<2>按照解离顺序正确写出解离方程式:
简式,注意解离基团的正确写法。
<3>找出呈电中性的物质,其左右PK’值的平均值就是氨基酸的等电点:
PI=(PK左’+PK右’)/2
举例:
1.半胱氨酸pK1(α-COO-)=1.96,pK2(R-SH)=8.18,pK3(α-NH3+)=10.28,该氨基酸pI值为:
A.5.07 B.6.12 C.6.80 D.7.68 E.9.23
2.赖氨酸pK1(α-COO-)=2.18,pK2(α-NH3+)=8.95,pK3(R-NH3+)=10.53,该氨基酸pI值为:
A.(pK1+pK2)/2 B.(pK2+pK3)/2 C.(pK1+pK3)/2
D.(pK1+pK2+pK3)/3 E.(pK1+pK2+pK3)/2
3.天冬氨酸pK1(α-COO-)=1.96,pK2(α-COO-)=3.65,pK3(α-NH3+)=9.60,该氨基酸pI值为:
A.2.8 B.3.65 C.5.74 D.6.62 E.7.51
旋光性:
从蛋白质温和水解得到的a-氨基酸都是L型的。
D-丙氨酸存在于昆虫的幼虫和蛹中。
D-亮氨酸存在于短杆菌肽中。
在细菌中发现了许多D-型的非蛋白质氨基酸
D-谷氨酸和D-丙氨酸存在与细菌细胞壁的肽聚糖中。
甘氨酸的a-碳不是手性碳,故没有旋光性。
光吸收:
220-300nm:
Tyr、Phe、Trp
苯丙Phe的max=257nm
酪Tyr的max=275nm
色Trp的max=280nm
蛋白质的生物学/行使的功能:
新陈代谢的催化剂-酶。
有机体的结构成分。
储藏氨基酸的功能。
运输功能。
激素的功能。
免疫的功能。
接受和传递信息作用功能。
调节或者控制功能。
第二章蛋白质制备
蛋白质分离纯化的一般程序及其注意事项
1.生物组织的机械破碎:
研磨法、超声波法、冻融法和酶解法等(细胞外分泌物无需破碎)。
2.根据蛋白质的特性,选择不同的溶剂进行抽提。
水溶性蛋白用中性缓冲溶液抽提,
酸性蛋白用稀碱性溶液抽提,
脂溶性蛋白用表面活性剂抽提等。
3.离心:
去亚细胞颗粒、细胞碎片等
4.粗提:
离心除去固体杂质后,可通过沉淀法、超滤法、萃取法等处理,得到蛋白质粗制品。
5.精制:
可用层析法、电泳法等进行精制。
6.结晶:
取得蛋白质晶体并测定蛋白质的性质。
注意事项:
动物组织和器官要尽可能除去结缔组织和脂肪。
制备植物细胞时,在缓冲液中加入聚乙烯吡咯啉酮(PVP)可以减少褐变,它可以吸附多酚化合物。
革兰氏阳性菌可用溶菌酶消化,37oC处理15分钟即可溶解细胞壁。
革兰氏阴性菌较难消化。
可先用非离子去污剂(如TritonX-100)、巯基乙醇或甘油处理细胞。
在溶液中还可加入脱氧核糖核酸酶I(10ug/mL),可以使溶液的黏度降低,可以提高抽提液的质量。
膜蛋白的释放:
外周蛋白
通过静电力或共价键和外膜脂质的极性头部螯合在一起。
占膜蛋白的20~30%
内在蛋白(固有蛋白)
嵌合在膜脂双层结构中。
大部分膜蛋白是固有蛋白
外周蛋白的分离:
改变离子强度;
金属螯合剂(EDTA)可将其抽提出来
内在蛋白的提取:
提取的原则
抽提膜蛋白时,首先削弱膜蛋白和膜脂的疏水结合,同时保持疏水基暴露在外的天然状态。
此过程叫做增溶作用。
常用的增溶剂是去污剂,它可以使膜蛋白疏水部分与膜分离,同时保留住膜蛋白表面的疏水结构。
用去污剂增溶之后,膜蛋白要用透析的方法除掉去污剂,再进行其他方法的分离纯化。
盐析的概念
是一种向蛋白质溶液中加入浓的盐溶液使蛋白质变性的方法。
盐溶:
一般在低盐浓度下随着盐浓度升高,蛋白质的溶解度增加。
盐析:
当盐浓度继续升高时,蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出。
原因:
将大量盐加到蛋白质溶液中,高浓度的盐离子(如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力,可夺取蛋白质分子的水化层,使之“失水”,于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出,导致蛋白质分子的沉淀。
课件重点补充:
膜蛋白破碎的主要方法:
膜蛋白的释放,上面有。
蛋白质脱盐:
透析法(注:
用前在含EDTA的溶液中煮----除去核酸酶和蛋白酶);
纤维过滤透析法;中空纤维超滤膜
分子筛层析法;SephadexG-25
蛋白质浓缩:
沉淀法:
用盐析法或者有机溶剂法将蛋白质沉淀,再将沉淀溶于少量溶液中;
吸附到离子交换柱上,然后用少量盐洗脱;
干燥吸附法:
用固体吸附剂如SephadexG25等,冻干法,真空干燥法;
渗透浓缩法:
将干粉PEG-20000涂在装有蛋白质溶液的透析袋上,可吸干水分;
超滤浓缩法:
用超滤膜滤去小分子和水,达到超滤的目的。
使蛋白质沉淀的主要方法及其原理(重点:
盐析方法)
盐析法(上面有);
有机溶剂法:
原理:
1.增大带电质点之间的静电力。
2.破坏蛋白质表面的水合层,使蛋白质分子脱水而沉淀。
有机聚合物沉淀法;(作用原理与有机溶剂类似)
选择性变性沉淀法:
适用于提取一些耐极端环境的蛋白质。
用一些极端条件,使非目标蛋白质变性析出,从而将目的蛋白质纯化。
主要方法有:
热变性;pH变性(包括等电电变性);有机溶剂变性。
非特异性层析的原理、方法(如何平衡、如何吸附、如何洗脱….)
吸附层析、离子交换层析、凝胶过滤层析
离子交换层析
原理:
根据蛋白质分子所带电荷的不同来达到分离的目的.
解离离子带负电,结合阳离子(蛋白质分子),称为阳离子交换柱。
解离离子带正电,结合阴离子(蛋白质分子),称为阴离子交换柱。
步骤:
(处理介质-装柱-上样-洗涤-洗脱-介质再生)
方法:
平衡:
电荷量越大,结合越牢,在柱中移动速度越慢;电荷不同,亲和力不同.
洗脱:
带电蛋白质分子与交换剂的结合可逆。
通常,用盐梯度和pH梯度可把吸附的蛋白质从柱上洗脱下来.
其他:
离子交换的支持物
纤维素:
具有松散的亲水性网络,较大的的表面积、吸附容量大,通透性好。
葡聚糖凝胶:
既有离子交换剂的性质,又有分子筛效应。
琼脂糖凝胶:
吸附容量大,能维持较好的流速和分辨率。
习题1:
三个氨基酸(Leu,Asp,Lys)的混合物,经过一个阳离子交换树脂粒,用pH5的缓冲液洗脱,洗脱液中氨基酸出现的顺序是
A.Asp,Leu,Lys;B.Leu,Asp,Lys;C.Lys,Leu,Asp;D.Leu,Lys,Asp
解:
Leu0,Asp-,Lys+》》》AspLeuLys自己做的,不知道对不对
习题2:
有以下4种蛋白质的混合物:
(1)pI=10;
(2)pI=4;(3)pI=8.6;(4)pI=5.若不考虑其它因素,当它们流过DEAE-纤维素阴离子交换柱,用线性盐梯度洗脱时,这些蛋白质的洗脱顺序如何,并具体说明其原因。
答案:
在离子交换柱上,带更多负电的吸附能力更强。
四种蛋白质PI值的顺序为1>3>4>2。
因此,在某种pH值下,所带电荷由正到负的顺序为1>3>4>2。
因此,洗脱出现的先后顺序就是1>3>4>2。
凝胶过滤层析
原理:
根据分子量的大小不同而达到分离的目的。
载体是一种多孔的凝胶。
分子直径比凝胶孔径大的分子,不能进入凝胶颗粒的微孔中,其他分子由大到小先后从凝胶中流出。
疏水层析(吸附层析)
原理:
根据蛋白质分子疏水性的不同而达到蛋白质分离的目的。
在不带电的载体上偶联上疏水基团形成疏水吸附剂,将带有非极性的生物活性物质吸附在一起,然后改变层析条件,减弱疏水作用,将吸附物质解离下来。
洗脱:
改用低浓度的盐;降低离子强度;加乙二醇。
在洗脱也中加去污剂;增加洗脱pH。
从高到低的NaCl浓度梯度洗脱;或由高到低的盐浓度加由低到高的乙二醇浓度梯度洗脱。
注意:
离子交换:
低盐吸附,高盐洗脱
疏水层析:
高盐吸附,低盐洗脱
亲和层析的原理、步骤、作用力、专一性洗脱、非专一性洗脱
原理:
根据特定蛋白质对某种的生物专一性来进行分离。
作用力:
专一性亲和力,在一定条件下紧密地形成复合物。
步骤:
?
洗脱:
非专一性洗脱
改变缓冲液的离子强度或者pH或者介电系数。
使吸附的大分子的构象发生改变,以降低其与配体之间的亲和力,将吸附的大分子从层析柱上洗脱下来。
专一性洗脱
选用与配体结合能力更大物质的洗脱液。
eg.底物配体:
底物类似物、酶抑制剂等
几种特殊的亲和层析:
免疫亲和层析:
根据生物