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2.免疫学检测

2.1血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验

HA和HI简单、快速、特异性好，但是操作繁琐费时，不能用已知HA亚型的抗血清检出禽流感新的HA亚型。

HI试验是WHO进行全球流感监测所采用的普及方法。

[5]一般先将可疑病料接种适龄鸡胚或细胞进行病毒分离，然后用HA试验检测出培养物是否具血凝素活性，再用已知阳性血清进行HI试验来验证。

[6]

2.2琼脂扩散试验（AGP）

AGP试验是用来检测A型流感病毒群特异性血清抗体，适用于鉴定所有A型流感病毒。

AGP试验操作简单，既可以定性又可以定量。

但敏感性差，易有有假阳性。

现已在AIV快速定型双扩散法[7]基础上建立了AGP诊断试剂盒。

AGP试验可以用敏感性、准确性良好的尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳法作为补充或辅助诊断手段。

[8]

2.3乳胶凝集试验（LAT）

LAT是以聚苯乙烯乳胶颗粒作为载体，吸附特定的抗原或抗体，当遇到血清中相应的抗体或处理过的病料中相应的抗原成份时，会形成肉眼可见的凝集颗粒。

[9]乳胶凝集试验操作简单、快速，不需要贵重的仪器设备和操作技能。

由于LAT所识别的IgM抗体是机体最先产生的抗体，LAT更适合进行早期诊断。

2.4神经氨酸酶抑制试验（NIT）

神经氨酸酶抑制试验是依据A型流感病毒的表面抗原神经氨酸酶的特性来鉴定流感病毒。

vanDeusonRA等[10]对常量NIT试验方法进行改进建立了平板微量NIT方法,不仅降低了抗原用量,而且可对多种分离物同时进行抗原分类。

此法一直被世界卫生组织推荐用于神经氨酸酶亚型的分类。

[11]

2.5病毒中和试验（NT）

NT试验是最经典的血清学方法之一,只有在抗体与病毒粒子上的表面抗原相对应,特别是与吸附到宿主细胞上的病毒抗原相对应时,才能在实验中取得满意效果。

[12]因此,NT试验是最敏感而特异的血清学方法,检出率也相当高，但操作繁琐且耗时。

2·

6免疫荧光技术（IFA）　

免疫荧光技术是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体上，与其相应的抗原结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应,包括直接荧光抗体法和间接荧光抗体法,后者较常用。

IFA特异性强、敏感性好,[13]可用于鉴定和定位禽流感病毒感染的细胞中特异性的抗原,主要是核蛋白和基质蛋白抗原。

但是对抗原制备要求高,结果判定的客观性不足,出现假阳性的概率较高,因此,只是一种筛选方法。

2.7酶联免疫吸附试验（ELISA）　

ELISA是用酶标记抗原或抗体,通过显色反应来检测相应抗体或抗原的一种方法,可进行定性和定量测定。

ELISA方法的敏感性和特异性与包被抗原或抗体的纯度直接相关,高于传统方法的AGP试验和HAI试验,而且更快速，既可检抗原也可检抗体。

目前已建立了禽流感病毒重核蛋白ELISA法、禽流感抗体斑点-ELISA（Dot-ELISA）检测法等。

[14]

8侧流免疫测定（LFA）

　LFA技术的检测原理是乳胶珠或胶体金标识的抗原-抗体复合物侧向迁移,直至遇到在一种固定表面（膜支持物）上的抗体,结合滞留后可肉眼观察显色反应。

LFA具有分析迅速的优点,可用于现场检测。

[15]

9胶体金免疫层析法（GICA）　

GICA应用免疫层析的原理,将抗原或单克隆抗体固定在层析介质上,待检标本的抗原或抗体通过毛细脉动,结合后滞留在该位区,根据胶体金免疫显色反应做出判断。

GICA是一种快速简便的方法,可在15~30min内获得诊断结果,具有不需实验设备、可用肉眼判定、试剂用量少、稳定性和重复性好,特异性强等优点,适合于现场快速初筛定性。

缺点是对禽流感检测的敏感性较低，容易漏检或假阳性,不易定量,不方便大批量的集约操作。

[16]

2.10压电生物传感器检测仪

该技术采用戊二醛交联法,将禽流感H5、H9、禽流感全抗原（HI）等抗原固定于银电极表面,制成多通道的压电免疫传感器,判定标准为检测阳性样品的响应值与阴性样品的噪声值之比>

3，可用于AIV的定性定量检测。

生物传感器灵敏度高、响应快,不需要标记,可同步进行禽流感病毒的定性定量和分型诊断检测,具有高灵敏度、小体积、快速、低成本、便于携带等优点。

[17]但需要压电蛋白芯片分析仪等仪器设备,限制了其实际应用。

3.分子生物学检测方法

3·

1逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）　

RT-PCR是提取禽流感病毒的总RNA,用逆转录酶反转录成cNDA后进行PCR扩增。

整个检测过程约需8h,可检测出禽流感病毒核酸分子,并可用针对性的引物来进行分型鉴定。

RT-PCR禽流感病毒检测法仅用一对引物即可扩增出H1~H15的HA基因,产物由双脱氧核酸链止法测序分析。

[18]PCR-ELISA方法能从更微量的水平检测禽流感病毒,既适合于快速的定性筛选又可进行定量分析。

[19]多重RT-PCR（mRT-PCR）能一步同时检测多种亚型的禽流感病毒,更为快速和经济。

采用巢式或半巢式RT-PCR可提高扩增的灵敏度和特异性,并使检测的亚型范围进一步扩展。

[20]

2实时荧光定量RT-PCR（RRT-PCR）　

实时荧光定量是在反应体系中利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线或公式法对禽流感病毒的RNA模板进行定性和定量分析的方法。

荧光化学方法应用较多的为TaqMan水解探针、FRET杂交双探针和SYBRgreen荧光染料法等。

RRT-PCR使检测时间缩短为4h,敏感性接近鸡胚病毒分离;

探针的应用使假阳性达到最小化,并且采用全封闭反应,杜绝了PCR产物的气溶胶污染。

[21]RRT-PCR技术实现了PCR从定性到量的飞跃。

3环介导的等温扩增（LAMP）　

LAMP是一种新的基因高效扩增技术,反应体系简单,由模板DNA、4对特异性引物、BstDNA聚合酶、dNTP和反应缓冲液构成。

在65℃左右的恒温条件下,BstDNA聚合酶催化引物反复进行高效的链置换反应和环介导扩增,整个反应约需30~60min。

[22]LAMP法是一种简便、快速、高度特异性的基因扩增法,不需要特殊的试剂和仪器设备,因此,可以建立起总成本低廉的检测体系,适用于现场监测和大量样品高通量筛检,在禽流感检测和防治领域具有广阔的应用前景。

4依赖核酸序列的扩增（NASBA）　

NASBA是一项以RNA为模板,以转录原理为基础的快速等温扩增技术。

该技术需使用逆转录酶、T7RNA聚合酶和RNA酶H（RNaseH）,以及2条特别设计的寡核苷酸引物,NASBA技术从禽流感病毒核酸分离、扩增以检测整个过程只需4h,灵敏度与鸡胚培养相当,扩增效率高于传统RT-PCR,在适宜条件下,扩增倍数可达1012。

NASBA技术操作简便,一般为42℃等温扩增,不需要PCR仪等设计,并且在即使有基因组DNA污染的情况下也可以特异性扩增出目的RNA。

NASBA是全封闭反应,产物为RNA,不易对实验仪器造成交叉污染,[23]而且还是一种高通量的方法,非常适合于大规模样品的筛查。

在NASBA技术上进一步发展出的实时NASBA技术,[24]使检测的敏感性和特异性更为提高

5基因芯片（genechips）　

基因芯片是指将大量的核酸分子以大规模阵列形式固化在载玻片等芯片载体上,通过与Cy3、Cy5荧光素标记的样品进行核酸杂交,检测杂交信号的有无和强弱进而判断样品中被检分子的种类和数量。

根据探针的特点不同可以将基因芯片技术分为3类:

cDNA芯片、寡核苷酸芯片、基因芯片。

目前,最新的核酸探针检测技术是以微电子为平台的芯片技术，该项技术通量高，,检测禽流感病毒的时间7h左右，[25]但是操作较繁琐,检测成本及硬件要求均较高,离实际应用还有一段距离。

3.6核酸探针与原位杂交技术

核酸探针是指带有标记物的已知序列的核酸片断，能与其互补的核酸序列杂交，形成双链。

原位杂交是经适当处理后使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交。

地高辛标记cDNA探针具有较好的特异性和敏感性，为从分子水平探讨AI的发病机理和临床早期快速诊断提供了新的研究手段。

制备NP保守性的探针感染病毒MDCK细胞进行原位杂交检测禽流感病毒RNA的方法，[26]不但能很好地呈现病毒和细胞的位置关系，而且具有较好的特异性和灵敏性。

3.7基质检测法

将色素原标记在新合成的Neu5Ac上会形成基质底物，当A型和B型流感病毒存在时，基质底物就被病毒包膜表面存在的基质分解，释放出色素原，通过光测定装置就可以检测出。

其敏感性高达96%，特异性为77%，阳性符合率59%，阴性率98%。

[27]但是基质检测法只能用于A型和B型流感病毒的检测，而不能用于C型流感病毒的检测。

该方法简便、快速及敏感性高,适用于各个基层及病毒实验室进行临床诊断。

3.8焦测序技术

焦测序技术即在核酸聚合酶的作用下,依次加入4种脱氧核糖核苷酸中的1种,如果加入的脱氧核苷酸与模板互补,则发生延伸反应,释放出等摩尔量的PPi;

PPi在三磷酸腺苷硫酸化酶的催化作用下,与5’-磷酸化硫酸腺苷（APS）反应生成三磷酸腺苷（ATP）;

ATP激活荧光素酶（1uciferase）发出荧光,产生的荧光强度与结合的dNTP数成正比;

如果加入的dNTP与模板不互补,则无荧光产生,以此实时测定DNA序列。

[28]该技术因其可进行短序列实时检测,定量准确,易于自动化,能实现高通量大样本的快速检测,对AIV检测技术的发展具有巨大的推动作用.

4.新兴检测方法

4.1质谱分析

质谱分析是一种物理方法,其基本原理是使试样中各组分在离子源中发生电离,生成不同荷质比的带正电荷离子,经加速电场的作用形成离子束进入质量分析器。

在质量分析器中再利用电场和磁场使之以相反的速度色散,将它们分别聚焦而得到质谱图,从而确定其质量。

将RT-PCR和电喷雾色谱相结合的技术可快速检测出92种哺乳类动物及禽类流感分离株,推断出30种不同的H及N型病毒（其中包括29种AIVH5N1分离株）,准确率高达97%,时间只要短短几小时。

同时该技术可以检测混合感染的病毒样品，可用于病毒的各个亚型及未知核酸序列病毒新变异株的大规模检测，[29]但该技术所需的质谱仪价格昂贵,目前还只局限于在少数的研究机构中使用。

4.2纳米生物传感器

纳米生物传感器将目前纳米科技研究的两大新技术,即分子旋转马达和量子点技术,与微流体通道技术等有机的结合到了一起,[30]该技术可以在几分钟内获得诊断结果,节省了送样品到实验室的时间,大大提高了诊断效率，具有快速、灵敏、便宜等优点,除可用于AIV检测之外,还可用于肿瘤、艾滋病等其他重要病症的检测，[31]大范围内推广可行性高。

5.展望

通过对禽流感病毒传统以及发展中检测方法的综述我们可以看出各种检测方法都各有利弊，（各方法的原理、特点或忧缺点等详见表

（一））除了不断改进现有的检测方法,人们也正积极地致力于将一些新兴技术运用于禽流感的检测,虽然这些技术还未能大规模的推广和使用,但它们却显示出了巨大的潜力,随着分子生物学、核酸扩增、生物传感器、免疫学各项技术的发展，以及对禽流感病毒分子生物学知识的更深入的认识，禽流感病

毒的检测技术会不断涌现出更快速、更具有灵敏性和特异性的方法。

表

（一）

检测方法

原理/特点/操作方法

优点

缺点

参考文献

病毒分离与鉴定

将无菌条件下采集的病料经适当处理后接种9-11日龄的鸡胚，收取死亡鸡胚尿囊液测定其血凝活性，如果抗禽流感的血清能抑制血凝现象的话，那样就证明有禽流感病毒存在。

经典的检测方法其检测结果准确可靠，灵敏，极少量病毒也可检出。

其操作程序繁杂，检测周期长，费用高，实验室要求高（国家规定必须在P3级实验室进行），高致病性的毒株还易致鸡胚死亡大面积应用推广受到较大限制。

[2]

电镜检测技术

用电子显微镜观察AIV粒子形态，确定病毒的有无。

快速、准确、直观

检验结果与样品制备技术、取病料的部位和时间有关，且本方法不能用于亚型及致病性的测定。

[3]、[4]

血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验

HI可以检测血清中的抗体水平,也可以鉴定病毒,用抗不同血凝素的抗血清,由血凝抑制试验来确定HA亚型。

简单、快速、特异性好，实验条件要求较低，可定性定量

受各亚型间无交叉反应的限制，不能用已知HA亚型的抗血清检出禽流感新的HA亚型。

在HI试验中常会造成一定数量的假阳性，该技术不如琼脂扩散试验简便快捷。

[5]、[6]

琼脂扩散试验

其原理是利用可溶性抗原与抗体在电解质的参与下，在琼脂中扩散形成浓度梯度来检测A型流感病毒群特异性血清抗体

操作简单，既可以定性又可以定量

敏感性差，，但是试验受反应物浓度和时间的影响较大，易出现假阳性。

实验需要大量的抗原和抗体才出沉淀线,且需要至少24h才出结果

[7]、[8]

乳胶凝集试验

以聚苯乙烯乳胶颗粒作为载体，吸附特定的抗原或抗体，当遇到血清中相应的抗体或处理过的病料中相应的抗原成份时，会形成肉眼可见的凝集颗粒。

乳胶凝集试验操作简单、快速，不需要贵重的仪器设备和操作技能。

更适合进行早期诊断

[9]

神经氨酸酶抑制试验

NIT是依据A型流感病毒的表面抗原特性，特别是神经氨酸酶（NA）的特性来鉴定流感病毒

降低了抗原用量,且可对多种分离物同时进行抗原分类

[10]、[11]

病毒中和试验

以测定病毒的感染力为基础，人或动物免疫血清中的病毒特异性中和抗体与病毒表面蛋白结合，从而使病毒失去吸附和感染宿主细胞的能力。

结果的判定将依据定量病毒受倍比稀释免疫血清中和后的残余感染力。

敏感性、特异性好，检出率高

操作繁琐且耗时需要借助鸡胚或细胞培养病毒

[12]

免疫荧光技术

将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体上，与相应的抗原结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应,包括直接荧光抗体法和间接荧光抗体法,后者较常用。

特异性强、敏感性好、简便快速,可用于鉴定和定位禽流感病毒感染的细胞中特异性的抗原，在流感暴发期间,IFA比病毒分离鉴定更适合于快速诊断禽流感

缺点是对抗原制备要求高,结果判定的客观性不足,出现假阳性的概率较高，只是一种筛选方法

[13]

酶联免疫吸附试验

是在不影响酶活性和免疫球蛋白分子的条件下，使酶分子和免疫球蛋白分子共价结合成酶标记抗体。

酶标记抗体可直接或通过免疫桥与包被在固相支持物上待测定的抗原或抗体特异性结合，从而特异的定性、定量检测病毒的存在。

可进行定性和定量测定,简便，既可检抗原也可检抗体。

大大缩短了诊断时间，并且具有较高的特异性及灵敏性，结果判定不需要特殊仪器，可以用肉眼判断。

侧流免疫测定

乳胶珠或胶体金标识的抗原-抗体复合物侧向迁移,直至遇到在一种固定表面上的抗体,结合滞留后可肉眼观察显色反应。

分析迅速,可用于现场检测

胶体金免疫层析法（GICA）

应用免疫层析的原理,将抗原或单克隆抗体固定在层析介质上,待检标本的抗原或抗体通过毛细脉动,结合后滞留在该位区,根据胶体金免疫显色反应做出判断。

快速简便,不需实验设备、可用肉眼判定、试剂用量少、稳定性和重复性好,特异性强等优点。

对禽流感检测的敏感性较低（10ng/mL）,容易漏检或假阳性,不易定量,不方便大批量的集约操作。

压电生物传感器检测仪

采用特殊处理涂有高分子膜和结合有禽流感病毒单克隆抗体的压电晶片作传感器，与数据收集系统和液晶屏组成的AIV压电生物传感器检测仪，可以定性、定量检测禽流感病毒

灵敏度高、响应快,不需要标记,可同步进行禽流感病毒的定性定量和分型诊断检测,具有高灵敏度、小体积、快速、低成本、便于携带等优点。

需要压电蛋白芯片分析仪等仪器设备,限制了其实际应用。

[17]

逆转录-聚合酶链式反应　

提取禽流感病毒的总RNA,用逆转录酶反转录成cNDA后进行PCR扩增,可检测出禽流感病毒核酸分子,并可用针对性的引物来进行分型鉴定。

灵敏、特异、快速、准确

但其成本较高，试验过程复杂，对实验环境、仪器设备、操作人员等要求高。

同时干扰因素多，会出现假阴性或假阳性现象。

[18]、[19]、[20]

实时荧光定量

在反应体系中使用荧光化学方法,利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线或公式法对禽流感病毒的RNA模板进行定性和定量分析。

特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、操作简单、速度快、全封闭反应避免污染

操作较复杂，实验室条件较高，需要PCR仪，敏感度不如RRT-PCR

[21]

环介导的等温扩增　

反应体系由模板DNA、4对特异性引物、BstDNA聚合酶、dNTP和反应缓冲液构成。

在65℃左右的恒温条件下,BstDNA聚合酶催化引物反复进行高效的链置换反应和环介导扩增,

简便、快速、高度特异性的基因扩增法,不需要特殊的试剂和仪器设备,可以建立起总成本低廉的检测体系。

[22]

依赖核酸序列的扩增

以RNA为模板,以转录原理为基础，使用三种以及2条的寡核苷酸引物，在扩增步骤中生产出互补RNA序列的模板,可以根据需要选择电化学发光反应（ECL）和酶联法等进行定性和定量。

恒温反应，循环次数少，定性定量，用时少，效率高，操作简单，封闭反应避免污染，高通量

[23]、[24]

基因芯片

将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针,有规律地排列固定于支持物上,然后与待测的标记样品的基因按碱基配对原理进行杂交,再通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描,并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号作出比较和检测,从而迅速得出所需要的信息

高通量,适合大批样品的检测。

能在一个DNA芯片中同时、快速的鉴别出病毒及其各亚型,不需要再做进一步的检测。

操作较繁琐,检测成本及硬件要求均较高,离实际应用还有一段距离。

.[25]

核酸探针与原位杂交技术

原位杂交是经适当处理后使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交，因此原位杂交可以确定探针互补序列在胞内的空间位置。

其灵敏度高,检测样品数量大,需要的设备要求不

算高,价格相对便宜,

只能用于A型和B型流感病毒的检测，而不能用于C型流感病毒的检测。

[26]

基质检测法

将色素原标记在新合成的Neu5Ac上,就会形成基质底物,当A型和B型流感病毒存在时,基质底物就被病毒包膜表面存在的基质分解,释放出色素原,通过光测定装置就可以检测出。

[27]

焦测序技术

它是一种基于生物发光分析法测定焦磷酸（PPi）的测序技术,即在核酸聚合酶的作用下,依次加入4种不同的脱氧核糖核苷酸中的1种,如果与模板互补,则发生延伸应，ATP激活荧光素酶发出荧光,产生的荧光强度与结合的dNTP数成正比;

作简便,可实现高通量、自动化测定,不需要电泳及对样品标记和染色,结果准确重复性好。

[28]

质谱分析

基本原理是使试样中各组分在离子源中发生电离,生成不同荷质比的带正电荷离子,经加速电场的作用形成离子束进入质量分析器。

在质量分析器中再利用电场和磁场使发生相反的速度色散,将它们分别聚焦而得到质谱图,从而确定其质量。

准确率高，用时少，以检测混合感染的病毒样品且可用于病毒的各个亚型及未知核酸序列病毒新变异株的大规模检测

但该技术所需的质谱仪价格昂贵,目前不能普及

[29]

纳米生物传感器

把纳米技术应用于生物传感器，建立分子马达微动力生物传感器，可以快速检测疾病。

快速、灵敏、便宜，敏感性比血凝试验高四倍以上，除可用于AIV检测之外还可用于肿瘤、艾滋等其他重要病症的检测

纳米技术有潜在的危险,需加强安全性研究

[30]、[31]

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