适用于荧光成像的化学发色团与生物正交反应研究进展.docx

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适用于荧光成像的化学发色团与生物正交反应研究进展

适用于荧光成像的化学发色团与生物正交

反应研究进展

张艳①,陈鹏②,姚祝军①*

①南京大学化学化工学院,南京210093;

②北京大学化学与分子工程学院,北京100871

*联系人,E-mail:

yaoz@

2013-02-27收稿,2013-04-24接受

国家重点基础研究发展计划（2010CB833202）和国家自然科学基金（91213303）资助

摘要荧光成像是一种融合多门现代学科的显像方法,其运用荧光成像探针实现对细胞及动物体内的生物大分子的动态、可视化观察,为疾病的诊断与治疗提供了有力的方法.理想的荧光发色团和细胞环境友好的生物正交反应是构建性能优良的活细胞荧光成像探针的两大因素,本综述总结了近年来在荧光发色团及生物正交反应方面最新的研究进展.

关键词

荧光成像

生物大分子

荧光发色团

生物正交反应

定量生物学

荧光成像是融合了有机化学、光化学、生命科学等学科为一体的显像方法,其运用光化学原理,结合现代有机合成技术,设计和构建荧光功能分子,建立和发展细胞及动物体内的荧光成像方法,实现了对生物大分子的原位、实时、动态研究,为揭示生物机制、诊断与治疗疾病提供了有力的方法;这一领域凸显了现代多学科交叉的典型特点.这些研究中,针对具有重要生物学意义的大分子目标进行合理的标记方案设计并通过实验获得真实可靠的成像信息是十分关键的.为此,两个方面的保证是必需的:

第一,作为“报告者”的荧光发色团的化学和光学性质在实验体系下足够优秀;第二,获得的数据（往往是化学变化导致的光学性质改变）能够真实反映生物大分子定位和定量的变化信息.为了保证后者不为实验环境等背景因素所干扰,实验荧光探针（分子装置）和研究目标之间必须能专一性地相互识别.生物正交反应是指能够在生物体内的生理环境中发生,与其中的各种反应互不干扰,不会受到其中各种生物分子的影响,并且也不会对生物体或目标生物分子造成损害的一类化学反应.这类化学反应的发展能够使我们在分子尺度上修饰、标记和改造生物大分子,并由此探索细胞信号传导路径,揭示疾病发病机理,了解生命过程机制.生物正交反应最终将会实现对各种活体生物的生理过程进行调控,并对人类疾病的预防和治疗产生深远影响.将荧光发色团与能够发生生物正交反应的官能团相结合,即可利用生物正交反应实现对细胞内特定靶标分子的荧光标记与成像,相关的研究为当前化学生物学领域的前沿与热点.本文将结合实例从荧光发色团与生物正交反应两方面综述最新的研究进展.

1荧光发色团

为了适用于生物成像的需要,化学发色团通常需要满足以下条件:

（1）荧光分子具有较好的水溶性和生物兼容性;

（2）对细胞具有较好的穿透性,容易进入细胞;（3）激发波长和发射波长处于可见或近红外区,以具有较好的组织穿透性和避免较高的激发能量破坏生物体的生理结构.目前常用于荧光成像的发色团主要分为3类:

（1）基于有机小分子的发色团如香豆素、荧光素、罗丹明、BODIPY和箐染料等;

（2）基于纳米材料的发色团如量子点、上转换纳米颗粒等;（3）生物大分子类荧光成像材料,如绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白等.这些荧光发色团和成像物质的发展为科学家们了解生命体系的复杂过程提供了有效的工具.本部分将简要介绍这3类荧光标记物的性质、应用及与此相关的最新研究工作报道.

1.1有机小分子发色团

在数码时代彩色胶片市场日渐衰退的背景下,有机染料在影像技术领域又迎来了新的蓬勃发展.有机小分子发色团因其结构容易修饰,因此应用最为广泛.通过修饰,基于香豆素、荧光素、罗丹明、BODIPY和箐染料已经发展出了一系列的荧光发色团,其大多水溶性和生物兼容性较好,波长和性能通过结构修饰可调,已经被广泛发展成各种类型的荧光探针并应用到对各种生物分子的成像之中.如香豆素（coumarin）即是一类存在于植物界中的香豆素类化合物的母核（图1（a））,通过修饰其已经被发展成多种针对不同生物分子的荧光探针.锌离子（Zn2+）是神经系统中的一个重要的金属离子,其与许多的神经疾病如阿尔茨海默病和癫痫等都密切相关,因此Komatsu等人[1]针对Zn2+设计了一个基于香豆素的比例计量型荧光探针（图1（b））.该探针的最大吸收波长处于500nm左右,最大发射波长处于550nm左右,在与Zn2+结合后,其发射波长发生变化,558nm的发射增加而543nm的发射降低,因此可以用于对Zn2+的比例测量;其也已经被应用到对细胞及海马体组织中的Zn2+检测.双氧水（H2O2）分子也是生物体中一种重要的生物分子,与许多重要的生理疾病紧密相关.Du等人[2]则设计了一种以香豆素为基础的激活型荧光探针（图1（c））,该探针的最大吸收波长为400nm左右,而最大发射波长为480nm左右,且该探针在与H2O2作用后荧光可以增强5倍左右.为了研究抗生素类药物与细菌RNA间的作用,Xie等人[3]设计了一种以香豆素为基础的荧光共振能量转移（FRET）型荧光探针（图1（d））.该香豆素发色团吸收波长为400nm左右,发射波长为480nm左右,再结合发射波长处于400nm左右的尿嘧啶碱基,分别将这两个发色团接入抗生素和细菌RNA中,即可实现对两者之间作用的检测.

作为合成有机化合物,荧光素（fluorescein,图2（a））在蓝光或紫外光照射下可以发出绿色的荧光,是目前应用非常广泛的荧光发色团之一.Li等人[4]就以荧光素为基础设计了一种可以对组氨酸进行标记

图1香豆素类型发色团及荧光探针

图2荧光素类发色团及荧光探针

的荧光探针（图2（b））.该探针的最大吸收在480nm左右,最大发射在520nm左右,且在与组氨酸作用后,荧光增强;其也已经被成功用于对人血清中的组氨酸进行标记.利用光诱导的电子转移机制（PET）,Sparano等人[5]设计了一种自淬灭型的荧光探针（图2（c））.该探针在与RNA作用后,其PET过程会被破坏,因此荧光得以恢复.在荧光素中,还有一类应用最广泛的且已经商业化的发色团,即异硫氰酸荧光素（FITC,图2（d））,已经被广泛应用于对RNA,DNA,蛋白和细胞的标记中[6,7].

罗丹明（rhodamine）是指一系列相关的萤光酮杂环化合物（图3（a））,其结构与荧光素类似,但波长相对较长,最大发射波长可以达到600nm左右.同样利用PET机制,Nagano课题组[8]设计了一种可以靶向细胞中的活性氧（ROS）的自淬灭型荧光探针（图3（b））.该探针只有在遇到ROS时才会产生荧光,具有很好的灵敏性和选择性,而且其也被证实可以在细胞的线粒体中对ROS进行成像.类似地,同样对RSH有着很好的灵敏性和选择性的探针（图3（c））可靶向细胞中的活性巯基分子（RSH）产生荧光并已被成功用于对细胞的成像中.近来Nagano课题组[9]报道了另外一种对次氯酸（HOCl）敏感的且发射波长处于近红外区的罗丹明荧光探针（图3（d））.该探针在与HOCl作用后,五元环将打开,荧光得以恢复.该探针对HOCl有着极好的选择性和敏感性,且在细胞和动物体内均表现出了较好的成像能力.

氟硼二吡咯（BODIPY）是另外一种常用的有机发色团（图4（a））,其通常发红光且水溶性较好,因此应用比较广泛.目前,在BODIPY的基础上已经发展出了一系列水溶性更好且波长更长的发色团,并根据其自身性质也已经得到了针对不同生物分子的荧光探针.Akkaya课题组[10]设计了一种针对生物巯基分子的荧光探针（图4（b））,该探针的发射波长可以达到660nm左右,并且其自身带有聚乙二醇结构,具有很好的水溶性,适于生物体系检测.该探针利用PET机制,本身荧光处于淬灭状态,在遇到硫基分子后,荧光显著增强.Han课题组[11]设计了一种同时对HOCl和硫化氢（H2S）生物分子有响应的荧光探针（图4（c））,该探针同样基于PET机制,在与HOCl作用后,荧光显著增强;而在与H2S作用后,探针又回到原始状态,荧光减弱.体外实验证实该荧光探针对两种生物分子均有很好的选择性和敏感性,细胞实验也证

图3罗丹明类发色团及荧光探针

图4BODIPY类发色团及荧光探针

实该探针具有很好的细胞膜通透性,而且可以连续对两种生物分子进行检测.最近,大连理工大学彭孝军课题组[12]报道了一种基于BODIPY的、可以用作线粒体染色的荧光发色团（图4（d））.该发色团毒性小且稳定性较高,适用于长时间显影,其在线粒体标记中显示出了比商业化线粒体染色剂更好的潜力.

箐染料（Cyanine）是指发色团共轭体系两端建立在N-N原子间的脒离子插烯物（图5（a））,其分子可修饰性强,吸收和发射波长较长,可以达到近红外区,且量子产率较高,因此相比其他有机分子染料,箐染

图5箐染料类发色团

料最适于体内显影.其中有不少箐染料已经商业化,如Cy5.5（图5（b））,这些染料已经被运用于构建各种荧光探针并用于体内显影中[13,14].如Pham等人[15]合成了一种相比于传统箐染料稳定性更高、水溶性好且发射波长可以达到800nm左右的近红外箐染料（图5（c））,该发色团可用于靶向癌症抗原的多肽标记并成功用于活体显影中.彭孝军课题组[16,17]也设计合成了一系列的箐染料（图5（d））,这些箐染料的发射波长都处于800nm左右,量子产率较高.

1.2纳米材料发色团

由于有机小分子发色团量子产率相对较低,并不能完全满足体内显影的光强度需求.随着纳米技术的发展,量子点（QDs）以其较好的荧光性质吸引了科学家们的视线.相比于有机小分子发色团,量子点具有宽吸收、窄发射、高量子产率、优越稳定性和长荧光寿命等特性.另外,量子点在体内的循环时间较长,适于体内显影.这些优点,使得量子点已经发展成为一种广泛用于生物成像中的荧光发色团.目前应用比较广泛的量子点大都是拥有核-壳结构的无机纳米材料（CdSe@ZnS,图6）,再通过对其表面进行修饰使其带有羧基或者氨基以用于与其他生物分子相连.

通过将靶向整合素的短肽RGD接到量子点表面,量子点可以用于肿瘤血管靶向的体内成像[18].而将荧光素蛋白连接到量子点表面后,可以实现生物荧光共振能量转移（BRET）,并已成功用于体内成像中[19,20].另外将量子点作为FRET中发色团的一种,也已经实现了对各种蛋白酶的成像[21].这些例子都说明了将量子点作为发色团并用于体外、体内成像中

图6量子点类发色团的基本结构示意图

的潜力.

有机小分子发色团及量子点均属于常规荧光发色团,均由短波激发,发射长波.然而短波长的光在体内组织穿透性较差,而且生物体内的很多大分子在短波激发下会产生自身荧光,造成背景信号较深.与此相对,近红外光作为光源则可以规避这些缺点.近几年,拥有可以用近红光激发和发射紫外或近红外荧光特性的新型纳米材料-基于稀土元素的上转换纳米颗粒（upconversionnanoparticles）越来越引起人们的重视.该纳米材料同样拥有核-壳结构,目前最常用的结构为NaYF4（Yb,Er,Tm）@NaYF4（图7）.其原理基于其中相邻原子的能级轨道比较接近,在激发光的激发下,电子会从两个原子间的能级中连续跳跃,从而得到更高的能量[22].在电子回到基态时,则产生波长更短的紫外光或近红外光.目前常用的上