出末端的双链DNA，需要Mg2+；

对于平头末端或3’-OH凹陷末端的双链DNA和单链DNA，TdT催化的聚合作用仍能进行，但需要Co2+激活，且反应效率低

基因工程中用于：

（1）加一个互补同源多聚尾－>

到载体和cDNA－>

造成便于重组的人工粘性末端。

（2）在32p存在时，用于标记DNA分子的3’末端

27.碱性磷酸酶的性质

（一）去除DNA、RNA和dNTP的5ˊ磷酸根。

（二）去除5ˊ-P，防止DNA片段或载体自身环化。

（三）32p标记5ˊ—末端前，先用其去除DNA或RNA上的5ˊ-P。

28载体：

基因工程中携带外源基因进入受体细胞的“运载工具”，本质是dna复制子

载体特征：

独立和稳定的自主复制即有复制原点（ori）（必需）

酶切位点（MCS）不在dna复制必须区（必需）

大小适合

筛选标记如ampr、lacZ等

拷贝数高

使用安全

29.常用的载体类型

——质粒载体：

可以克隆最大的DNA片段在10kb左右

①克隆载体：

专用于基因或DNA片段无性繁殖的质粒载体

②表达载体：

专用于在宿主细胞中高水平表达外源蛋白质的质粒载体

两者区别：

表达载体必须含有强启动子，使外源基因有效的转录；

强启动子下游区和ATG（起始密码子）上游区有一个好的核糖体结合位点序列（SD序列），促进蛋白质翻译；

外源基因插入的下游区要有一个强转录终止序列

③穿梭质粒载体：

一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，而可以在两种不同的宿主细胞中存活和复制的质粒载体

——λ噬菌体：

最大克隆容量24kb

——人工染色体：

酵母人工染色体（YAC）（100~2000kb）、细菌人工染色体（BAC）（可达300kb）

YAC是目前能克隆最大DNA片段的载体，用较少的克隆就可以包含特定的基因组全部序列（容易产生嵌合体，某些克隆不稳定，由于重组所致）

BAC细菌F因子（细菌性质粒）为基础构建的细菌克隆载体（稳定、拷贝数低、比YAC易分离）

30转化transformation：

以质粒为载体的重组DNA分子引入受体细胞的过程（原核细胞和细菌老师PPT）

转染transfection:

以噬菌体或病毒为载体的重组DNA分子引入受体细胞的过程（真核细胞老师ppt）

转导transduction：

以噬菌体为媒介导入外源DNA分子，受体为原核细胞和细菌

与课本不一样，与XX百科不一样，讲课乱七八糟，谁知他对与错，好烦，还是以他ppt为主吧，烦呐

31多克隆位点：

多个限制酶识别的一段DNA顺序，以便克隆/插入外源基因/DNA片段

多聚接头（polylinker）有些质粒载体单一切点少，不能普遍使用。

为了扩大使用范围，

可以加一段有许多限制酶识别的单一切点的多聚接头

人工接头（linker）是用若干个bp组成的dsDNA片段，一般有一个或以上限制酶识

别与切割的顺序（人工合成含有酶切位点的寡核苷酸片段）

——T-A克隆

T载体两条链的5’端含有一个游离的T（PCR过程中，普通的Taq酶可在产物的3’端多加一个A

32重组dna技术：

基因工程的核心是基因重组

基因工程3个步骤：

dna重组；

重组dna导入宿主细胞--克隆扩增或表达；

基因工程的后处理

重组DNA操作一般步骤：

（1）获得目的基因；

（2）与克隆载体连接，形成新的重组DNA分子；

（3）用重组DNA分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传；

（4）对转化子筛选和鉴定；

（5）对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。

33载体选择主要考虑下述3点：

（1）构建DNA重组体的目的

（2）载体的类型（克隆载体、表达载体）

（3）载体MCS中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，使目的基因与载体易于连接，不产生阅读框架错位

34目的基因的制备和获取

目的基因：

是所要研究或应用的基因，也就是将要克隆或表达的基因或基因的一个片段。

获取目的基因是分子克隆中最重要的一步

制备方法：

——限制酶切除

（1）从原核基因组DNA制备－视原核基因组物理图谱已知或未知，克隆方法不同。

①已知物理图谱限制酶直接切除得到相关基因图谱

②未知物理图谱限制酶部分消化（控制酶量以及反应时间，以免所需基因被切断失

活）大小不同DNA片段混合物→插入载体→筛选阳性克隆

不同的酶在DNA上识别切割顺序不同，用同一种酶可能将所需DNA片段切断失活，换

上另一种酶就可能得到所需的完整基因片段。

（2）从真核基因组DNA制备－染色体步移法

真核基因组DNA不同长度DNA片段→电泳分离大小片段→特异探针杂交（southernblot）→初步鉴定是否含有目的基因→全部消化片段，插入适当载体制成基因组文库,特异探针杂交筛选→阳性克隆序列分析第一个克隆片段分离下一个克隆片段→DNA间重叠顺序鉴定其它克隆，逐步得到全部基因顺序

XX百科：

从第一个重组克隆插入片段的一端分离出一个片段作为探针从文库中筛选第二个重组克隆，该克隆插入片段含有与探针重叠顺序和染色体的其他顺序。

从第二个重组克隆的插入片段再分离出末端小片段筛选第三个重组克隆，如此重复，得到一个相邻的片段，等于在染色体上移了一步，故称之为染色体步移（ChromosomeWalking）

（3）从已克隆的DNA片段制备

——PCR或RT/PCR方法制备目的基因

（1）获取已知基因

据已发表的基因序列（或基因两侧序列已知）→设计/合成一对引物→PCR（基因组DNA为模板）/RT-PCR（mRNA为模板）→从组织或细胞制备目的基因

（2）构建RT/PCR文库法获取未知基因（获取的DNA片段往往是具有特定功能的目的基因）

据mRNA末端如polyA尾设计共同引物→将所用mRNA逆转录成cDNA并利用工具

酶在cDNA末端加尾→采用一对共用引物扩增所有cDNA，插入适当载体→构成

PCR－cDNA文库筛选

——计算机克隆－即利用GenBank信息，利用不同种属同源性设计引物，尝试获取未知基因片段

——化学合成法制备基因片段－用DNA合成仪，对目的基因分段合成、连接，可以得到所需的目的基因

——表达序列标签法分离目的基因

表达序列标签（expressedsequencetag,EST）:

指基因序列中一端含有足够结构信息能显示该基因与其他基因的差异，长度约100-500bp，获得这些EST序列数据后，再与GenBank核酸数据库进行相似性检测

35聚合酶链式反应（PCR）

PCR技术就是在体外中通过酶促反应有选择地大量扩增（包括分离）一段目的基因的技术

【加入4种物质】：

（1）作为模板的DNA序列；

（2）与被分离的目的基因两条链各自5’端序列相互补的DNA引物（20个左右碱基的短DNA单链）；

（3）TaqDNA聚合酶；

（4）dNTP（dATP,dTTP,dGTP和dCTP）

【变性、退火、延伸三步曲】：

变性：

双链DNA解链成为单链DNA

退火：

部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合

延伸：

以目的基因为模板，合成互补的新DNA链

【TaqDNA聚合酶】：

耐热的依赖于DNA的dna聚合酶，具有5’-3’外切酶活性和5’-3’聚合酶活性，无3’-5’的外切酶活性，失去了3’-5’方向的校正活性

高保真PfuDNA聚合酶，这种酶具有3’-5’方向的校正活性，这将有助于克服核苷酸错误掺入的问题

【引物设计的一般原则】

引物长度应在18~25bp,Tm接近72℃较佳；

引物中碱基分布随机；

GC碱基的含量在45％~55％；

上游引物以3’负链为模板设计；

引物自身连续互补碱基及引物之间连续互补碱基应小于4个

36DNA片断的重组连接：

是目的基因与载体的连接

（1）粘性末端连接

（1）用同一种酶分别切割目的基因/载体，然后进行连接。

优点：

二者产生相同的粘性末端，彼此很易按碱基配对退火

缺点：

自身环化可用高浓度的DNA（目的基因：

载体为3：

1）和碱性磷酸酶（AP：

BIP/CIP）处理载体，去除5‘－P使之不能自身环化，缺口在宿主内可得到修复

不能定向克隆/插入：

由于是单一位点，目的基因可以以不同方向插入载体。

对于克隆扩增问题不大，因为克隆上去的基因再重组时又要切下来；

对于表达载体目的基因必须按5’－3’方向克隆在启动子下游而不能反之。

此时只能靠运气了。

（2）利用相同的酶切位点——双酶双切点（定向克隆）

避免载体/目的基因的自身环化，提高连接效率；

可控制外源基因插入方向

（3）利用同裂酶，分别切割目的基因/载体，产生相同粘端，因而可以连在一起

同裂酶还是同尾酶？

（二）平头末端的连接

（1）同聚物加尾法：

利用末端转移酶分别在载体分子及外源双链DNA片段的3’端各加上一段寡聚核苷酸，人工制成粘性末端。

外源DNA片段和载体DNA分子要分别加上不同的寡聚核苷酸（如dA或dT）

（2）人工接头连接法

DNA连接子：

一段人工合成的具有平头末端的双链寡聚脱氧核糖核苷酸片段，长度一般为8~12个bp，其上有一个或数个限制性核酸内切酶的识别位点。

主要作用是在DNA末端添加一个限制性核酸内切酶的识别位点

（三）T载体（A/T克隆法）

在克隆PCR产物cDNA时可采用这一方法。

（1）cDNA末端添加AA利用Taqpol延伸活性，以不依赖模板的方式在已完成延伸的PCR产物的3’端添加AA（利用DNApol活性可成）。

（2）末端为TT的线性化的T载体可用下述4种方法得到：

①MbcⅡ、XcmⅠ或HphⅠ酶切产生单个T突出末端；

②用TdT将T加到酶切产生的平端的载体上；

③利用Taqpol的延伸活性，为了得到TT，在模板上先加上AA；

④T载体已商品化、买。

37重组dna导入受体细胞

——导入细菌细胞

（1）化学转化法：

感受态细胞（受体细胞摄入外源DNA的状态），一般用氯化钙处理受体细胞

（2）电击转化法

外加电场下，高压脉冲使受体细胞表面形成暂时性的微孔，脱离电场可复原。

操作简单，适用广

——导入真核细胞

（1）磷酸钙沉淀法：

目的基因片段与氯化钙适量混合，再加入一定量的磷酸盐溶液，形成DNA-磷酸钙共沉淀，后将沉淀加入细胞培养液中，通过受体细胞胞饮作用进入细胞质或进而转移到细胞核内

（2）脂质体介导法：

脂质体是磷脂在水中形成的一种由脂类双分子层围成的囊状脂质小泡结构，可以与dna通过静电结合或直接把dna包裹在其内，并透过细胞膜把dna运送到细胞内

（3）电穿孔转移法

（4）显微注射法：

非常有效的将核酸导人细胞或细胞核的方法。

这种方法常用来制备转基因动物，但不适用于需要大量转染细胞的研究

（5）基因枪法：

依靠携带了核酸的高速粒子而将核酸导人细胞内，这种方法适用于培养的细胞和在体的细胞

（6）病毒感染：

病毒颗粒是一类十分有效的基因释放系统

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