实时定量PCRWord格式文档下载.docx
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探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；
PCR扩增时，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
荧光域值（threshold）：
PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR3-15个循环荧光信号标准差的10倍，即threshold=10×
Sdcycle6-15。
荧光域值设定在PCR扩增的指数期。
）和标准曲线对样品中的DNA（orcDNA）的起始浓度进行定量的方法。
实时荧光定量PCR是目前确定样品中DNA（或cDNA）拷贝数最敏感、最准确的方法。
Real-TimePCRandConventionalPCR
常规PCRProcess
Intheory,productaccumulationisproportionalto2n,wherenisthenumberofamplificationcyclerepeats
Realityvs.Theory
Amplificationisexponential,buttheexponentialincreaseislimited:
-Alinearincreasefollowsexponential
-Eventuallyplateaus
常规PCR方法的局限性分析：
-无法对起始模板准确定量,只能对终产物进行分析
-必须在扩增后用电泳方法分析,费时费力而且EB有毒
-无法对扩增反应实时检测
定量的最佳时期
Quantitativeinformationcomesfrommonitoring
theearlystagesofamplification
荧光定量PCR和常规PCR技术的区别
常规PCR是通过电泳对扩增反应的最终产物进行定性分析（定量不准确）；
荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA（orcDNA）的起始浓度进行定量的方法（准确定量）。
荧光定量PCR的原理
荧光定量PCR检测时,在普通PCR的基础上加入的荧光化合物可分为非特异性的嵌入荧光染料及特异性荧光（引物）探针两大类型。
前者是利用嵌入荧光染料检测,只是简单地反映PCR反应体系中总的核酸量,是一种非特异性的检测方法。
后者由于增加了探针的识别步骤,特异性、专一性更高。
二者各有优缺点,在不同的研究目的中被应用。
（生物秀实验频道）
它们的基本原理是:
扩增呈指数增长,在反应体系和条件完全一致的情况下,样本DNA含量与扩增产物的对数成正比,由于反应体系中的荧光染料或荧光标记物（荧光探针）与扩增产物结合发光,其荧光量与扩增产物量成正比,因此通过荧光量的检测就可以测定样本核酸量。
非特异性的嵌入荧光染料（Non-specificDNAbindingdyes）
SYBR®
GreenI
Gold
EthidiumBromide
DNAbindingdyes
TheintercalationdyebeginsaddingattheExtensionstep.Whentheproperwavelengthisapplied,thefluorescenceofbounddyesisveryhighoverbackground.SybrGreen=495nm
非特异性的嵌入荧光染料评价
优点：
与特异性的荧光探针相比价格便宜
只需要设计PCR引物
缺点：
由于它和模板的结合是非特异性的，它可以和所有的双链DNA包括引物和非特异性扩增产物结合，不能真实反映目的基因的扩增情况。
EvaluatePrimerSpecificity
UsingMeltCurveAnalysis
EvaluatePrimerPairEfficiencies
Byrunningserialdilutionsoftemplateasstandards
特异性的荧光探针
-特异性的荧光探针是把荧光化合物标记到特异性的寡核苷酸上形成荧光标记的DNA探针。
通过探针与PCR产物特异性的结合,在PCR过程中可对产物实现均相、实时、定量检测,也适用于多通道检测。
-TaqMan探针
TaqMan探针是一段5’端标记报告荧光基团（R）,3’端标记淬灭荧光基团（Q）的寡核苷酸,其序列与模板DNA中的一段完全互补。
当探针单独存在时,由于荧光共振能量转移的发生,R的荧光受到Q的猝灭。
在PCR过程中,由于TaqDNA酶的5’-3’外切酶活性的作用,使探针的5’端的R被切断,加大了与Q的距离而使荧光恢复。
一分子的产物生成就伴随着一分子的荧光信号的产生。
随着扩增循环数的增加,释放出来的荧光基团不断积累。
因此,Taqman探针检测的是积累荧光。
Cleavage-basedassay:
TaqMan™
Again,sameasthebasicPCRreaction.
However,aTaqManprobeisadded.
Notethatthereactionisquietwhenintact.
TheExtensionanddetectionstepisa4stepprocess.
1）StrandDisplacement-TheprobeandTaqPolymerasecomesincontact.
2）Cleavage-Theprobeiscleavedthroughthe5’to3’exonucleaseactivityofTaqDNApolymerase.
TaqMan探针评价
荧光信号强
与其它探针相比设计简单
可用于多通道检测
可用于SNP的检测
比DNA结合染料价格高
CtvalueandReal-TimeQuantitativePCRTheory
Ct值
（ThresholdCycle）
PCR扩增过程中，扩增产物荧光信号超过基线值（进入指数增长期）时的循环数。
一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：
荧光背景信号阶段,荧光信号指数扩增阶段和平台期。
在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。
而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。
PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。
只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。
为了定量和比较的方便，在实时荧光定量PCR技术中引入了两个非常重要的概念：
荧光阈值和CT值。
荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。
每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT值。
Thisslideillustratesthatthereisalargedifferenceintheend-pointvaluesofidenticalreactions.Thisisauniformityexperimentinwhich5mLofareactionwasmadeandthen50uLfromthisreactionmixwaspipetedintoeachwell.Theend-pointvaluesrangefrom~450-750rfu,howevertheregionindicatedisveryreproducible.
[Bepreparedtoexplainwhythesevaluesmayvary,frompreviousslide:
canbeduetoenzymeexhaustion,reactants-dNTPs,Mg2+,primers-limiting,toomuchDNAbeingmadewhichinterfereswithothernewsynthesis]Noticethattheplateauphasehasstartedwhenendpointvaluesarereached
ThresholdCycle,CT
Correlatesstronglywiththestartingcopynumber
Islinearwiththelogofstartingcopynumber
Practicewiththeanimationsoyouunderstandthetimingofthisslide（ifyouhaven’tuseditbefore）-asktheaudiencetoparticipateinthis,itisagoodwayforyoutodeterminethedifferentcomfortlevelsyouraudiencehaswiththeCtconcept.
Seenextslideforrelationshipbetweendilutionseriesandthresholdcyclevalues.
Ct值与模板起始浓度的关系
-模板起始浓度越高，Ct值越小
-Ct值与模板起始拷贝数的对数存在线性关系
如果模板浓度增加1倍，Ct值就提前1个循环到达
如果模板浓度减少1倍，Ct值就滞后1个循环到达
MathematicImplications
IdealPCR
1CTDifference=2folddifferenceinstartingtemplateamount
3.3CTDifference=10folddifferenceinstartingtemplateamount
FurtherelaborationontheexponentialnatureofPCR.
Themathematicexpressionthatdescribestheprocessisshown.
Somebasicimplicationsarelisted.
绝对定量可以得到某个样本中基因的拷贝数和浓度
PlotofCtversuscopynumber.
NotetheDynamicRangeof101to1010.
相对定量（两个样本中的基因表达水平进行比较）
Determineschangesinsteadystatetranscriptionofageneorgenes
Expressionofthegene/sofinterestisnormalizedagainstareferencegene/s（housekeepinggene/s）withnoorinsignificantexpressionvariation
Examplesofsomereferencegenes/housekeepinggenesused:
b-Actin,GAPDH,18srRNA
b-2Microglobulin,Cyclophilins
溶解曲线（MeltCurve）
OnlypossiblewithDNABindingdyes（SYBRGreenI）andaftercompletedrealtimePCR
Determinesthetemperatureatwhich50%oftheDNAmoleculesseparateintotwostrands-or“melts”apart
DiscriminatesbyMeltingTemperature（Tm）,Tmisdependenton:
-sequence（G/Ccontent）
-length
Fluorescencevs.Temperature
Thesecondfigureistherawdata.
Wearerecordingfluorescencevstemperature.
Weseeaslowdecreaseinfluorescencethatisnon-specific.
Wethenseeaninflectionpoint.
ThisrapiddecreaseinfluorescenceisduetothemeltingofdoublestrandedDNA.
AsthisDNAdisassociatestheSYBRgreenisreleasedandnolongerfluoresces.
ThecenteroftheinflectionpointistheTm,thepointatwhichhalfoftheDNAhasdisassociated.
Thethirdfigureisthenegative1stderivativeofthesecondgraph.
Thisallowsustobettervisualizeinflectionpointsthatmaybeontopofeachother.
ThecenterofthepeakistheTmofthePCRproductandeachpeakrepresentsanindividualproduct.
溶解曲线检测引物特异性
Meltcurveshowingtwoamplifiedproducts
Youcanusemeltcurvetocheckthespecificityofyourreaction.Hereyoucanseeclearlythatmorethanoneproductisbeingmade-youshouldcheckthespecificityofyourprimerandtargetsequencesinBLASTandalsorunitonagel.
实时荧光定量PCR技术的应用
目前实时荧光PCR技术已经被广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域。
其中最主要的应用集中在以下几个方面：
1.DNA或RNA的绝对定量分析。
包括病原微生物或病毒含量的检测,转基因动植物转基因拷贝数的检测，RNAi基因失活率的检测等。
2.基因表达差异分析。
例如比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异（如药物处理、物理处理、化学处理等），特定基因在不同时相的表达差异以及cDNA芯片或差显结果的确证
3.基因分型。
例如SNP检测，甲基化检测等。
随着实时荧光定量PCR技术的推广和普及，该技术必然会得到更广泛的应用。
iQ5操作流程
开机后，双击桌面上的Bio-RadiQ5FASRelease图标
，进入操作软件的主界面：
在Workshop界面下进行程序的编辑。
单击左上方的“Protocol”按钮，从文件夹中调出已编辑好的程序，或者点击左下角绿色框中的“Edit”按钮，进入PCR程序设置页面：
通过左边的“＋”或“×
”按钮来增加或减少Cycle或Step，并在对应的位置输入各步反应的温度及时间、循环数等。
在需收集荧光的Step右方PCR/MeltDataAcquisition选项下点击下拉按钮，选择“RealTime”，即选择在该步收集荧光信号。
如许制作熔解曲线，则紧接PCR程序，通过“＋”或“×
”按钮来添加制作熔解曲线所需的步骤，制作熔解曲线时，需收集荧光的Step右方PCR/MeltDataAcquisition选项下点击下拉按钮，选择“MeltCurve”。
在Workshop界面下，单击左上方的“Plate”按钮，点击右下角绿色框中的“CreatNew”按钮，进入Plate设置页面：
在SalmpleVolume选项中选择：
25；
SealType选项中选择：
DomedCap；
VesselType选项中选择：
Tubles；
按照Plate设置的位置，将反应管放入PCR仪中的对应位置，在在Workshop界面下，单击左上方“RunSet”按钮，将编辑好的PCR程序与设置好的Plate相匹配，点击右上方的“Run”进入程序运行页面，继续单击“BeginRun”按钮，根据提示，将结果文件保存到特定的文件夹中，反应即进入运行状态。
实时定量PCR技术综述
作者：
佚名来源：
基莱生物科技时间：
2007-12-18
实验仪器大全实验试剂大全
一．基本原理
1.PCR反应动力学
右图为PCR反应曲线（横坐标为循环数，纵坐标表征产物量），不同的曲线代表初始模板量不同的
PCR反应。
PCR反应的动力学公式为：
Cn=C0（1+E）n
其中C0和Cn分别为初始模板和n循环的拷贝数，n为循环数，E为扩增效率（0≤E≤1），理想状态下（即每个循环中所有模板均与引物结合并等到扩增），E为1。
由上图可知，只有在线性区段E值才为定值，这样才能通过检测Cn定量C0，由于终点检测不能保证在线性区段，所以重复性不好，实时检测（每个循环检测一次）技术解决了这个问题。
2.定量PCR原理
定量PCR是将待测标本与一系列浓度（C0）已知的标准品在同一条件下共同扩增，并进行实时检测，根据标准品的检测值及已知的C0值作出标准曲线，如右图（横作标为的C0对数值），再根据待测标本的检测值在标准曲线上查到待测标本的C0值。
3.信号产生
目前定量PCR技术信号产生都是基于FRET
（fluorescence
resonance
energy
transfer）的原理，即在一定波长的光激发下，一个荧光基团A发光，并且被邻近的另一个荧光基团B吸收，使荧光基团B发光。
如检测荧光基团A，应在FRET（荧光共振能量转移）消除后；
如检测B，则应在FRET发生时检测。
根据信号产生方式的不同可将定量PCR技术分为三类：
TaqMan
Probes技术；
Hybridization
Molecular
Beacons技术。
Probes技术（右图A）是Perkin
Elmer公司1995年研制，利用热稳定DNA聚合酶5’→3’外切酶活性，将TaqMan
探针5’端荧光基团切去，使之与3’端荧光基团分离、荧光淬灭消失，在特定波长下检测5’端荧光基团即可表征PCR产物的量。
Probes技术（右图B）是Roche公司建立的，PCR反应退火过程中，两个探针与模板杂交（相邻一个碱基），发生FRET，这时检测第二个荧光基团即可表征PCR产物的量。
Probes技术要求热稳定DNA聚合酶不具备5’→3’外切酶活性，而是在引物延伸过程中被取代，使探针可在下一循环再与模板杂交，如探针被降解，可导致定量不准。
Beacons技术（上图C）利用茎环结构的探针，当形成茎环结构时，发生荧光淬灭，退火过程中，探针与模板杂交，荧光淬灭消失，在特定波长下检测5’端荧光基团即可表征PCR产物的量。
二.荧光标记
1.TaqManProbes
TaqMan探针通常在5’端以荧光基团FAM标记，靠近3’端以荧光基团TAMRA标记，3’端磷酸化以防止探针在PCR扩增过程中被延伸。
下表列出了两种荧光基团的吸收及发射波长。
FAM
TAMRA
吸收波长
492
547
发射波长
518
573
2.HybridizationProbes
Hybridization探针技术中，上游donorProbe3’端以荧光基团Fluorescein标记；
下游acceptorProbe5’端以Roche的LC-Red640标记（当用双荧光基团时还可同时使用LC-Red705），3’端磷酸化以防止探针在PCR扩增过程中被延伸。
也有文献报道acceptorProbe5’端以Cy5标记，下表列出了各种荧光
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