苏州大学医学院基础医学系教案课程临床生物化学与检验授课人Word下载.docx
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一、肿瘤标志物的评估
二、肿瘤标志物的检测方法和质量控制
三、多种肿瘤标志物联合应用
重点：
临床常见疾病的肿瘤标志物及应用
难点：
肿瘤标志物的评估及联合应用
教媒
具体
及课
多件
方法：
多媒体、板书相结合
多媒体为主，以板书的形式突出重点内容。
具体教学内容
概述
一、肿瘤标志物的概念
所谓肿瘤标志物，指在肿瘤发生和增殖过程中，由肿瘤细胞合成、释放，存在于组织、细胞或体液中，反映肿瘤存在和生长的一类物质。
通过对这类物质的分析，能帮助人们从正常组织中区别肿瘤或测定肿瘤细胞核、细胞质以及对细胞膜上的特性进行分析，以此作为辨认肿瘤细胞的标志。
理想的肿瘤标志物应该具有下列条件：
①标志物的含量变化应与肿瘤的生长、消退、转移有直接的定性或定量的比例关系；
②标志物应具有较高的特异性，能比较明显地区别于正常人群和良性肿瘤；
③检测这类标志物的方法简便，易推广，而且成本较低。
根据肿瘤标志物的来源以及它的特异性，大致可分为两大类。
1.肿瘤特异性标志物是一种肿瘤所产生的特异性物质。
例如前列腺特异性抗原（PSA）就是前列腺肿瘤所产生的特异性标志物质，只有患前列腺癌时，PSA才会显著性升高。
2.肿瘤辅助标志物由一类组织类型相似而性质不同的肿瘤产生，其含量有较大的变化。
这类标志物往往易同良性肿瘤或正常组织发生混淆。
二、肿瘤标志物的分类
肿瘤标志物分类大致有两种：
其一按肿瘤标志物的来源，第二是按肿瘤标志物本身的化学特性。
主要包括：
①肿瘤胚胎性抗原标志物；
②糖类标志物；
③酶类标志物；
④激素类标志物；
⑤蛋白质类标志物；
⑥基因类标志物。
三、肿瘤标志物的临床应用
近年来，肿瘤标志物在临床上已得到较广泛的应用，目前主要应用于：
①肿瘤的普查；
②肿瘤高危人群的筛选；
③肿瘤的诊断和鉴别诊断；
④肿瘤监测；
⑤肿瘤分类、分期、定位；
⑥肿瘤治疗。
常见的肿瘤标志物的测定
一、胚胎性抗原标志物的测定
在人类发育过程中，许多原本只在胎盘期才具有蛋白类物质，应随胎儿的出生而逐渐停止合成和分泌，但因某种因素的影响，特别是肿瘤状态时，会使得机体一些“关闭”的基因激活，出现了返祖现象，而重新开启并重新生成和分泌这些胚胎、胎儿期的蛋白。
胚胎类肿瘤标志物
名称
性质
相关肿瘤
甲胎蛋白
糖蛋白70ku
肝细胞、胚细胞（非精原细胞瘤）
β-癌胚抗原
80ku
结肠
癌胚铁蛋白
糖蛋白600ku
肝
癌胚抗原
糖蛋白22ku
结肠、直肠、胰腺、肺、乳腺
胰癌胚抗原
糖蛋白40ku
胰腺
鳞状细胞抗原
糖蛋白44-48ku
肺、皮肤、头和颈部
组织多肽抗原
细胞角蛋白8.18.19
乳腺、结肠
这类蛋白虽然与肿瘤组织不一定都具有特定的相关性，但与肿瘤的发生存在着内在的联系，故被作为一种较为常见的肿瘤标志物。
（一）甲胎蛋白（AFP）
AFP主要是由胎肝细胞和卵黄囊合成的单一多聚体肽链的糖蛋白。
其分子量平均为70ku，含糖4％。
AFP在电场中泳动于α-球蛋白区，是胎儿血清中的主要蛋白质。
1964年Tatarinov发现肝癌患者血清中检测到AFP。
【正常参考范围】成人血浆AFP浓度低于25μg/L。
【临床意义】AFP是原发性肝癌的最灵敏、最特异的肿瘤标志物，80%以上的原发性肝癌患者血清AFP明显增高，AFP检测诊断肝癌的标准为：
①血清AFP测定结果大于500μg/L持续4周；
②AFP含量有不断增高者；
③血清AFP测定结果大于200μg/L持续8周。
肝癌患者血清AFP含量变化的速率和程度与肿瘤组织分化程度高低有一定相关性，分化程度较高的肿瘤AFP含量常大于200μg/L。
血清AFP含量的检测对其它肿瘤的监测亦有重要临床价值。
如睾丸癌、畸胎瘤、胃癌、胰腺癌等患者血清AFP含量可以升高。
（二）癌胚抗原（CEA）
癌胚抗原是1965年Gold和Freedman首先从胎儿及结肠癌组织中发现的，CEA是一种分子量为22ku的多糖蛋白复合物，45％为蛋白质。
CEA的编码基因位于19号染色体。
一般情况下，CEA是由胎儿胃肠道上皮组织、胰和肝的细胞所合成，通常在妊娠前6个月内CEA含量增高，出生后血清中含量很低。
【正常参考范围】成人血清中CEA浓度小于2.5μg/L。
【临床意义】当CEA大于60μg/L时，可见于结肠癌、直肠癌、胃癌和肺癌。
CEA值升高，表明有病变残存或进展。
如肺癌、乳腺癌、膀胱癌和卵巢癌患者血清CEA量会明显升高，大多显示为肿瘤浸润，其中约70％为转移性癌。
一般来说，手术切除后6周，CEA水平恢复正常，否则提示有残存肿瘤，若CEA浓度持续不断升高，或其数值超过正常5-6倍者均提示预后不良。
二、糖类抗原标志物的测定
肿瘤标志物相关物质是指由肿瘤细胞表面的抗原物质或者是肿瘤细胞所分泌的物质，这类物质又是单克隆抗体，故又称为糖类抗原（carbohydrateantigen，CA）。
这类标志物出现为临床肿瘤的诊断带来方便，糖类抗原标志物产生又可分为两大类，为高分子粘蛋白类和血型类抗原。
糖类高分子粘蛋白抗原肿瘤标志物
癌肿
常用单克隆抗体
CA125
糖蛋白＞200ku
卵巢、子宫内膜
OC125
CA15-3
糖蛋白400ku
乳腺、卵巢
DF3和115D3
CA549
高分子量糖蛋白
BC4E549 BC4n154
CA27.29
乳腺
B27.29
DU-PAN-2
粘蛋白100-500ku
胰腺、卵巢、胃
血型类抗原肿瘤标志物
CA19-9
唾液酸化Lexa
胰腺、胃肠、肝
116NS19-9
CA19-5
唾液酸化Lea和Leag
胃肠、卵巢
116NS19-5
CA50
唾液酸化Lea
胰腺、胃肠、结肠
Colo-50
CA72-4
唾液酸化Tn
卵巢、乳腺、胃肠、结肠
B27.3.cc49
CA242
唾液酸化CHO
结肠、直肠、胰腺
C242
这类抗原标志物的命名是没有规律的，有些是肿瘤细胞株的编号，有些是抗体的物质编号，常用检测方法是单克隆抗体法。
（一）CA19-9
CA19-9是1979年Koprowski等用结肠癌细胞免疫小鼠，并与骨髓瘤杂交所得116NS19-9单克隆抗体，它是一种分子量为5000ku的低聚糖类肿瘤相关糖类抗原，其结构为Lea血型抗原物质与唾液酸Lexa的结合物。
【正常参考范围】血清CA19-9含量为2～16U/ml（RIA法）。
【临床意义】CA19-9是胰腺癌和结、直肠癌的标志物。
血清CA19-9阳性临界值为37U/ml。
胰腺癌患者85以上为阳性。
肿瘤切除后CA19-9浓度会下降，如再上升，则可表示复发。
结直肠癌、胆囊癌、胆管癌、肝癌和胃癌的阳性率也会很高，若同时检测CEA和AFP可进一步提高阳性检测率。
良性疾患时如胰腺炎和黄疸，CA19-9浓度也可增高，但往往呈“一过性”，而且其浓度多低于120U/ml，必须加以鉴别。
（二）CA125
CA125是一种大分子多聚糖蛋白，是重要的卵巢癌相关抗原。
分子量为200ku，加热至100℃时CA125的活性破坏。
【正常参考范围】血清CA125＜35.0U/ml（RIA法）。
CA125是上皮性卵巢癌和子宫内膜癌的标志物，浆液性子宫内膜样癌、透明细胞癌、输卵管癌及未分化卵巢癌患者的CA125含量可明显升高。
当卵巢癌复发时，在临床确诊前几个月便可呈现CA125增高，尤其卵巢癌转移患者的血清CA125更明显高于正常参考值。
动态观察血清CA125浓度有助于卵巢癌的预后评价和治疗控制，经治疗后，CA125含量可明显下降，若不能恢复至正常范围，应考虑有残存肿瘤的可能。
（三）CA15-3
CA15-3是一种乳腺癌相关抗原，于1984年由Kufu和Hilkens等人发现，CA15-3分子量为400ku，分子结构尚未清楚。
【正常参考范围】血清CA15-3＜28U/ml（RIA法）。
【临床意义】30%～50%的乳腺癌患者CA15-3明显升高，它也是监测乳腺癌患者术后复发的最佳指标，当CA15-3大于100U/ml时，可认为有转移性病变，其含量的变化与治疗结果密切相关。
肺癌、胃肠癌、卵巢癌及宫颈癌患者的血清CA15-3也可升高，应予以鉴别，特别要排除部分妊娠引起的含量升高。
（四）CA50
CA50是1983年Lindholm等从抗人结、直肠癌Colo-205细胞株的一系列单克隆抗体中筛选出的一株对结、直肠癌有强烈反应，但不与骨髓瘤细胞及血淋巴细胞反应的单克隆抗体，所能识别的抗原称CA50。
CA50存在于细胞膜内，其抗原决定簇为唾液酸Lea血型物质与唾液酸-N-四氧神经酰胺。
【正常参考范围】血清CA50＜20U/ml（RIA法）。
【临床意义】CA50是胰腺和结、直肠癌的标志物，因CA50广泛存在胰腺、胆囊、肝、胃、结直肠、膀胱、子宫，当细胞恶变时，由于糖基转化酶的失活或胚胎期才能活跃的某些转化酶被激活，造成细胞表面糖类结构性质改变而形成CA50，因此，它又是一种普遍的肿瘤标志相关抗原，而不是特指某个器官的肿瘤标志物。
所以在多种恶性肿瘤中可检出不同的阳性率。
三、酶类抗原标志物的测定
酶及同工酶是最早出现和使用的肿瘤标志物之一。
在肿瘤标志酶中根据来源可将其分为两类：
①组织特异性酶，因组织损伤或变化而使储存在细胞中的酶释放，如前列腺特异性抗原等；
②非组织特异性酶，主要是肿瘤细胞代谢加强，
酶类肿瘤标志物
分子量及同工酶
醛缩酶
160ku
3个
碱性磷酸酶
95ku
7个
骨、肝、白血病、肉瘤、卵巢等
淀粉酶
45ku
胰腺等
谷胱甘肽转移酶
多种
肝、胃、结肠
肌酸激酶
83ku
4个
前列腺、肺、结肠、卵巢等
γ-谷氨酰转移酶
90ku
12个
乳酸脱氢酶
135ku
5个
肝、淋巴瘤、白血病
神经原特异性烯醇化酶
73ku
2个
肺（小细胞）、神经母细胞瘤、类癌、黑色素瘤、嗜铬细胞瘤
5-核苷酸酶
6区带
α-L岩藻糖苷酶
230ku
8个
核糖核酸酶
卵巢、肺、大肠等
前列腺特异性抗原
34ku
前列腺
在酶标志物分析中，肿瘤标志同工酶可分为三大类型：
①异位型同工酶：
指某种瘤组织改变了自己的分泌特性，而去分泌表达了其它成年组织的同工酶的类型；
②胚胎型同工酶：
某些组织在肿瘤状态时，使酶的同工酶谱退化到胚胎时未分化状态，而分泌出大量的胚胎期的同工酶，这种变化往往与肿瘤的恶性程度成正比；
③胎盘型同工酶：
有些肿瘤组织会分泌出某些原属胎盘阶段的同工酶谱。
（一）前列腺特异性抗原（PSA）
PSA是1979由Wang等从前列腺肥大症患者的前列腺组织中分离出来的丝氨酸蛋白酶，分子量34ku，编码基因定位于19q13，PSA仅存在于前列腺上皮细胞的胞质、导管上皮和粘液内，具有糜蛋白酶样和胰蛋白酶的活性，PSA具有高度的组织特异性。
【正常参考范围】男性含量小于2.5μg/L（RIA法、ElA法）。
【临床意义】PSA是前列腺癌的特异性标志物，也是目前少数器官特异性肿瘤标志物之一。
前列腺癌是男性泌尿系统的主要囊性肿瘤，前列腺癌患者血清PSA明显增高，放疗后疗效显著者，50%以上2个月内血清PSA降至正常。
故PSA测定可作为监测前列腺癌病情变化和疗效的重要指标。
（二）前列腺酸性磷酸酶（PAP）
PAP是前列腺分泌的一种含有两条肽链的糖蛋白酶，分子量102ku，含糖量13%。
在pH5.0的酸性环境中活性最强，能水解各种有机磷酸酯。
【正常参考范围】＜4U/L（RIA、ELISA法）
【临床意义】测定PAP诊断前列腺癌的特异性比PSA高，可达96%。
但灵敏度较PSA低，PAP和PSA联合使用可提高诊断的阳性率。
（三）神经原特异性烯醇化酶（NSE）
烯醇化酶是催化糖原酵解途径的酶。
由3个不同的亚基α、β、γ，组成5种形式的同工酶αα、ββ、γγ、αβ、αγ。
γγ亚基同工酶存在于神经原和神经内分泌组织，称为NSE。
αα亚基同工酶定位于胶质细胞，称为非神经原特异性烯醇化酶（NNE）。
NSE和NNE的分子量分别为78ku和87ku。
【正常参考范围】0.6-5.4μg/L。
【临床意义】NSE是神经母细胞瘤和小细胞肺癌的标记物。
神经母细胞瘤是常见的儿童肿瘤，占1～14岁儿童肿瘤的8%-10%。
NSE作为神经母细胞瘤的标志物，对该病的早期诊断具有较高的临床应用价值。
小细胞肺癌（SCLC）是一种恶性程度高的神经内分泌系统肿瘤，约占肺癌的25%～30%，它可表现神经内分泌细胞的特性，有过量的NSE表达，比其它肺癌和正常对照高5-10倍以上。
SCLC患者血清NSE检出的阳性率可高达65%-100%，目前已公认为NSE可作为SCLC高特异性、高灵敏性的肿瘤标志物。
（四）α-L岩藻糖苷酶（AFU）
AFU是存在于血清中的一种溶酶体酸性水解酶，分子量230ku，单个亚基分子量50ku。
【正常参考范围】324±
90μmol/L（化学法）。
【临床意义】AFU是原发性肝癌的一种新的诊断标志物，广泛分布于人体组织细胞、血液和体液中，原发性肝癌患者血清AFU活力显著高于其它各类疾患。
虽然AFU升高的机制不甚明了，但可能有以下几种：
①肝细胞和肿瘤细胞的坏死使溶酶体大量释放入血；
②正常肝细胞的变性坏死可使摄取和清除糖苷酶的功能下降；
③肿瘤细胞合成糖苷酶的功能亢进；
④肿瘤细胞可能分泌某种抑制因子，抑制肝细胞对糖苷酶的清除能力或释放某些刺激因子，促进肝细胞或肿瘤细胞本身合成糖苷酶。
四、激素类抗原标志物的测定
当具有分泌激素功能的细胞癌变时，就会使所分泌的激素量发生异常。
常称这类激素为正位激素异常。
而异位激素则是指在正常情况下不能生成激素的那些细胞，转化为肿瘤细胞后所产生的激素，或者是那些能产出激素的细胞癌变后，分泌出的是其它激素细胞所产生的激素。
激素类肿瘤标志物
激素
儿茶酚胺类
嗜铬细胞
促肾上腺皮质激素
4.5ku
库欣综合征、肺（小细胞）
抗利尿激素
肺（小细胞）、原发性类癌等
降钙素
3.5ku
甲状腺髓质
生长激素
21ku
垂体腺瘤、肾、肺
hGG
胚胎绒毛膜、睾丸（非精原细胞癌）
人胎盘催乳素
22ku
滋养层、性腺、肺、乳腺
甲状旁腺素
肝、肾、乳腺、肺等
催乳素
胰高糖素
3ku
胰高糖素瘤、嗜铬细胞瘤
（一）人绒毛膜促性腺激素（hCG）
hCG是由胎盘滋养层细胞所分泌的一类糖蛋白类激素，在正常妊娠妇女血中可以测出hCG。
hCG有α、β两个亚基，α-亚基的分子量约为13000，α-亚基的生物特性与卵泡刺激素（FSH）和黄体生成激素（LH）的α-亚基相同。
β-亚基的分子量约15000，β-亚基为特异性链，可被单克隆抗体检测，也是一个较好的标志物。
【正常参考范围】尿液：
hCG的总量（ELISA法）小于30μg/L，
血清：
hCG小于10μg/L，β-hCG小于3.0μg/L。
【临床意义】当发生绒毛膜上皮癌，胎盘绒毛膜细胞恶变为恶性葡萄胎后，hCG会明显增高。
乳腺癌、睾丸癌、卵巢癌hCG也会增高。
（二）降钙素（CT）
CT是由甲状腺滤泡C细胞分泌的一种多肽激素，分子量3.5ku。
【正常参考范围】＜100ng/L
【临床意义】CT是甲状腺髓样癌的肿瘤标志物。
肺癌、乳腺癌、胃肠道癌及嗜铬细胞瘤病人可因高血钙或异位分泌使血清CT增高。
（三）儿茶酚胺类及其衍生物
儿茶酚胺类激素是由肾上腺髓质中的一些交感神经节纤维末梢终止髓质细胞（又称嗜铬细胞）产生和分泌，包括肾上腺素（E）、去甲肾上腺素（NE）和多巴胺（DA）等，它们既是激素又是神经递质。
1.变肾上腺素变肾上腺素是儿茶酚胺的甲基化代谢产物，甲基化是在肝细胞微粒体中进行，而儿茶酚胺的形成是在肾上腺髓质的嗜铬细胞及交感神经末梢处形成。
【正常参考范围】0.30-1.50μmol/24h尿。
变肾上腺素浓度增高是分泌型嗜铬细胞瘤的主要标志物。
2.香草扁桃酸（3-甲氧-4羟苦杏仁酸，VMA）是肾上腺素和去甲肾上腺素经单胺氧化酶（MAO）和儿茶酚胺-O-甲基转移酶（COMT）的作用下，甲基化和脱氨基的降解产物。
VMA主要是从尿中排出。
【正常参考范围】成人5.0-35.0μmol/24h尿。
【临床意义】常被认为是神经母细胞瘤、神经节瘤和嗜铬细胞瘤的标志物。
约有70％神经母细胞瘤患者均有VMA增高，在IV期神经瘤患者VMA/HVA的比值可作为预后评价指标，在儿童的神经母细胞瘤患者中，VMA也是一项重要指标。
VMA又可作为嗜铬细胞瘤的诊断首选标志物，但有时增高程度不稳定，宜同时测定尿中儿茶酚胺和变肾上腺素。
五、基因类标志物的测定
随着分子生物学的理论和技术的发展，癌基因和抑癌基因的检测已成为肿瘤临床诊断新一代的标志物。
（一）癌基因类肿瘤标志物
癌基因或肿瘤基因是指在自然或实验条件下，具有潜在的诱导细胞恶性转化的基因。
从目前的资料分析，引起细胞恶变功能的基因已达30余种。
常见癌基因类肿瘤标志物
癌基因
细胞株或原发肿瘤
N-myc
细胞株
神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、肺癌（小细胞）
原发肿瘤
神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤
C-erb-2
胃腺癌、肾腺癌、乳腺癌
N-ras
胃腺癌
C-myc
乳腺癌、胃腺癌、肺癌（巨细胞）
急性粒细胞白血病、结肠腺癌
H-ras
黑色瘤
膀胱癌、皮肤鳞癌
K-ras
结肠癌、骨肉瘤
膀胱癌、胰腺癌、卵巢癌
1.ras基因家族及其表达产物ras基因表达产物是由188个或189个氨基酸组成的21ku蛋白质，故Ras基因编码产物为p21ras蛋白。
其本质为G蛋白，具有GTP酶活性，可水解GTP生成GDP。
当机体发生肿瘤时，编码p21ras蛋白的第12、13及61位氨基酸的核苷酸可以发生点突变，突变型的p21ras蛋白不具有GTP酶活化，无法使GTP水解为GDP。
另外尚可在肿瘤中发现p21ras蛋白表达过度。
ras基因检测的方法
（1）PCR-SSCP（单链构象多态性）、DGGE（变性梯度凝胶电泳，）、PCR-ASO（等位基因特异性寡核苷酸杂交，）和测序技术：
探测点突变。
（2）免疫组织化学：
用RAP-5单抗。
（3）Southern印迹法及Northern印迹法。
（4）ELISA法及Western印迹法。
ras基因家族与肿瘤的关系
ras基因家族与肿瘤的关系
肿瘤类型
临床意义
乳腺癌
c-Ha-ras基因mRNA水平升高与恶性肿瘤进展期中p21ras水平相关
结直肠癌
50％的肿瘤出现c-Ki-ras基因点突变
肺癌
20％-30％肿瘤出现ras基因家族成员点突变，其中c-Ki-rad基因点突变与预后不良相关
胰腺癌
90％左右的肿瘤出现c-Ki-ras基因点突变
胃癌
在恶性肿瘤中p21表达水平明显升高，c-Ha-ras基因编码第12位氨基酸突变与肿瘤转移及预后不良相关
髓性白血病
10％-50％的肿瘤中出现c-N-ras基因突变
膀胱癌
部分病例可出现c-Ha-ras基因点突变及p21ras表达过度
2.myc基因家族及其表达产物1997年Duesbery等发现myc癌基因与禽类MC29病毒具有相似性。
Myc基因家族共有6成员：
C-myc、N-myc、L-myc、P-myc、R-myc及B-myc。
其中C-myc、N-myc及L-myc与一些人类肿瘤相关。
当机体发生肿瘤时，myc基因家族成员可以发生染色体基因易位、基因扩增以及表达过度。
myc基因检测的方法
（1）标准细胞核型分析：
基因易位。
（2）原位杂交：
ELISA法。
（4）RT-PCR方法。
myc基因家族成员与肿瘤的关系
myc基因家族成员与肿瘤的关系
肿瘤种类
神经母细胞瘤
在20％的肿瘤中有N-myc基因扩增
6％-57％的肿瘤中可见c-myc基因扩增。
c-myc基因mRNA水平升高与预后不良相关
10％-20％的肿瘤中可见c-myc基因扩增
小细胞肺癌
30％肿瘤可见L-myc基因过度表达
宫颈癌
c-myc过度表达与预后不良相关
（二）抑癌基因
机体中有一类对正常细胞增殖起负调节作用的基因称为抑癌基因。
当这类基因丢失、失活或变异时，往往会促使细胞失控而呈恶性生长。
常见抑癌基因类肿瘤标志物
抑癌基因
染色体
RB
13q14
视网膜母细胞瘤、骨肉瘤、乳腺癌、肺癌
WT1
11p13
Wilms肿瘤
NF-1
17q11.1q
神经纤维瘤
DCC
13q21.3
结肠癌
P53
17q21-1q
肺癌、结肠癌、胃癌
Erb-B-2
7p
1.RB基因及其表达产物1986年Friend等成功地克隆了RB基因。
RB基因定位于第13号染色体的13q14区，共有27个外显子，26个内含子，DNA长度约200kb。
其编码的蛋白质产物为p110。
当机体发生肿瘤时，RB基因的主要变化形式有：
缺失、突变、甲基化、表达失活及与病毒和细胞癌蛋白结合引起功能性失活。
RB基因检测的方法
（1）PCR-SSCP、DGGE、PCR-ASO及测序技术：
检测点突变。
（2）PR-PCR、PCR。
（3）PCR-RFLP限制片段长度多态性。
RB基因与肿瘤的关系
（1）RB基因突变约见于40％的视网膜母细胞瘤。
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