叶绿素实验报告.docx

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叶绿素实验报告

叶绿素铜钠的合成、分离、分析及结构测定

食品092

一、实验目的：

1、从蚕沙中提取叶绿素并计算提取率。

2、初步研究叶绿素合成叶绿素铜钠的工艺条件。

3、分析叶绿素铜钠产品的纯度并计算其产率。

4、通过试验提高综合能力及练习巩固各种相关操作。

二、产品验收指标

项目和指标

───────────────┬──────────

项目│指标

───────────────┼──────────

pH│9.0～10.7

1％│

E405nm≥│568

1cm│

消光比值│3.2～4.0

总铜（Cu）,％│4.0～6.0

游离铜（Cu）,％≤│0.025

砷（As）,％≤│0.0002

铅（Pb）,％≤│0.0005

干燥失重,％≤│4.0

硫酸灰分,％≤│36.0

───────────────┴──────────

三、实验原理:

叶绿素是一种含有卟吩环的天然色素，它与蛋白质结合存在于植物的绿叶和绿色的茎中，是植物进行光合作用所必须的催化剂，叶绿素难溶于水，而易溶于极性有机溶剂。

叶绿素有a和b两种，a为蓝黑色结晶

叶绿素是一种含有卟吩环的天然色素，在叶绿素的结构中，含有一个由四个吡咯环和四个次甲基交替相联形成的卟吩环．卟吩环闭合的共轭体系提供了包围镁离子（或其它相似离子）的刚性平面．

叶绿素的结构如图l所示：

蚕沙中含有丰富的叶绿素，其纯含量达0.8—1.0%，居所有天然色素之首，故可用蚕沙来提取叶绿素，由于叶绿素易溶于乙醚、苯、丙酮、乙醇的脂性溶剂，故可用乙醇、丙酮混合液来提取。

所得的叶绿素由于遇热、光、酸、碱等易分解，且又不溶于水。

110度左右会分解，故把叶绿素制备成叶绿素铜钠，其性质更稳定溶解性也会有所提高。

叶绿素分子中的镁原子和四个吡咯上的氮原子相结合，环上是双羧酸的酯，一个被四所酯化，另一个被叶醇基所酯化，故可以发生皂化反应生成钠盐：

Ｃ55Ｈ72Ｏ5Ｎ4Ｍｇ+2ＮａＯＨ=Ｃ34Ｈ30Ｏ5Ｎ4ＭｇＮａ2+ＣＨ3ＯＨ+Ｃ20Ｈ39ＯＨ

Ｃ55Ｈ70Ｏ6Ｎ4Ｍｇ+2ＮａＯＨ=Ｃ34Ｈ28Ｏ6Ｎ4ＭｇＮａ2+ＣＨ3ＯＨ+Ｃ20Ｈ39ＯＨ

在酸性条件下，叶绿素钠盐分子中的镁极易被氢原子取代生成褐色的叶绿酸：

Ｃ34Ｈ30Ｏ5Ｎ4ＭｇＮａ2+4Ｈ+=Ｃ34Ｈ34Ｏ5Ｎ4+Ｍｇ2++2Ｎａ+

Ｃ34Ｈ28Ｏ6Ｎ4ＭｇＮａ2+4Ｈ+=Ｃ34Ｈ32Ｏ6Ｎ4+Ｍｇ2++2Ｎａ+

叶绿酸可与铜盐在加热条件下生成叶绿素铜酸析出，将叶绿素铜酸溶于丙酮，再与碱反应生成叶绿素铜钠：

Ｃ34Ｈ34Ｏ5Ｎ4+Ｃｕ2+=Ｃ34Ｈ32Ｏ5Ｎ4Ｃｕ+2Ｈ+

Ｃ34Ｈ32Ｏ6Ｎ4+Ｃｕ2+=Ｃ34Ｈ30Ｏ6Ｎ4Ｃｕ+2Ｈ+

Ｃ34Ｈ32Ｏ5Ｎ4Ｃｕ+2ＮａＯＨ=Ｃ34Ｈ30Ｏ5Ｎ4CｕＮａ2+2Ｈ2Ｏ

Ｃ34Ｈ30Ｏ6Ｎ4Ｃｕ+2ＮａＯＨ=Ｃ34Ｈ28Ｏ6Ｎ4CｕＮａ2+2Ｈ2O

蚕粪叶绿素铜钠盐的光谱特性蚕粪叶绿素铜钠盐水溶液在360~700之间有2个吸收峰在波长440处有一最大吸收峰,其吸光度为114;在630处有一较小的吸收峰,其吸光度为017"在波长440的吸收峰为叶绿素铜钠盐特有,而在630处的吸收峰为叶绿素特有,叶绿素铜钠盐的含量约是蚕粪中叶绿素含量的2倍，所以试验中均采用440的波长测定叶绿素铜钠盐的稳定性。

下图是蚕粪叶绿素铜钠盐的光谱特性［5］。

四、仪器和试剂

（一）、试剂：

1、蚕沙（50克）2、95%乙醇3、NaOH溶液4、稀盐酸5、丙酮6、石油醚7、CuSO4溶液8、蒸馏水9、40%乙醇（纯乙醇与蒸馏水按2:

3配）10、5%NaOH-乙醇溶液11、pH试纸12、磷酸盐缓冲液（pH=7.5）取0.15mol/L磷酸氢二钠与同浓度的磷酸氢二钾以21：

4混合

（二）、仪器：

A、叶绿素的提取叶绿素铜钠合成

1、温度计1支回流冷凝管1支500ml圆底烧瓶1个

恒温槽1台滤瓶及漏斗1个胶头胶管1个

玻璃棒1支100mL量筒1个铁架台1台电热恒温水浴装置1套

2、减压蒸馏装置1台

3、台氏天平1台

4、PH试纸若干

B、叶绿素铜钠质量分析

1、751分光光度计1台

2、台式天平、分析天平各1台

3、玻棒1支胶头滴管1支10mL、50mL量筒各一个100mL、50mL容量瓶各1个25mL、1mL吸量管各一支

4、试纸若干吸耳球一个

五、实验步骤

（一）叶绿素铜钠的合成

1、叶绿素的提取：

（1）在500ml圆底烧瓶中，先加入50g干蚕沙，再加入95%乙醇100ml。

（2）将反应瓶用水浴加热，使水浴温度在60℃（防止叶绿素a和b分解），浸泡提取2小时，滤出提取液。

（3）按步骤2用乙醇重复2次。

（4）合并3次提取液，在减压、不超过60摄氏度下蒸出乙醇。

趁热倾出瓶中液体，冷却至室温，得到墨绿色膏状物（叶绿素粗品，不宜久置）。

2、皂化：

将浓缩液置于带搅拌子三口烧瓶中，用5%NaOH-C2H5OH溶液调节使其pH=11，用水浴加热在60℃下皂化回流1小时。

3、萃取：

将皂化液冷却后转入分液漏斗加入等量石油醚萃取除去杂质（黄色）静置分层，下层为可溶性叶绿酸盐（绿色），取上层液检验是否完全皂化：

取上层液少许置于小烧杯中，加入2—3倍石油醚静置，用玻棒沾取上层液去试纸上，呈绿色则不完全皂化。

取下层溶液，上层溶液用旋转蒸发器蒸发回收石油醚。

平行萃取3次。

4、调酸铜代：

将下层溶液装入三口烧瓶中，往其中慢慢加入稀盐酸溶液调节pH=7后，加入10%的硫酸铜10ml，搅拌均匀后，再用盐酸将溶液调节pH为2-3，在水浴60℃下保温搅拌1小时。

趁热过滤，用95%乙醇洗涤3次后抽干。

合并滤液和洗液，加入4倍的蒸馏水，析出叶绿素铜，静置过夜后过滤，滤饼依次用适量的纯水、40%乙醇及石油醚洗涤3次至石油醚层变为浅绿色，以除去其中的H+、及残留的叶黄素和其他有机杂质。

5、成盐：

洗涤结束后滤干，滤饼用丙酮溶解，加入5%NaOH-乙醇溶液，调节pH=11，搅拌，成盐（用滤纸法检验成盐情况：

用玻棒点少许溶液放在滤纸上，滤纸不显绿色则说明完全成盐），将其在60℃下加热蒸发以除去水分得墨绿色结晶物，然后再在60℃下烘箱中烘干结晶物，即制得墨绿色光泽的成品（略有胺味）。

流程图:

　　　　　　　　溶剂　NaOH溶液不皂化物溶剂酸CuSO4溶液滤渣　

　　　　　　　　　↓　　　↓　　↑　　　↓　　　↓↓↓

蚕砂→预处理→浸提→皂化→分离→萃取→调pH值→铜化→过滤→

水稀酒精NaOH

　　↓　　　　↓↓

→离析→沉淀→烘干→纯化→成盐→　过滤→　干燥→　成品

（二）、纯度分析：

1、标准叶绿素铜钠盐的标准曲线

称取标准样品0.01克（精确至0.0002克），加水溶解，移入10mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀。

准确取1mL溶液以pH=7.5磷酸盐缓冲液定容为100mL，摇匀，即为0.001%溶液，用分光光度计测定，在15分钟内用1cm的比色杯，在405nm波长处测定吸光值（A），以缓冲液作空白对照。

类似地配制0.0005%溶液、0.0015%溶液、0.002%溶液、0.0025%溶液，用分光光度计测定，在15分钟内用1cm的比色杯，在405nm波长处测定它们的吸光值（A），以缓冲液作空白对照，并绘制标准曲线。

2、标准叶绿素铜钠盐的吸收曲线

称取标准样品0.01克（精确至0.0002克），加水溶解，移入10mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀。

准确取1mL溶液以pH=7.5磷酸盐缓冲液定容为100mL，摇匀，即为0.001%溶液，此液最大吸收峰为405nm与630nm，吸光比A405nm/A630nm为3.2～4.0。

用分光光度计测定，用1cm的比色杯，在400nm-700nm波长处测定溶液吸光值A（每隔5nm或10nm测定一次），以缓冲液作空白对照，并绘制吸收曲线。

3、产品叶绿素铜钠盐的吸光比测定

称取烘干成品0.01克（精确至0.0002克），加水溶解，移入10mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀。

从容量瓶中准确取2mL溶液移入50mL容量瓶，用pH=7.5磷酸盐缓冲液定容至刻度，摇匀，即为0.004%溶液，此液最大吸收峰为405nm与630nm。

用分光光度计测定，用1cm的比色杯，在400nm-700nm波长处测定溶液吸光值A（每隔5nm或10nm测定一次），以缓冲液作空白对照，并绘制吸收曲线。

六、实验现象

试验操作

试验现象

备注

称取蚕沙50g

墨绿色

加入去离子水浸润和95%乙醇

60℃搅拌回流2h

蚕沙部分溶解

抽滤，保存滤液

得到呈墨绿色的液体

剩余蚕沙用95%乙醇再次回流2次

抽滤，混合三份滤液

得到呈墨绿色的液体

提高产率

水浴，减压蒸馏，把合并滤液放入旋转蒸发仪，并在55℃水浴中

加热蒸馏回收95%乙醇

得约50mL左右溶液，溶液成糊状，蒸发液呈无色

防止污染

循环利用

在浓缩液中加5%NaOH-乙醇调PH值到11，在温度为60℃，

皂化时为1h

溶液出现小气泡

皂化过程

皂化后，并洗涤加HCl调，PH＝7加入10%CuSO4调PH＝2-－3，在搅拌下温度60℃，保持1h左右

PH试纸变红色此时慢慢出

现胶状墨色悬浮物

叶绿素铜酸

趁热过滤，滤渣先用水洗去，再用95%乙醇洗涤3次后抽干。

合并滤液和洗液，加入4倍的蒸馏水，静置过夜后过滤

得墨绿色物质

洗涤液呈绿色

固体溶解得绿色液体

得墨绿色粉末

叶绿素铜钠

滤饼依次用适量的纯水、40%乙醇及石油醚洗涤3次，放进烘箱中烘干

石油醚层变为浅绿色

以除去其中的H+及残留的叶黄素和其他有机杂质。

称取0.010g叶绿素铜钠溶于蒸

馏水配成0.1%溶液，再稀释25倍，测其pH值

除去水分得墨绿色结晶物

略有胺味

结晶物0.0483g

七、实验数据与处理

一、标准叶绿素铜钠盐标准曲线

标准曲线的测定方法：

取标准样品配制0.1%叶绿素铜钠盐溶液，用移液管分别精确量取2.5mL；2.0mL；1.5mL；1.2mL；1.0mL；0.5mL移至5个加入100mL的容量瓶中，向其中各加入pH=7.5的Na2HPO4－NaH2PO4缓冲液，摇匀定容至刻度，即0.0025%；0.002%；0.0015%；0.001%；0.0005%。

以缓冲液作空白对照，分别测以上溶液在波长405nm下的吸光度值A405。

如表1、图1所示。

表1叶绿素铜钠盐标准曲线的测定数据表（光波长405nm）

溶液百分数（%）

0.00050.198

0.0010.362

0.00150.552

0.0020.716

0.00250.924

二、叶绿素铜钠盐的吸收曲线

（一）标准样品：

取标准样品配制0.001%叶绿素铜钠盐溶液，用分光光度计测定，用1cm的比色杯，在400nm-700nm波长处测定溶液吸光值A（每隔5nm或10nm测定一次），以缓冲液作空白对照。

测定数据如表2所示，吸收曲线如图2所示。

表2标准样品叶绿素铜钠盐吸收曲线的测定数据表

波长/nm

350

355

360

365

370

375

380

385

390

吸光度

0.142

0.150

0.157

0.166

0.177

0.197

0.217

0.259