高中生物人教版选修1教学案专题五 课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段含答案文档格式.docx

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三、PCR技术的实验操作

1.实验用具

（1）PCR仪：

该仪器能自动调控温度，实现DNA的扩增。

如果没有PCR仪，可用3个恒温水浴锅代替，操作时按程序在3个水浴锅中来回转移PCR反应的微量离心管。

（2）微量离心管：

总容积为0.5mL，实际上是进行PCR反应的场所。

（3）微量移液器：

用于向微量离心管中转移PCR配方中的液体。

2.注意事项

（1）为避免外源DNA等因素的污染，实验中使用的一些用具在使用前必须进行高压灭菌。

（2）所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在－20℃储存。

（3）在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头必须更换。

四、DNA含量的测定

1.原理：

利用DNA在260_nm的紫外线波段的吸收峰曲线来测定相应含量。

2.计算公式

DNA含量（μg/mL）＝50×

（260_nm的读数）×

稀释倍数。

1．PCR技术控制DNA的解聚与结合是利用了DNA的（　　）

A．特异性　　　　　　　B．稳定性

C．热变性D．多样性

解析：

选C　DNA分子在80～100℃的温度范围内变性，双链解开成单链；

当温度缓慢降低时，又能重新结合形成双链。

2．标准的PCR过程一般分为变性、复性、延伸三大步，这三大步需要的温度依次是（　　）

A．92℃、55℃、72℃B．72℃、55℃、92℃

C．55℃、92℃、72℃D．80℃、55℃、72℃

选A　当温度上升到90℃以上（90～96℃）时，双链DNA解聚为单链，称之为变性；

当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；

当温度上升到72℃左右（70～75℃）时，溶液中的四种脱氧核苷酸（A、T、C、G）在TaqDNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，称为延伸。

3．PCR实验中用到微量离心管、缓冲液和蒸馏水，使用前必须进行的关键步骤是（　　）

A．反复洗涤B．用酒精擦洗

C．高压灭菌D．在－20℃保存

选C　在PCR实验中，为了避免外源DNA等因素的污染，微量离心管、枪头、缓冲液和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。

同时也不能忽视其他操作步骤，如缓冲液和酶应该分装成小份，并且在－20℃保存。

1．生物体内的DNA复制与PCR反应的比较

体内DNA复制

PCR反应

不

同

点

解旋

在解旋酶的作用下，边解旋边复制

加热至90℃以上时，双链全部解开

解旋酶、DNA聚合酶

耐高温的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）

一小段RNA

RNA或单链DNA分子片段

合成子链

一条子链连续合成，另一条子链不连续合成

两条子链都是连续合成

温度

体内温和条件

高温

相同点

①都需提供DNA复制的模板②都需要四种脱氧核苷酸原料③都需要分别与两条模板链相结合的两种引物④子链延伸的方向都是从5′端到3′端

2．PCR的反应过程

（1）变性：

当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链，如图。

（2）复性：

当系统温度下降至50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，如图。

（3）延伸：

当系统温度上升至72℃左右时，溶液中的四种脱氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，如图。

3．PCR反应的结果

从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸。

这样，DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数形式扩增。

[题组冲关]

1．PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比，主要有两点不同，它们是（　　）

①PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA或RNA

②PCR过程不需要DNA聚合酶

③PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的

④PCR过程中，DNA不需要解旋，直接以双链DNA为模板进行复制

A．③④　　　　　　　　　B．①②

C．①③D．②④

选C　PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比较，主要有两点不同：

①PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA或RNA，长度通常为20～30个核苷酸；

②PCR过程中，DNA解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的。

2．在进行DNA亲子鉴定时，需大量的DNA。

PCR技术可以使样品DNA扩增，获得大量DNA克隆分子。

该技术的原理是利用DNA的半保留复制，在试管中进行DNA的人工复制（如图，图中黑色长条是引物）。

在很短的时间内将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，使实验室所需的遗传物质不再受限于活的生物体。

（1）PCR需要模板DNA、引物、______________________________________________和

____________________等条件，其中的引物实质上是一种_________________。

（2）图中的变性、延伸分别是指______________________________________________、

________________________。

（3）某样品DNA分子中共含3000个碱基对，碱基数量满足：

（A＋T）/（G＋C）＝1/2，若经5次循环，至少需要向试管中加入______个腺嘌呤脱氧核苷酸。

（不考虑引物所对应的片段）

（4）若下图为第一轮循环产生的产物。

请绘出以a链和b链为模板经PCR扩增的产物。

（1）PCR技术中除需要模板DNA、引物、四种脱氧核苷酸外，还需要耐热的DNA聚合酶等条件，其中的引物是一种单链DNA分子或RNA分子。

（2）变性的实质是DNA双链解旋；

延伸是以DNA单链为模板，按碱基互补配对原则合成子链的过程。

（3）由（A＋T）/（G＋C）＝1/2可知A∶T∶G∶C＝1∶1∶2∶2，所以A的比例为1/6，在一个DNA分子中的数量为3000×

2×

（1/6）＝1000（个），5次循环形成的DNA数为32个，所以需要利用原料合成的DNA数相当于32－1＝31（个），至少需腺嘌呤脱氧核苷酸数为31×

1000＝31000（个）。

（4）画图的关键是注意引物A、B的位置和所对应的模板链。

答案：

（1）四种脱氧核苷酸　耐热的DNA聚合酶　单链DNA分子或RNA分子　

（2）模板DNA双链解旋形成单链　在DNA聚合酶的作用下，脱氧核苷酸聚合形成新的DNA链　（3）31000　（4）如图

1．实验操作步骤

2．DNA含量的测定

DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA含量有关。

可以利用DNA的这一特点进行DNA含量的测定，具体方法如下：

注：

计算公式中的50代表在波长为260nm紫外波段照射下，吸收峰为1时，DNA含量为50μg/mL。

3．使用PCR仪的具体实验操作顺序应为（　　）

①设计好PCR循环程序　②按配方准备好各组分

③用微量移液器向微量离心管中依次加入各组分　④进行PCR反应　⑤离心，使反应物集中在离心管底部

A．②③⑤④①B．①⑤③②④

C．②③⑤①④D．④②⑤③①

选C　PCR反应的操作步骤一般分为准备（包括将配方所需各组分放于实验台上）→移液→混合→离心→反应。

因PCR仪是一种能自动控制温度的仪器，设计好循环程序就可以进行反应了。

4．下列有关PCR操作过程的叙述，错误的是（　　）

A．PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌

B．PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在－20℃储存

C．PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化

D．在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换

选C　为了防止外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌；

所用的缓冲液及酶应分装成小份保存，并使用一次性枪头。

在冰箱中放置的缓冲液和酶从冰箱中取出后应放在冰块上缓慢融化，而不能迅速融化。

[随堂基础巩固]

1．PCR技术是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术，下列说法不正确的是（　　）

A．PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性、复性和延伸三步

B．PCR所用的解旋酶和DNA聚合酶都具有耐高温的特性

C．延伸的温度大于复性的温度，而小于变性的温度

D．PCR技术可用于基因诊断、判断亲缘关系等

选B　PCR技术需要耐高温的DNA聚合酶，不需要解旋酶。

2．DNA的复制需要引物，其主要原因是（　　）

A．可加快DNA的复制速度

B．引物可与DNA母链通过碱基互补配对结合

C．引物的5′端有助于DNA聚合酶延伸DNA链

D．DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链

选D　DNA的两条链是反向平行的，为了明确表示DNA的方向，通常将DNA的羟基（—OH）末端称为3′端，而磷酸基团的末端称为5′端。

DNA聚合酶不能从5′端开始合成DNA，而只能从3′端延伸DNA链。

因此DNA复制需要引物，当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。

3．符合PCR反应条件的一项是（　　）

①稳定的缓冲液环境　②DNA模板　③合成引物

④四种脱氧核苷酸　⑤TaqDNA聚合酶　⑥DNA解旋酶

⑦限制性核酸内切酶　⑧温控设备

A．①②③④⑤⑥　　　　　B．①②③④⑤⑥⑦⑧

C．③④⑤⑥⑦⑧D．①②③④⑤⑧

选D　PCR反应模拟生物细胞内DNA复制的条件，只是不需要解旋酶，也不需要基因工程的工具酶（限制性核酸内切酶）。

4．PCR仪实质上是一台自动调控温度的仪器，它调控不同温度的目的是（　　）

①95℃使DNA分子变性，失去生物活性

②95℃使DNA分子变性，解开螺旋

③55℃使DNA分子开始复制、延伸

④55℃使DNA分子的两条单链分别与两种引物相结合

⑤72℃使DNA分子开始复制、延伸

⑥72℃使DNA分子恢复双螺旋结构，恢复活性

A．①③⑤B．②③⑤

C．②④⑤D．②④⑥

选C　PCR技术在温度上升到90℃以上时，双链DNA解旋变为单链；

当系统温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；

当系统温度上升到72℃左右时，溶液中的四种脱氧核苷酸（A、G、C、T）在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。

5．如图表示PCR扩增的产物，请分析它是哪次循环的产物（　　）

A．第一次循环B．第二次循环

C．第三次循环D．第四次循环

选A　在PCR反应中以引物为标记，第一次循环时，以加入的DNA为模板，两条DNA链可分别由引物Ⅰ和引物Ⅱ与其结合，并在DNA聚合酶的作用下延伸，所以，形成的每个子代DNA中只有一种引物。

从第二次循环开始，第一次产生的DNA分子又可作为模板参与反应，形成的DNA分子中，只有两个仅一端含有引物，其他DNA分子两端都含有引物。

6．如图所示为DNA变性和复性示意图，相关说法正确的是（　　）

A．向左的过程为加热（80～100℃）变性的过程

B．向右的过程是DNA双链迅速制冷复性

C．变性与在生物体内解旋过程的实质相同

D．图中左侧DNA片段共有4个游离的磷酸基团、4个3′端

选C　DNA体外的变性和体内的解旋，其实质是相同的，都是使氢键断裂，DNA双螺旋打开，只是体内解旋需要解旋酶，体外变性需高温条件。

7．PCR技术是把DNA片段在体外酶的作用下，合成许许多多相同片段的一种方法，利用它能快速而特异地扩增任何要求的目的基因或DNA分子片段，它的基本过程如下图

所示：

图中短线表示每次扩增过程中需要的引物。

每个引物约含20个脱氧核苷酸，并分别与两条单链DNA结合，其作用是引导合成DNA子链。

（1）PCR与体内DNA复制的不同之处主要表现在温度上，在PCR中先用95℃高温处理的目的是________________；

而这一过程在细胞内是通过________实现的。

（2）DNA子链复制的方向是____________，这是由于____________________________

________________________________________________________________________。

（3）在PCR技术中所需要的引物实质上是一种________________。

若将1个DNA分子拷贝10次，则需要在缓冲液中至少加入________个引物。

（4）假定DNA片段含200对脱氧核苷酸，经3次扩增，从理论上计算需要________个游离脱氧核苷酸。

在PCR中先用95℃高温处理的目的是使DNA分子中的氢键断裂，两条链解开，使DNA分子解旋，形成单链。

引物是一种单链DNA或RNA分子，它能与解开的DNA母链的3′端结合，为DNA聚合酶提供结合位点，使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸，从而决定了DNA子链复制的方向是从子链的5′端到3′端。

在DNA分子扩增时，需要2种引物，由于新合成的子链都需要引物作为复制的起点，故所需的引物数目等于新合成的DNA子链数目，若将1个DNA分子复制10次，则需要的引物为2×

210－2＝（211－2）个。

扩增3次一共形成8个子代DNA片段，需游离的脱氧核苷酸数为（8－1）×

400＝2800个。

（1）使DNA变性（或使DNA的两条链解开）　解旋酶　

（2）从5′端到3′端　DNA聚合酶只能从引物的3′端连接单个脱氧核苷酸分子　（3）单链DNA或RNA分子　211－2　（4）2800

[课时跟踪检测]

一、选择题

1．关于PCR的说法，不正确的是（　　）

A．PCR是体外复制DNA的技术

B．PCR过程中只需要一个模板DNA、两个引物分子、大量脱氧核苷酸原料

C．TaqDNA聚合酶是一种热稳定的DNA聚合酶

D．PCR利用的是DNA双链复制原理

选B　PCR技术是一种在体外迅速扩增DNA片段的技术；

PCR过程除需要DNA分子双链作为模板、两种引物分子、大量脱氧核苷酸原料外，还需要酶等条件；

TaqDNA聚合酶是一种耐热的DNA聚合酶；

PCR技术的原理和DNA的复制原理是一样的，都是半保留复制。

2．关于DNA聚合酶催化合成DNA子链的说法，正确的是（　　）

A．TaqDNA聚合酶是从深海生态系统中发现的

B．DNA聚合酶能特异性地复制整个DNA的全部序列

C．TaqDNA聚合酶必须在每次高温变性处理后再添加

D．DNA聚合酶是以DNA为模板，使DNA子链从5′端延伸到3′端的一种酶

选D　TaqDNA聚合酶是在热泉中发现的。

PCR扩增的是引物之间的固定长度的DNA序列。

TaqDNA聚合酶能耐高温，所以在反应体系中可反复利用而不用另外再添加。

DNA聚合酶不能从头开始催化合成DNA，而只能从DNA单链的3′端延伸子链。

3．多聚酶链式反应是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温复性及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，其简要过程如图所示。

下列关于PCR技术的叙述不正确的是（　　）

A．PCR技术是在实验室中以少量DNA制备大量DNA的技术

B．反应中新合成的DNA又可以作为下一轮反应的模板

C．PCR技术中以核糖核苷酸为原料，以指数方式扩增

D．应用PCR技术与DNA分子杂交技术可以检测基因突变

选C　PCR技术是体外大量扩增DNA的技术，即以少量DNA制备大量DNA的技术；

PCR技术的原理是DNA复制，反应中新合成的DNA又可以作为下一轮反应的模板，所需原料是脱氧核苷酸，以指数方式扩增；

应用PCR技术与DNA分子杂交技术可以检测基因突变。

4．PCR一般要经过三十多次循环，从第二次循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链作模板时将（　　）

A．仍与引物Ⅰ结合进行DNA子链的延伸

B．与引物Ⅱ结合进行DNA子链的延伸

C．同时与引物Ⅰ和引物Ⅱ结合进行子链的延伸

D．无须与引物结合，在酶的作用下从头合成子链

选B　当由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链作模板时，此单链引物端为5′端，因此与它互补的子链应从另一端开始合成，即与引物Ⅱ结合延伸DNA的子链。

5．在PCR扩增DNA的实验中，根据设计，一分子DNA经30次循环后，应得到约230个DNA分子，但结果只有约210个DNA分子。

出现该现象的原因可能是（　　）

①循环次数不够　②TaqDNA聚合酶活力不够或其活性受到抑制　③引物不能与亲链结合　④系统设计欠妥

A．①②③B．①②④

C．①③④D．②③④

选B　①循环次数过少，产物的量比预期的少；

②TaqDNA聚合酶活力不够或其活性受到抑制会导致扩增效率低，得到的产物比预期的少；

③如果引物设计不合理，则无法进行扩增；

④PCR系统设置不妥，将达不到预期的效果。

6．下列关于PCR技术的叙述，正确的是（　　）

A．PCR技术建立在对扩增的目的基因序列完全已知的基础上

B．该技术需要解旋酶和热稳定的DNA聚合酶

C．该技术需要一对特异性的引物，要求一对引物的序列是互补的

D．该技术应用体内DNA双链复制原理，也需要模板、原料、酶等条件

选D　PCR技术不必知道目的基因的全部序列，只需知道部分序列，就可根据已知序列合成引物。

PCR技术不需要解旋酶。

PCR技术需要引物，但引物的序列不能是互补的，否则，在复性时，两种引物通过碱基互补配对结合而失去作用。

7．下列有关PCR的叙述，正确的是（　　）

A．PCR所需要的引物只能是RNA

B．PCR所需要的原料是核糖核苷酸

C．PCR所需要的酶在60℃会变性

D．PCR需要在一定的缓冲液中进行

选D　PCR所需的引物是一小段DNA或RNA。

PCR所需要的原料是脱氧核糖核苷酸。

PCR所需要的酶是耐高温的TaqDNA聚合酶。

8．在PCR的实验操作中，下列说法正确的是（　　）

①在微量离心管中添加各种试剂时，只需要一个枪头

②离心管的盖子一定要盖严

③用手指轻弹离心管壁

④离心的目的是使反应液集中在离心管的底部

C．②③④D．①③④

选C　在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换，以确保实验的准确性；

盖严离心管口的盖子，防止实验中外源DNA污染；

用手指轻轻弹击离心管的侧壁，使反应液混合均匀；

离心的目的是使反应液集中在离心管的底部，提高反应效果。

9．复性温度是影响PCR特异性的较重要的因素。

变性后温度快速冷却至40～60℃，可使引物与模板发生结合。

PCR的结果可不考虑原来解旋开的两个DNA模板链的重新结合，原因不包括（　　）

A．由于模板DNA比引物复杂得多

B．引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞

C．加入引物的量足够多而模板链数量少

D．模板链加热解旋已经变性不可能再次结合

选D　DNA双链变性解旋后是可以再次结合的，只不过是在PCR中，引物量较多，与DNA模板链结合机会大，而原来两条母链再次结合的机会小。

10．如图中PCR第二轮产物a、b、c、d分别是以PCR第一轮产物的哪一条单链DNA为模板复制产生的（　　）

A．②①③④B．①③④②

C．①②④③D．①②③④

选D　因为PCR的反应过程需要引物，在第二轮循环的产物中，a、d的引物分别为Ⅰ、Ⅱ，无引物的为模板链（即①、④），则b、c的模板链分别为②、③。

二、非选择题

11．PCR技术是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术，下图表示合成过程，请据图分析回答：

（1）A过程高温使DNA变性解旋，对该过程的叙述，正确的是（　　）

A．该过程用到耐高温的解旋酶破坏氢键

B．该过程用到限制酶破坏磷酸二酯键

C．该过程不需要解旋酶的作用

D．该过程与人体细胞的过程完全相同

（2）C过程要用到的酶是________________。

这种酶在高温下仍保持活性，因此在PCR扩增时可以______加入，________（填“需要”或“不需要”）再添加。

PCR反应除提供酶外，还需要满足的基本条件有______________________________________________________

______________________________________________________________________________。

（3）如果模板DNA分子共有a个碱基对，其中含有胞嘧啶m个，则该DNA复制10次，需要加入胸腺嘧啶脱氧核苷酸____________________个。

（4）PCR中由碱基错配引起的变异属于________________________________________。

假设对一个DNA进行扩增，第一次循环时一条模板链上发生碱基错配，之后正常配对，则扩增若干次后检测所有DNA的扩增片段，与原DNA相应片段相同的占________________

________________________________________________________。

（1）高温所起的作用类似于解旋酶，使双链DNA变为单链。

（2）C过程是PCR技术的延伸阶段，当系统温度上升至72℃左右时，溶液中的四种脱氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。

TaqDNA聚合酶具有耐高温的特性，所以一次性加入即可。

（3）在一个双链DNA分子中，C＋T占碱基总数的一半，则T的数目为（a－m）个，复制10次，新增加了（210－1）个DNA分子，故需补充胸腺嘧啶脱氧核苷酸的数目为（210－