第二节食品加工中重要的酶食品伙伴网Word文档格式.docx
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-淀粉酶的热稳定性普遍低于-淀粉酶，但比较耐酸。
（三）葡萄糖淀粉酶
葡萄糖淀粉酶主要由微生物的根霉、曲霉等产生。
最适pH为4～5，最适温度在50～60℃范围。
葡萄糖淀粉酶是一种外切酶，它不仅能水解淀粉分子的-1，4糖苷键，而且能水解-1,6糖苷键和-1,3糖苷键，但对后两种键的水解速度较慢。
葡萄糖淀粉酶水解淀粉时，是从非还原性末端开始逐次切下一个个葡萄糖单位，当作用于淀粉支点时，速度减慢，但可切割支点。
因此，葡萄糖淀粉酶作用于直链淀粉或支链淀粉时，终产物均是葡萄糖。
工业上用葡萄糖淀粉酶来生产葡萄糖。
所以也称此酶为糖化酶。
（四）脱支酶
脱支酶在许多动植物和微生物中都有分布，是水解淀粉和糖原分子中-1,6糖苷键的一类酶，有普鲁兰酶和异淀粉酶之分。
（五）淀粉酶在食品工业中的应用
淀粉酶在食品工业上应用很广泛。
淀粉酶制剂是最早实现工业化生产和产量最大的酶制剂品种，约占整个酶制剂总产量的50%以上，被广泛应用于食品、发酵及其他工业中。
如：
淀粉酶用于酿酒、味精等发酵工业中水解淀粉；
在面包制造中为酵母提供发酵糖，改进面包的质构；
用于啤酒除去其中的淀粉浑浊；
利用葡萄糖淀粉酶可直接将低黏度麦芽糊精转化成葡萄糖，然后再用葡萄糖异构酶将其转变成果糖，提高甜度等。
目前商品淀粉酶制剂最重要的应用是用淀粉制备麦芽糊精、淀粉糖浆和果葡糖浆等。
二、蛋白酶
蛋白酶从动物、植物和微生物中都可以提取得到，也是食品工业中重要的一类酶。
生物体内蛋白酶种类很多，以来源分类，可将其分为动物蛋白酶、植物蛋白酶和微生物蛋白酶三大类。
根据它们的作用方式，可分为内肽酶和外肽酶两大类。
还可根据最适pH的不同，分为酸性蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶。
也有根据其活性中心的化学性质不同，分为丝氨酸蛋白酶（酶活性中心含有丝氨酸残基）、巯基蛋白酶（酶活性中心含有巯基）、金属蛋白酶（酶活性中心含金属离子）和酸性蛋白酶（酶活性中心含羧基）。
（一）动物蛋白酶
在人和哺乳动物的消化道中存在有各种蛋白酶。
如胃黏膜细胞分泌的胃蛋白酶，可将各种水溶性蛋白质分解成多肽；
胰腺分泌的胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶和羧肽酶等内肽酶和外肽酶，可将多肽链水解成寡肽和氨基酸；
小肠黏膜能分泌氨肽酶、羧肽酶和二肽酶等，将小分子肽分解成氨基酸。
人体摄取的蛋白质就是在消化道中这些酶的综合作用下被消化吸收的。
胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等先都分别以无活性前体的酶原形式存在，在消化道需经激活后才具有活性。
在动物组织细胞的溶酶体中有组织蛋白酶，最适pH为5.5左右。
当动物死亡之后，随组织的破坏和pH的降低，组织蛋白酶被激活，可将肌肉蛋白质水解成游离氨基酸，使肌肉产生优良的肉香风味。
但从活细胞中提取和分离组织蛋白酶很困难，限制了它的应用。
在哺乳期小牛的第四胃中还存在一种凝乳酶，是由凝乳酶原激活而成，pH5时可由已有活性的凝乳酶催化而激活，在pH2时主要由H＋（胃酸）激活。
随小牛长大，由摄取母乳改变成青草和谷物时，凝乳酶逐渐减少，而胃蛋白酶增加。
凝乳酶也是内肽酶，能使牛奶中的酪蛋白凝聚，形成凝乳，用来制作奶酪等。
动物蛋白酶由于来源少，价格昂贵，所以在食品工业中的应用不甚广泛。
胰蛋白酶主要应用于医药上。
（二）植物蛋白酶
蛋白酶在植物中存在比较广泛。
最主要的3种植物蛋白酶，即木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶和菠萝蛋白酶已被大量应用于食品工业。
这3种酶都属巯基蛋白酶，也都为内肽酶，对底物的特异性都较宽。
木瓜蛋白酶是番木瓜胶乳中的一种蛋白酶，在pH5时稳定性最好，低于pH3和高于pH11时，酶会很快失活。
该酶的最适pH虽因底物不同而有不同，但一般在5～7之间。
与其他蛋白酶相比，其热稳定性较高。
无花果蛋白酶存在于无花果胶乳中，新鲜的无花果中含量可高达1%左右。
无花果蛋白酶在pH6～8时最稳定，但最适pH在很大程度上取决于底物。
若以酪蛋白为底物，活力曲线在pH6.7和9.5两处有峰值；
以弹性蛋白为底物时，最适pH为5.5；
而对于明胶，最适pH则为7.5。
菠萝汁中含有很强的菠萝蛋白酶，从果汁或粉碎的茎中都可提取得到，其最适pH值范围在6～8。
以上3种植物蛋白酶在食品工业上常用于肉的嫩化和啤酒的澄清。
特别是木瓜蛋白酶的应用，很久以前民间就有用木瓜叶包肉，使肉更鲜嫩、更香的经验。
现在这些植物蛋白酶除用于食品工业外，还用于医药上作助消化剂。
（三）微生物蛋白酶
细菌、酵母菌、霉菌等微生物中都含有多种蛋白酶，是生产蛋白酶制剂的重要来源。
生产用于食品和药物的微生物蛋白酶的菌种主要是枯草杆菌、黑曲霉、米曲霉三种。
随着酶科学和食品科学研究的深入发展，微生物蛋白酶在食品工业中的用途将越来越广泛。
在肉类的嫩化，尤其是牛肉的嫩化上应用微生物蛋白酶代替价格较贵的木瓜蛋白酶，可达到更好的效果。
微生物蛋白酶还被运用于啤酒制造以节约麦芽用量。
但啤酒的澄清仍以木瓜蛋白酶较好，因为它有很高的耐热性，经巴氏杀菌后，酶活力仍还存在，可以继续作用于杀菌后形成的沉淀物，以保证啤酒的澄清。
在酱油的酿制中添加微生物蛋白酶，既能提高产量，又可改善质量。
除此之外，还常用微生物蛋白酶制造水解蛋白胨用于医药，以及制造蛋白胨、酵母浸膏、牛肉膏等。
细菌性蛋白酶还常用于日化工业，添加到洗涤剂中，以增强去污效果，这种加酶洗涤剂对去除衣物上的奶斑、血斑等蛋白质类污迹的效果很好。
三、果胶酶
果胶酶是能水解果胶类物质的一类酶的总称。
它存在于高等植物和微生物中，在高等动物中不存在，但蜗牛是例外。
（一）果胶酶的分类及作用
果胶酶根据其作用底物的不同，可分为果胶酯酶、聚半乳糖醛酸酶和果胶裂解酶3种类型。
1．果胶酯酶果胶酯酶存在于植物及部分微生物种类里。
果胶酯酶催化果胶脱去甲酯基生成聚半乳糖醛酸链和甲醇的反应。
不同来源的果胶酯酶的最适pH不同，霉菌来源的果胶酯酶的最适pH在酸性范围，细菌来源的果胶酯酶在偏碱性范围，植物来源的果胶酯酶在中性附近。
不同来源的果胶酯酶对热的稳定性也有差异，例如霉菌果胶酯酶在pH3.5时，50℃加热0.5h，酶活力无损失，当温度提高到62℃时，酶基本上全部失活。
而蕃茄和柑橘果胶酯酶在pH6.1时，70℃加热1h，酶活力也只有50%的损失。
在一些果蔬的加工中，若果胶酯酶在环境因素下被激活，将导致大量的果胶脱去甲酯基，从而影响果蔬的质构。
生成的甲醇也是一种对人体有毒害作用的物质，尤其对视神经特别敏感。
在葡萄酒、苹果酒等果酒的酿造中，由于果胶酯酶的作用，可能会引起酒中甲醇的含量超标，因此，果酒的酿造，应先对水果进行预热处理，使果胶酯酶失活以控制酒中甲醇的含量。
2．聚半乳糖醛酸酶聚半乳糖醛酸酶是降解果胶酸的酶，根据对底物作用方式不同可分两类：
一类是随机地水解果胶酸（聚半乳糖醛酸）的苷键，这是聚半乳糖醛酸内切酶；
另一类是从果胶酸链的末端开始逐个切断苷键，这是聚半乳糖醛酸外切酶。
聚半乳糖醛酸内切酶多存在于高等植物、霉菌、细菌和一些酵母中，聚半乳糖醛酸外切酶多存在于高等植物和霉菌中，在某些细菌和昆虫中也有发现。
聚半乳糖醛酸酶来源不同，它们的最适pH也稍有不同，大多数内切酶的最适pH在4.0～5.0范围以内，大多数外切酶最适pH在5.0左右。
聚半乳糖醛酸酶的外切酶与内切酶，由于作用方式不同，所以它们作用时对果蔬质构影响或果汁处理效果也有差别。
例如同一浓度果胶液，内切酶作用时，只要3%～5%的果胶酸苷键断裂，黏度就下降；
而外切酶作用时，则要10%～15%的苷键断裂才使黏度下降50%。
3．果胶裂解酶果胶裂解酶是内切聚半乳糖醛酸裂解酶、外切聚半乳糖醛酸裂解酶和内切聚甲基半乳糖醛酸裂解酶的总称。
果胶裂解酶主要存在于霉菌中，在植物中尚无发现。
果胶裂解酶是催化果胶或果胶酸的半乳糖醛酸残基的C4～C5位上的氢进行反式消去作用，使糖苷键断裂，生成含不饱和键的半乳糖醛酸。
以上3种酶的作用方式如图2-1所示。
图2-1果胶酶的作用方式
（二）果胶酶在食品工业上的应用
果胶酶在食品工业中具有很重要作用，尤其在果汁的提取和澄清中应用最广。
如在苹果汁的提取中，应用果胶酶处理方法生产的汁液具有澄清和淡棕色外观，如果用直接压榨法生产的苹果汁不经果胶酶处理，则表现为浑浊，感官性状差，商品价值受到较大影响；
经果胶酶处理生产葡萄汁，不但感官质量好，而且能大大提高葡萄的出汁率；
柑橘汁的色泽和风味依赖于果汁中的混浊成分，混浊是由果胶、蛋白质构成的胶态不沉降的微小粒子的作用，若橘汁中果胶酶不失活，其作用结果会导致柑橘汁中的果胶分解，橘汁沉淀、分层、从而成为不受欢迎的饮料，因此，柑橘汁加工时必须先经热处理，使果胶酶失活。
在蕃茄的生产中，用热打浆法可以很快破坏果胶酶的活性，有利于保持产品质地均匀。
在水果罐头加工中，切开的果块先经热烫是一种钝酶措施，其中包括钝化果胶酶以防止果肉在罐藏中过度软化。
另外，在提取植物蛋白时，常使用果胶酶处理原料，以提高蛋白质的得率。
总之，果胶酶在食品贮藏加工中的应用是越来越广。
四、多酚氧化酶
多酚氧化酶广泛存在于各种植物和微生物中。
在果蔬食物中，多酚氧化酶分布于叶绿体和线粒体中，但也有少数植物，如马铃薯块茎，几乎所有的细胞结构中都有分布。
多酚氧化酶的最适pH常随酶的来源不同或底物之不同而有差别，但一般在pH4～7范围之内。
同样，不同来源的多酚氧化酶的最适温度也有不同，一般多在20～35℃之间。
在大多数情况下从细胞中提取的多酚氧化酶在70～90℃下热处理短时就可发生不可逆变性。
低温也影响多酚氧化酶活性。
较低温度可使酶失活，但这种酶的失活是可逆的。
阳离子洗涤剂、Ca2＋等能活化多酚氧化酶。
抗坏血酸、二氧化硫、亚硫酸盐、柠檬酸等都对多酚氧化酶有抑制作用，苯甲酸、肉桂酸等有竞争性抑制作用。
多酚氧化酶是一种含铜的酶，主要在有氧的情况下催化酚类底物反应形成黑色素类物质。
在果蔬加工中常常因此而产生不受欢迎的褐色或黑色，严重影响果蔬的感官质量。
多酚氧化酶催化的褐变反应多数发生在新鲜的水果和蔬菜中，例如香蕉、苹果、梨、茄子、马铃薯等。
当这些果蔬的组织碰伤、切开、遭受病害或处在不正常的环境中时，很容易发生褐变。
这是因为当它们的组织暴露在空气中时，在酶的催化下多酚氧化为邻醌，再进一步氧化聚合而形成褐色素或称类黑素。
五、其他酶类
（一）脂肪酶
脂肪酶存在于含有脂肪的组织中。
植物的种子里含脂肪酶，一些霉菌、细菌等微生物也能分泌脂肪酶。
脂肪酶的最适pH常随底物、脂肪酶纯度等因素而有不同，但多数脂肪酶的最适pH在8～9，也有部分脂肪酶的最适pH偏酸性。
微生物分泌的脂肪酶最适pH在5.6～8.5之间。
脂肪酶的最适温度也因来源、作用底物等条件不同而有差异，大多数脂肪酶的最适温度在30～40℃范围之内。
也有某些食物中脂肪酶在冷冻到-29℃时仍有活性。
除了温度对脂肪酶的活性有影响外，盐对脂肪酶的活性也有一定影响，对脂肪具有乳化作用的胆酸盐能提高酶活力，重金属盐一般具有抑制脂肪酶的作用，Ca2＋能活化脂肪酶并可提高其热稳定性。
脂肪酶能催化脂肪水解成甘油和脂肪酸，但是对水解甘油酰三酯的酯键位置具有特异性，首先水解1,3位酯键生成甘油酰单酯后，再将第二位酯键在非酶异构后转移到第一位或第三位，然后经脂肪酶作用完全水解成甘油和脂肪酸。
脂肪酶只作用于油—水界面的脂肪分子，增加油水界面能提高脂肪酶的活力，所以，在脂肪中加入乳化剂能大大提高脂肪酶的催化能力。
脂肪酶不但在生物体内有催化脂类物质代谢的重要生理功能，而且在食品加工中也有重要作用。
含脂食品如牛奶、奶油、干果等产生的不良风味，主要来自脂肪酶的水解产物（水解酸败），水解酸败又能促进氧化酸败。
当然，食品加工中脂肪酶作用后释放一些短链的游离脂肪酸（丁酸、己酸等），当它们浓度低于一定水平时，会产生好的风味和香气，如牛乳和干酪的酸值分别为1.5和2.5时，就会有好的风味，如果酸值大于5，则产生陈腐气味、苦味或者类似山羊的膻味。
利用特异性脂肪酶可以从廉价的脂原料生产可可奶油。
当然，脂肪酶不单在食品工业中有广泛用途，在绢纺、皮革脱酯等轻化工及医药工业上也有重要用途。
（二）脂氧合酶
脂氧合酶广泛地存在于植物中。
各种植物的种子，特别是豆科植物的种子含量丰富，尤其以大豆中含量最高。
脂氧合酶对底物具有高度的特异性，它作用的底物脂肪，在其脂肪酸残基上必须含有一个顺，顺1，4-戊二烯单位（—CH＝CH—CH2—CH＝CH—）。
必需脂肪酸的亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸都含有这种单位，所以必需脂肪酸都能被脂氧合酶所利用，特别是亚麻酸更是脂氧合酶的良好底物。
作用机理如图2-2。
图2-2脂氧合酶作用机理
上述式中第一步反应是脂氧合酶作用于脂肪酸，有选择性地取走了一个氢，然后再转移到氧，这样就形成了脂肪酸游离基和过氧化物游离基。
第二步是脂肪酸游离基被异构化，因而导致双键也被异构化，脂肪酸残基上原来的顺，顺1，4-戊二烯单位变成了顺，反1，3-戊二烯单位。
第三步是异构化的脂肪酸游离基得到一个质子形成脂肪酸氢过氧化物。
脂氧合酶作用于脂肪酸时参与上述全过程，直至脂肪酸氢过氧化物形成后，酶才再生。
脂氧合酶对食品质量的影响较复杂，它在一些条件下可提高某些食品的质量，例如在面粉中加入含有活性的脂氧合酶的大豆粉，由于脂氧合酶的作用，使得面筋网络更好地形成，从而较好地改善了面包的质量；
做成面条，可使产品漂白，口感滑润。
存在于番茄、豌豆、香蕉、黄瓜等果蔬中的脂氧合酶，为这些果蔬的良好风味也发挥了作用。
可是脂氧合酶在很多情况下又能损害一些食品的质量，例如能直接或间接地影响肉类的酸败和对食品中一些维生素的破坏；
减少食品中不饱和脂肪酸的含量和使高蛋白食品产生不良风味等。
此外，由于脂氧合酶耐受低温能力强，因此低温下贮藏的青豆、大豆、蚕豆等最好也能经热烫处理，使脂氧合酶钝化，否则易造成质量变劣。
在加工豆奶时，将未浸泡的脱壳大豆在80～100℃的热水中研磨10min左右，也可去除因脂氧合酶作用产生的豆腥味等。
显然，控制食品加工时的温度是使脂氧合酶失活的有效方法。
（三）葡萄糖氧化酶
葡萄糖氧化酶最初从黑曲霉和灰绿曲霉中发现，米曲霉、青霉等多种霉菌都能产生葡萄糖氧化酶。
但在高等动物和植物中，目前还没发现。
葡萄糖氧化酶是一种需氧脱氢酶，在有氧条件下催化葡萄糖的氧化。
反应如下：
葡萄糖氧化酶
葡萄糖＋O2葡萄糖酸＋H2O2
利用该酶促反应可以除去葡萄糖或氧气。
例如葡萄糖氧化酶可用在蛋品生产中以除去葡萄糖而防止引起产品变色的美拉德反应，又可用它减少土豆片中的葡萄糖，从而使油炸土豆片产生金黄色而不是棕色。
葡萄糖氧化酶还常用于除去封闭包装系统中的氧气以抑制脂肪的氧化和天然色素的降解。
例如，螃蟹肉和虾肉浸渍在葡萄糖氧化酶和过氧化物酶的混合溶液中可抑制其颜色从粉红色变成黄色。
光催化反应生成的过氧化物会破坏橘子汁、啤酒和酒中的风味物并生成一种不良的异味，也可以用该方法通过减少容器顶隙氧气而加以克服。
商品葡萄糖氧化酶试剂中常含有过氧化氢酶，在商品试剂的葡萄糖氧化酶过氧化氢酶体系中，葡萄糖氧化酶能吸收氧而形成葡萄糖酸和过氧化氢，而过氧化氢酶能催化过氧化氢分解成水和氧。
总反应如下：
过氧化氢酶
葡萄糖＋1/2O2葡萄糖酸
（四）过氧化氢酶
过氧化氢酶主要是从微生物中提取，它之所以重要是因为它能分解过氧化氢。
过氧化氢是食品用葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化时生成的一种产物，也是食品中少数几种氧化反应的产物，还是一些食品中采用的冷杀菌试剂，所以是一种可能存在于食品中的成分。
由于这种成分的强氧化性，它会导致食品的品质不稳定，而且会降低食品的食用安全性。
所以，它在食品中的含量应当越低越好。
利用过氧化氢酶于食品的意义就在于降低它的含量。
例如用过氧化氢可对牛乳进行巴氏消毒，经过处理的牛乳就比较稳定，而且对某些易受热破坏的干酪的制作过程也是合适的，其中过剩的过氧化氢可用过氧化氢酶消除。
（五）过氧化物酶
过氧化物酶广泛存在于所有高等植物中，也存在牛奶中。
过氧化物酶通常含有一个血红素作为辅基，催化以下反应：
ROOH＋AH2H2O＋ROH＋A
其中ROOH可以是过氧化氢或有机过氧化物，AH2是供氢体。
当ROOH被还原时，AH2即被氧化。
AH2可以是抗坏血酸盐、酚、胺类或其他还原性强的有机物。
这些还原剂被氧化后大多能产生颜色，因此可以用比色法来测定过氧化物酶的活性。
由于过氧化物酶具有很高的耐热性，而且广泛存在于植物中，测定其活性的比色测定法既灵敏又简单易行，所以可以作为考查热烫处理是否充分的指示酶。
当食物进行热处理后，如果检测证明过氧化物酶的活性已消失，则表示其他的酶一定受到了彻底破坏，热烫处理已充分了。
从营养和风味方面来看，过氧化物酶也是很重要的，如过氧化物酶能催化维生素C氧化而破坏其生理功能；
能催化不饱和脂肪酸的过氧化物裂解，产生不良气味的羰基化合物，同时破坏食品中的许多其他成分；
还能催化类胡萝卜素漂白和花青色脱色。
（六）风味酶
水果和蔬菜中的风味化合物，一些是由风味酶直接或间接地作用于风味前体，然后转化生成的。
当植物组织保持完整时，并无强烈的芳香味，因为酶与风味前体是分隔开的，只有在植物组织破损后，风味前体才能转变为有气味的挥发性化合物。
而有的是经过贮藏和加工过程而生成的。
例如香蕉、苹果或梨在生长过程中并无风味，甚至在收获期也不存在，直到成熟初期，由于生成少量的乙烯的刺激而发生了一系列酶促变化，风味物质才逐渐形成。
对风味物前体转化为风味物产生关键催化作用的专一性酶被称为风味酶。
例如蒜氨酸酶、葡萄糖硫苷酶、脂肪氧合酶和S-烷基-L-半胱氨酸亚砜断裂酶分别是蒜氨酸转变为蒜素、芥子苷转变为异硫氰酸酯、亚麻酸转变为黄瓜醛和香茹酸转变为香茹精反应中关键的效应酶，所以它们都是风味酶。
第三节酶的固定化
随着酶学研究的深入和酶工程的发展，酶的应用越来越广泛。
将酶用物理或化学的方法固定在不溶于水的载体上，形成一种可以重复使用的酶，叫固定化酶。
固定化酶既保持了酶的催化特性，又克服了游离酶的不稳定性，具有可反复或连续使用、易与反应产物分离等显著优点，广泛应用于医药、轻工、食品等行业。
一、固定化酶的制备方法
制备固定化酶的方法很多，有包埋法、吸附法、共价偶联法，以及交联法等（图2-3）。
1．包埋法将酶或含酶菌体包埋在多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法。
包埋法根据载体材料和方法的不同，可以分为凝胶包埋法和微胶囊包埋法。
凝胶包埋法是将酶和含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微孔中，制成一定形状的固定化酶的方法。
最常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、海藻酸钙、卡拉胶、聚丙烯酰胺等。
微胶囊包埋法是将酶包埋在高分子半透膜中，制成微胶囊固定化酶的方法。
常用的半透膜有尼龙膜、醋酸纤维膜等。
2．吸附法利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面而使酶固定化的方法称为吸附法。
吸附法常用的吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羧基磷灰石等。
吸附法制备固定化酶，操作简便、条件温和，不会引起酶的变性失活，载体价廉易得，而且可反复使用。
但由于是靠物理吸附作用，结合力较弱，酶与载体结合不太牢固而易脱落。
3．共价偶联法利用酶活性中心外的非必需基团与固相载体上的基团共价结合而制成固定化酶的方法叫共价偶联法，也叫共价结合法。
这种方法的优点是酶与载体牢固，制得的固定化酶稳定性好。
缺点是制备过程中反应条件较为强烈，难以控制，易使酶变性失活。
共价偶联法常用的载体有纤维素、葡聚糖、琼脂糖、甲壳素等。
4．交联法交联法是采用双功能试剂使酶分子之间或酶分子与固相载体之间发生交联作用而制成固定化酶的方法。
常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等。
其中应用最广泛的是戊二醛。
用交联法制备的固定化酶结合牢固，可长时使用。
但由于交联反应较激烈，酶分子的多个基团被交联，酶活力损失较大。
实际使用时，往往与其他固定化方法联用，如将酶先经凝胶包埋后，再经交联等。
这种采用两个或多个方法进行固定化的技术，称为双重或多重固定化法，用此法可制备出酶活性高、机械强度好的固定化酶。
图2-3制备固定化酶的各种方法
二、固定化酶的性质
酶经固定化以后，由于受到载体等因素的影响，其特征可能会发生某些改变。
为此，在固定化酶的应用过程中，必须了解固定化酶的性质与游离酶之间的差别，并对操作条件加以适当调整。
1．稳定性固定化酶的稳定性一般比游离酶的稳定性好，主要表现在对热、蛋白酶、各种变性剂的耐受性增强，使用和保存的稳定性提高。
2．最适温度固定化酶的最适作用温度一般与游离酶差不多，活化能也变化不大。
但也有些固定化酶的最适温度与游离酶比较有明显的差别。
例如，氨基酸酰化酶最适温度一般在60℃左右，用DEAE-纤维素固定化后，其最适温度高达72℃。
3．最适pH酶经固定化后，其最适pH往往会发生变化，这一点在使用时必须引起注意。
影响固定化酶最适pH因素主要有两个：
一个是载体的带电性质；
另一个是酶催化反应的产物性质。
载体的带电性质对固定化酶的最适pH也有明显的影响。
一般说来，带负电的载体制备固定化酶，其最适pH比游离酶高；
而带正电的载体制备的固定化酶其最适pH比游离酶低；
而用电中性的载体制备的固定化酶，其最适pH一般不改变。
酶催化反应的产物性质对固定化酶的最适pH也有一定的影响。
一般来说，产物为酸性时固定化酶的最适pH比游离酶高一些；
产物为碱性时，固定化酶的最适pH比游离酶低一些，产物为中性时，最适pH一般不改变。
4．底物特异性固定化酶的底物特异性与游离酶比较有所不同。
比如对一些可作用于大分子底物，也可作用于小分子底物的酶而言，经固定化后，由于受到载体空间位
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