端粒和端粒酶Word文件下载.docx
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2.端粒结合蛋白的结构
端粒结合蛋白包括端粒酶、保卫蛋白复合体（sheherin）和非保卫蛋白。
保卫蛋白复合体由端粒重复序列结合因子l（TRFl）,端粒重复序列结合因子（TRF2）。
端粒保卫蛋白1（P0rrl），TRFl相互作用核蛋白（TIN2）,TIN2相互作用蛋白l（TINTl）及阻抑和活化蛋白1趣印1）组成，各分布在染色体端粒上，能保持端粒结构的相对稳定。
非保卫蛋白有DNA修复蛋白RADSO,NBSl,胍E11，Ku86和DNAPKcs等,各分布不局限在端粒上。
这三类端粒结合蛋白协同参与端粒动态平衡的维持和调节。
TRF1是一种端粒DNA双链重复序列结合蛋白，它只结合在T环上。
其包括3个功能域：
C末端Myb样DNA结合功能域、N末端的酸性氨基酸残基和多肽链中部的二聚化反应功能域.两个TRFl利用各自的mby结构域与DNA结合形成同源二聚体,并能使DNA发生轻微的弯曲。
TRFl通过负反馈机制抑制端粒增长、稳定端粒的长度，其只抑制端粒酶在端粒末端的行为，电镜显示在体外TRF1形成一种蛋白丝状物,能促使两条DNA链相互连接,因此这种负反馈机制被认为是通过蛋白计数模式来实现的.。
TRFl与Tankyasel、TIN2和PINX1等组成TRF1复合体，大量TRFl复合体沿着端粒DNA双链结合,作为一个长度测量装置来测量端粒的长度。
端粒越长，结合的TRFl复合体就越多，负反馈调节的信号就越强Loayza等发现端粒保护蛋白（POT1）是TRFl复合体控制端粒长度作用的最终传递体。
POT1作为长度信息的传递体把信息传递给端粒酶，起组织端粒酶的作用。
其可能的作用方式是结合单链DNA末端，使端粒酶不能识别3’悬挂末端引物,从而不能启动端粒的延伸。
Ye等通过质谱测量法鉴定出一种新的端粒结合蛋白—POT1-交互作用蛋白1（PIP1）发现PIP1与（POT1）和TIN2结合，把POT1拴系在TRF1复合体上。
TRF2与TRF1同源，也是端粒DNA双链重复序列结合蛋白,它同样具有C末端Myb样DNA结合功能域和二聚化反应功能域，对端粒长度起负调控作用，可以在一定程度上抑制端粒酶的活性，经过表达TRF2引起端粒一定程度的缩短，与TRF1不同的是TRF2蛋白N末端主要包括碱性氨基酸残基,另外,其在进化上更保守.电镜观察发现TRF2能把线性的端粒DNA重塑成T-环样结构以及在侵入处置换出一段DNA链与互补链配对形成D-环，侵入处也即T-环与端粒双链DNA的交接处是TRF2的选择性结合部位。
这些研究提示TRF2是D环-T环结构形成和稳定的重要因子。
TRF2也不是孤立地起作用，它与人抑制剂激活物蛋白1交互作用形成复合物，结合端粒双链重复序列。
Ye等的研究发现，TRF1交互作用核蛋白2能同时结合TRF1和TRF2,提示TRF1复合体和TRF2复合体相互作用参与端粒长度的调控。
他们通过质谱测量法和免疫共沉淀法证实TRF1、TIN2、PIP1和POT1与TRF2-hRrap1复合体相关联，并发现TRF2-hRrap1复合体的组分包括TIN2和POT1,但是没有TRF1。
另外，他们还证实，与TRF2直接发生作用的是TIN2而不是POT1或PIP1.TIN2似乎是这些端粒结合和相关蛋白相互联系的一个纽带，它介导的TRF1和TRF2复合体之间的相互作用在端粒长度调节和端粒末端结构的保护作用中起重要作用.
3．端粒的功能
根据现有的研究结果以及已知的端粒结构推测，端粒功能至少包括：
（1）保护染色体末端不被
降解，防止其粘着、融合及重组，维持其完整性
（2）参与染色体的定位和复制，保证细胞的正常分化与繁殖（3）反映细胞分裂的能力，随着细胞的不断分裂，端粒重复序列逐渐缩短的特点决定了细胞分裂次数是有限的，因而端粒可以作为细胞的“分裂钟”来预测细胞的复制能力。
二、端粒酶
端粒酶于1984年由sh锄pay等发现，它是由端粒酶RNA链和蛋白质组成的核糖核蛋白酶，直接参与端粒的形成，是一种能将真核生物染色体末端DNA加以延长的核酸蛋白复合物。
（一）端粒酶的结构成分
端粒酶包括3个组分：
端粒酶RNA（hTR）,端粒酶相关蛋白质1（TP1）,端粒酶催化亚单位（hTERT）.
（二）各成分的特点
hTR即人类端粒酶RNA，是人类端粒酶合成端粒DNA的模板，它是端粒酶发挥作用所必须的。
由于正常体细胞中都会存在hTR，却几乎没有端粒酶的活性，而且在多种肿瘤细胞中测得的hTR与端粒酶活性也不平行，因而它不能反映端粒酶活性高低。
TPl在端粒酶活性的调节中有重要作用，但有证据表示它不是端粒酶发挥活作用所必须。
hTERT是含有7个基元的转录酶，在端粒酶的激活中起关键作用，
无细胞的况下将hTR和hTER混合在一起即可表现端粒酶活性，是端粒酶活性的限速亚单位。
hTERT删A水平与端粒酶的活性成正相关：
将载有hTERT基因的质鹅转染端粒酶隐性的成纤维细胞，可重建端粒酶活性：
使hTERT基因突变，细胞则不表现端粒酶活性。
同一组织的不同部分，细胞分裂能力与端粒酶活性成正比，如在毛发生长初期的毛囊中，含有分裂活性细胞的部分表达端粒酶活性，而低度分裂活性细胞部分则表达较低水平的酶活性。
（三）端粒酶的主要功能
目前认为端粒酶的主要功能是维持染色体末端的端粒序列，即延长端粒DNA富含G的链，使其形成G～四联体或发夹结构。
保护染色体。
端粒酶还能修复已断裂的染色体末端，从而抵消因细胞分裂而导致的端粒DNA的消耗，维护遗传信息的完整性。
此外，端粒酶能合成串联重复的TTAGGG序列，这提供了TRF2结合位点，有助于防止染色体末端的融合。
三、端粒、端粒酶与细胞衰老
由于染色体“末端复制问题”的存在。
端粒DNA势必逐渐缩短以至于使细胞失去增殖能力而老化，因此，有人推测染色体末端的不完全复制可能是衰老细胞增殖潜能逐渐丧失的原因。
有研究发现培养的人成纤维母细胞中端粒的末端限制性片段的长度变短，这为衰老细胞中端粒的丢失提供了证据。
相反地，体外培养的永生化细胞、肿瘤细胞和胚胎细胞中端粒没有变化，这是由于细胞表达的端粒酶维持了端粒的长度。
由此提出了细胞衰老的端粒一端粒酶假说，认为细胞衰老是端粒复制问题得不到补偿的结果，端粒的缩短是正常体细胞复制老化的有丝分裂钟，当端粒长度缩短到一定程度，即所谓的末端限制片段（TRF）的长度为5～7kbp时，端粒末端产生一种DNA损伤信号，细胞停止分裂并退出周期，开始出现衰老的表现，这时细胞进入衰老期（M1）。
但是在细胞周期检验点发生突变时（如P53，Rb突变），细胞越过M1期继续分裂，端粒将持续缩短到一个危机点，此时，细胞进入危机期（M2）。
处于M2期的细胞染色体末端不具有“帽子”结构。
极易发生染色体融合、断裂。
以致大多数细胞将在这一时期死亡。
只有少数M2期的细胞能激活端粒酶，使细胞继续增值而获得永生化。
因此，能否越过M1期是形成恶性肿瘤的关健限速步骤。
随着细胞的分裂，正常细胞表现了端粒的缩短，而永生化的人类细胞却能维持稳定的端粒长度。
这说明了端粒的缩短可能引起细胞衰老。
能证明端粒缩短与细胞衰老有关的最有力证据是来自于人类的成纤维细胞。
年轻人成纤维细胞内端粒的平均长度为18～25kb，而老年人成纤维细胞内端粒的平均长度为8～1Okb，估计细胞每分裂一次端粒缩短5O～100bp。
kammorl等J通过研究表明，人类的甲状腺和甲状旁腺的端粒在49岁后以每年91～92bp的速率缩短，并不像一般的细胞端粒那样在生命早期就迅速减少。
如前所述，人类端粒酶的表达主要受控于其催化亚基hTERT，而端粒rU~A（hTa）一般在各种细胞中都有存在且含量基本恒定。
因此Bodnsr等在两种人类端粒酶负表达的体细胞（视网膜色素上皮细胞和包皮成纤维细胞）中已经表达了hTERT基因，研究表明，hTERT载体的克隆在这些细胞中表达了端粒酶的活性，并使他们的寿命延长了至少20代，且细胞衰老的生物学标记B·
半乳糖苷酶的表达也显著减少。
而单纯的引入hTERT不会对细胞正常的周期、接触抑制、粘附性、生长因子需求以及核型产生不良影响。
相反，有证据表明¨
引，在体外培养的牛胸腺细胞和兔成纤维细胞中，转染由hTERT与牛或兔端粒酶RNA杂交形成异源端粒酶后，细胞呈现出年轻化的趋势，在贴壁的速度、传代速度、健康状况等方面都占有明显的优势，从而形成了易于培养的新细胞系。
此外也有研究证实¨
。
当端粒酶延长端粒以后，切除hTERT基因，反而使细胞的寿命会更长。
若在M1期前或在M1期与M2期间表达hTERT基因，则会直接引起细胞的永生化。
这些证据都说明了端粒的长度而不是端粒酶决定了人类细胞的寿命。
虽然这些观察提出了端粒的缩短可能引起细胞衰老。
然而。
关于衰老细胞端粒和端粒酶的研究，还存在着比以上假说更复杂的机制。
啮齿类动物的端粒长度终生保持不变，并不随细胞的分裂而缩短。
Kipling对小鼠的研究结果表明，端粒缩短同衰老并没有密切关系，Susan等¨
副提出，在正常人的口腔角化细胞的衰老过程中，正常细胞的复制衰老是端粒酶失活造成的。
而没有端粒缩短的现象。
L札nd-blad-6通过对两种出芽酵母的研究发现，在端粒酶失活的情况下。
严重缩短的端粒可以通过RADSO和RAD51融合途径填充端粒DNA富含G的片段以维持端粒的功能。
最新研究显示¨
引，引起细胞衰老的原因与端粒的长度无关，而只与以下几个因素相关：
端粒的位置效应，DNA损伤信号，以及端粒富含G的3’末端突出的缺失。
虽然如此，端粒假说作为分裂的分子机制仍然是广为接受的学说，然而澄清这些例外的事实需要更加深入细致的研究。
四、端粒、端粒酶与肿瘤
自从1994年，Kim开始应用一种灵敏的基于PCR的端粒酶检测方法1'
RAP~（Te|omericRepeatAmplificationProtoco1）来探测人体组织中的端粒酶活性后，研究发现，90％的恶性肿瘤组织中都存在端粒酶活性，包括肺癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌等主要癌症和多数白血病、淋巴瘤。
而人体大多数正常细胞和组织，仅在生殖细胞、造血细胞、淋巴细胞等具有增值潜能的细胞中可检测到端粒酶活性。
这表明端粒酶的活化与肿瘤的发生发展密切相关，而且端粒酶对于维持肿瘤细胞的生存能力似乎是必需的。
最近对缺失端粒酶的小鼠研究表明，端粒的缩短在肿瘤发生和发展过程中扮演着双重角色。
当端粒缩短到临界长度，可引起染色体与基因组的不稳定，从而诱发肿瘤的形成。
相反，由于端粒的缩短，又可启动DNA损伤信号，进而抑制肿瘤的发生。
在一些慢性疾病中，如：
动脉脂肪硬化，溃疡性结肠炎等，可检测到缩短的端粒。
经实验证实，是由于缩短的端粒限制了组织和器官的再生功能，当引入TERT基因表达端粒酶时，可以恢复缩短的端粒。
因此，在衰老的细胞和慢性疾病过程中，可以通过激活端粒酶的活性，来延长组织和器官的再生功能。
端粒酶的激活一方面可以阻止端粒的进一步缩短以维持染色体与基因组的稳定；
但是另一方面又可促进肿瘤的形成及裂变。
最近有研究显示，在缺失端粒酶的裸鼠细胞中引入致癌基因RAS，可以表达SV40抗原，但由于缺乏端粒酶，而不易于肿瘤的形成。
相反，若引入hTERT与非致癌基因RAS共表达，则使细胞很容易形成肿瘤，这样的细胞即使在很大压力下也能显示超强的增殖能力。
由此可见，端粒酶有助于肿瘤的形成远胜于它对端粒的延长。
然而，端粒酶的激活是肿瘤形成所必须的吗?
Bias-CO等。
利用基因敲除使小鼠中的端粒酶RNA基因缺失，导致端粒酶的活性丧失，并发现在快速增殖的器官中，细胞由于缺失端粒酶而凋亡。
但丧失端粒酶活性的细胞在培养液中能够永生化、被病毒癌基因转化及在裸鼠中形成肿瘤。
这些肿瘤细胞可能依赖于非端粒酶的ALT途径来维持端粒长度。
近来的研究工作显示，ALT途径在肿瘤细胞中含有一种特殊的核内结构——ALT相关PML小体，这个小体能结合端粒、结合蛋白以及DNA损伤检验点蛋白，可能代替端粒酶的功能。
在某些肿瘤去分化的过程中端粒酶活性也未受到抑制。
研究小鼠皮肤乳头状瘤的结果表明，端粒酶活性与增殖率没有密切联系。
总而言之，在缺失端粒酶的情况下，并不影响肿瘤的初步形成，但是要维持肿瘤的发生、发展及恶性转化，却要有稳定的端粒长度，这往往要求端粒酶的重新激活。
由于端粒酶在绝大多数肿瘤细胞中表达而在正常体细胞中阴性，因此，目前认为端粒酶可做为肿瘤的特异治疗靶点。
Feng等将反义hTR转染Hela细胞后，经过23—26代倍增，端粒酶活性明显受到抑制，大部分细胞出现衰老死亡。
Kanazawa设计一种针对hTR模板区的锤头状核酶，将该酶与肝癌细胞株HepG2的抽提物共同孵育，端粒酶的活性明显受到抑制，提示也可以通过该方法诱导肿瘤细胞衰老。
五、衰老与肿瘤
衰老使得细胞进入不可逆转的增殖抑制状态，但仍然具有代谢活性，这被称为终末增殖停滞（termi-halproliferativelifespanarrest）。
显然细胞衰老阻止了其永生化过程，但不是唯一的途径。
另外，虽然细胞衰老与肿瘤的发生在分子水平和细胞水平上是两个截然不同的生命现象，但是细胞增殖衰老的紊乱则最终导致细胞生长失控，细胞衰老的停滞主要发生在G1期，G1期也是人类肿瘤突变最常见的。
因此确定衰老相关基因，对于认识肿瘤发生及肿瘤抑制都将是非常有意义的。
根据国外学者推测，细胞衰老基因可分两种，一是细胞增殖相关基因，如P53，Rb，p16等；
二是端粒酶相关基因。
前者有部分被克隆，并被认为是肿瘤抑制因子，后者的克隆研究正在开展。
如果能确定大量的衰老基因，那么通过采用抑制端粒酶活性或诱导肿瘤细胞重新获得衰老的方法，来抑制肿瘤生长可能成为现实。
六、问题和展望
如果端粒酶的激活可以促进肿瘤的形成，那么以端粒酶为靶点，来治疗端粒行为的异常就存在很大的冒险，但是相比之下，端粒的延长，又能稳定基因与染色体，增加组织和器官的再生功能。
为了解决这些问题，就需要研究人员对端粒和端粒酶的结构、功能进行更深入的研究，以便为以端粒酶为靶点的基因治疗提供基础。
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