国家自然科学基金2实用模板Word格式文档下载.docx
《国家自然科学基金2实用模板Word格式文档下载.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《国家自然科学基金2实用模板Word格式文档下载.docx（24页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
一、简表
名
中
文
口
腔
癌
肺
高
转
移
相
关
抗
原
基
因
的
筛
选
及
其
核
酸
疫
苗
研
究
称
英
Screenandnucleicacidimmunizationoflunghighlymetastaticrelatedantigengeneinoralcancerccancercancer
类别
A.自由申请B.高技术探索C.青年D.地区
E重大F.重点H.专项AAA
C
高技术探索项目主题号
项
申报
名称1
口腔颌面外科学
名称2
A.基础研究
目
学科
代码1
代码2
B.应用基础
B
申请金额
所用实验室
姓
中文
拼音
申
请
专业
技术职务
名称代码
所
名称
者
在单
性质
位
所在地
总人数
6
主
姓名
签字
要
何荣根
成
陈万涛
邓永强
员
林李嵩
周晓健
组
不
含
内
容
和
意
义
摘
采
用
生
物
芯
片
技
术
对
人
腺
样
囊
性
低
细
胞
系
克
隆
株
进
行
大
规
模
表
达
定
量
比
分
析
鉴
设
计
构
建
同
源
立
动
型
运
子
外
科
将
导
入
肿
瘤
免
效
果
一
步
阐
明
恶
机
理
寻
找
新
有
靶
点
为
防
治
提
供
方
法
。
主题词
1.主题词数量不多于3个；
2.主题词之间空一格（英文用/分隔）
英文
tumor/metastasis/gene
简表填写要求
一、简表内容将输入计算机，必须逐项认真填写，采用国家公布的标准简化汉字。
简表中所有代码以最新发布的《国家自然科学基金申请项目分类目录及代码》为准填写。
高技术探索课题主题号按《高技术新概念新构思课题项目指南》中主题号填写，申请其重点项目时项目类别也填写B，并在申请书封面右上角加注“高技术探索课题重点项目”。
二、凡选择性栏目,将相应提示符A、B等之一填入该栏的右下角。
三、部分栏目填写要求：
项目名称──应确切反映研究内容和范围,最多不能超过25个汉字（包括标点符号）。
基础研究──指以认识自然现象、探索自然规律为目的的,不直接考虑应用目标的研究活动。
应用基础研究──指有广泛应用前景，但以获取新原理、新技术、新方法为主要目的的研究。
报审学科──申请项目所属的最基础学科。
如涉及多学科可填写两个,先填为主学科。
申请金额──以万元为单位,用阿拉伯数字表示,注意小数点。
起止年月──起始时间从申请的次年的1月算起。
完成时间为完成年度的12月。
所用的实验室──系指研究项目将利用的实验室,仅填写国家计委批准的国家重点实验室或部门批准的开放实验室。
所在单位名称及代码──按单位公章填写全称。
例如“中国科学院西安光学精密机械研究所”不得填写“中科院西安光机所”或“西安光机所”。
全称中的数字,一律写中文，例如：
航空航天工业部七O一研究所。
首次申请国家自然科学基金的单位,尚未编入单位代码,其代码暂不填。
参加单位数──指研究项目组成员所在单位数,包括主持单位和合作单位,以阿拉伯数字表示。
项目组主要成员──指在项目组内对学术思想、技术路线的制定与理论分析及对项目的完成起主要作用的人员。
本栏双线右侧内容不输入计算机。
研究内容和意义──摘要与主题词均录入软盘。
二、立论依据
（包括项目的研究意义、国内外研究现状分析,并附主要的参考文献及出处）
对基础研究，着重结合国际科学发展趋势，论述项目的科学意义；
对应用基础研究，着重结合科学前沿，围绕国民经济和社会发展中的重要科技问题，论述其应用前景。
项目的科学意义
恶性肿瘤肺转移的防治是临床上进一步提高患者生存率和治愈率的关键所在，具备肺转移潜能的癌细胞亚群是肿瘤组织与宿主组织之间长期相互作用、相互选择的结果,在此过程中,这些癌细胞亚群产生了不同于其它亚群的特点,包括转移相关基因及由其所决定的细胞和群体水平的特点,其中，肺高转移相关抗原基因是一个相当重要的方面[1]，因而，筛选和鉴定肺高转移相关抗原基因，有助于深入理解和阐明肺转移的机制。
在此基础上，设计和构建有效的核酸疫苗，发展紧密结合临床实际的转染方法，激活机体的特异性主动免疫，必将对杀伤肺高转移性癌细胞亚群，进而控制肺转移有十分重要的意义。
国内外研究现状分析
迄今为止,与口腔癌侵袭转移相关的基因只局限在P53`C-erB-2`nm23等少数几个基因上[2],其根本原因在于以往的研究方法受到分子生物学技术的极大限制,只能研究单个或少数几个基因。
1996年,在人类基因组计划的研究中，StevenFodor等[3]充分结合并灵活运用了计算机、DNA合成、探针杂交、照相平板印刷、激光共聚焦扫描等技术,创造了完整的DNA生物芯片,可同时定量检测成千上万个基因的表达谱,结合生物信息学可从整体上分析疾病。
1998年，Gress等[4]采用含20,736个基因片段的DNA芯片,检查了胰腺癌细胞株、胰腺癌组织与对照胰腺组织的基因表达谱,发现胰腺癌存在129个新基因序列和97个EST,从而找出了形成胰腺癌恶性表型的相关基因。
现阶段，国内已建立DNA生物芯片技术和人腺样囊性癌细胞系ACC-2及其肺高转移克隆株ACC-M[5]，我们采用含14，000个基因片段的DNA生物芯片首次对遗传背景相同而生物学行为不同的ACC-2和ACC-M进行了大规模的基因表达定量对比分析，结果表明，低转移性的ACC－2细胞系和肺高转移性的ACC－M细胞株比较，有显著差异的基因36个，有差异的基因213个。
这些基因涉及跨膜蛋白、细胞信号传导、细胞代谢过程等诸方面。
其中的肺高转移相关抗原基因可通过生物信息学分析、反义核酸、血小板凝集试验和裸小鼠移植瘤肺转移模型来筛选和鉴定。
对肿瘤抗原加工递呈过程和机体免疫反应的深入研究表明,影响肿瘤免疫治疗效果不理想的重要原因在于肿瘤相关抗原是正常细胞中有或曾经有表达的蛋白质,只是在肿瘤细胞中有不适当的表达,因而引起了机体的免疫耐受,为了克服免疫耐受,1998年Disis等[6]采用同源的人HER-2/neu蛋白免疫小鼠,诱导了比使用小鼠自身neu蛋白大得多的机体免疫。
同时发现不使用完整的肿瘤抗原,而只使用肿瘤抗原多肽片段,能更有效地诱发机体免疫反应。
但以上研究均采用的是肽疫苗，近年来发展的核酸疫苗因安全、热稳定和能引发持久的细胞和体液免疫等特点,从而比肽疫苗更具发展潜力[7]。
核酸疫苗集中了减毒疫苗和亚单位疫苗的优点,既可以不断表达抗原蛋白,又可以克隆所需基因片段,以激发理想的免疫反应,国内外对以T细胞识别的肿瘤抗原为中心的抗肿瘤核酸疫苗免疫治疗进行了大量的研究[8.9],表明能诱发机体的抗肿瘤免疫反应,杀伤癌细胞。
但目前关于肺转移相关抗原核酸疫苗的研究尚未见报道。
本研究在筛选鉴定肺高转移相关抗原基因的基础上，设计构建同源的核酸疫苗，建立癌细胞动物模型，采用已建立的紧密结合临床实际的分子外科转基因方法，研究其抗肿瘤效果，将对深入理解肺转移的机制和临床外科治疗模式的发展产生积极影响[10]。
参考文献
1.Resser-JR;
Carbone-DP.Immunotherapyofheadandneckcancer.Curr-Opin-Oncol.1998May;
10（3）:
226-32
2Clayman-GL;
Frank-DK;
etalAdenovirus-mediatedwild-typep53genetransferasasurgicaladjuvantinadvancedheadandneckcancers.Clin-Cancer-Res.1999Jul;
5（7）:
268-271
3.Strachan.T,Abitbol.M,etal.Anewdimensionforthehumangenomeproject:
towardscomprehensivemaps.NatureGenetic.1997,16;
126-131
4.GressTM,Muller-PillaschF,etal.Apancreaticcancer-specificexpressionprofile.Oncogene,1998,13:
1819-1830
5.关晓峰,邱蔚六等.肺高转移性腺样囊性癌细胞株的筛选.中华口腔医学杂志,1996;
2:
74-77.
6.M.L.Disis,F.Mshiotaetbal.HumanHER-2/neuproteinimmunizationcircumventstolerancetoratneu:
avaccinestrategyforselftumorantigens.Immunology.1998,93:
192-199.
7.Seder,RobertA.;
Gurunathan,Sanjay.DNAVaccines:
DesignerVaccinesforthe21stCenturyTheNewEnglandJournalofMedicine.1999;
341（4）:
277-279
8.CiernikIF,BerzofskyJAetal.InductionofcytotoxicTlymphocytesandantitumorimmunitywithDNAvaccinesexpressingsingleTcellepitops.JImmunol1996,156:
2369-2375
9.GaryL.Clayman,AdelK.EI-naggaretalInvivomoleculartherapywithp53adenovirusformicroscopicresidualheadandnecksquamouscarcinoma.CancerResearch,1995;
55:
1-6.
10.JackA.Roth.Molecularsurgeryforcancer.ArchSurg.1992;
127:
1298-1302.
三、研究方案
1.研究目标、研究内容和拟解决的关键问题
研究目标:
已建立人腺样囊性癌细胞系ACC-2及其肺高转移性克隆株ACC-M,采用DNA生物芯片技术对这两个遗传背景相同而生物学行为不同的癌细胞系的基因表达谱进行定量对比扫描，运用生物信息学、反义核酸技术、分子杂交来筛选鉴定肺高转移相关抗原基因，同时建立癌细胞动物模型，设计构建与口腔癌肺高转移相关抗原基因序列同源的核酸疫苗，采用已建立的紧密结合临床实际的分子外科转基因方法，深入研究其抗肿瘤免疫效果。
研究内容
1.运用DNA生物芯片技术（含14，000个基因）对腺样囊性癌细胞系ACC-2及其肺高转移性克隆株ACC-M进行大规模的基因表达谱定量对比分析。
2.结合生物信息学的聚类分析和同源分析、反义核酸技术、血小板凝集试验、裸小鼠移植瘤肺转移模型来筛选鉴定肺高转移相关抗原基因,通过RT-PCR和分子杂交进一步在临床手术标本和其它口腔癌细胞系中确证.
3.选用含巨细胞病毒（CMV）启动子和β-Gal基因的真核表达载体,设计构建与肺高转移相关抗原基因同源的核酸疫苗。
4.建立癌细胞动物模型，应用分子外科转基因方法，通过荷瘤动物模型的COX生存分析、T细胞亚群功能测定、抗β-Gal抗体测定来研究其体内抗肿瘤效应的强度。
拟解决的关键问题：
1对DNA芯片所获得的大量基因信息进行有效的分析筛选和鉴定。
2.核酸疫苗的设计。
3.抗肿瘤效应的分析。
2.拟采用的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析
实验方案和研究方法
1.分别培养人腺样囊性癌细胞系ACC-2及其肺高转移克隆株ACC-M，抽提总RNA，分离mRNA，逆转录成cDNA并用P33标记.
2.制备cDNA阵列膜片,包含约14,000个基因,每个基因的序列已测出,分别与标记的cDNA片段杂交,采用专用软件和生物信息学分析基因表达量的差异。
3.运用生物信息学的聚类分析、同源分析和各种基因库信息对有差异的基因进行初步筛选,采用反义核酸技术,结合细胞学试验、血小板凝集试验和腺样囊性癌裸小鼠移植瘤肺转移模型,鉴定初步筛选的靶基因在细胞生长和转移中的作用，通过RT-PCR和分子杂交进一步在临床手术标本和其它口腔癌细胞系中确证。
4.通过国际互联网查询美国国立卫生研究院（NIH）的生物信息科技中心（NCBI）,可获得与靶基因不同同源度的序列,据此选用含巨细胞病毒（CMV）启动子和β-Gal基因的真核表达载体,设计构建与肺高转移相关抗原基因同源的核酸疫苗。
同时,查找含相同序列的鼠癌细胞系,并从中科院上海细胞所细胞库中获取相应的鼠癌细胞系,在小鼠（非裸鼠）上种植癌细胞建立癌细胞鼠模型。
5.利用已建立的分子外科缝线和注射转基因的方法,将核酸疫苗转入癌细胞鼠模型中,通过荷瘤鼠模型的COX生存分析、T淋巴细胞亚群分析、抗β-Gal抗体测定来研究其体内抗肿瘤的效应,从中找出最有效的抗肿瘤作用因子.
可行性分析
1.本实验室长期从事腺样囊性癌肺转移机理及其防治的研究,积累了丰富的理论知识和实验经验,并取得了公认的成就.
2.已进行的预初试验表明,肺低转移性的ACC－2细胞系和肺高转移性的ACC－M细胞株比较，已发现有显著差异的基因36个，有差异的基因213个。
3.申请者本人在攻读研究生期间致力于肿瘤的分子外科和核酸疫苗的研究，该研究首次将含报告基因的质粒导入兔舌肌和胸锁乳突肌，建立了分子外科转基因技术。
并已熟练掌握分子克隆和基因重组技术.
4.实验所需的基因分析软件、真核表达载体质粒、免疫分析试剂等已具备
3.本项目的创新之处
1.首次采用DNA芯片对遗传背景相同而生物学行为不同的口腔癌细胞进行大规模的基因定量对比分析。
2.筛选和鉴定新的肺高转移相关抗原基因.
3.本研究设计构建了与肺高转移相关抗原基因同源的核酸疫苗,深入研究了其抗肿瘤免疫作用.
技术路线：
低转移细胞系ACC-2和肺高转移性克隆株ACC-M
抽提总RNA，分离mRNA，逆转录成cDNA,P33标记.
DNA芯片技术（含14，000个基因）的基因表达谱定量对比扫描分析
生物信息学反义核酸技术、血小板凝集试验RT-PCR和分子杂交
聚类和同源分析腺样囊性癌裸小鼠移植瘤肺转移模型鉴定进一步确证
肺高转移相关抗原基因
设计构建同源核酸疫苗建立癌细胞鼠模型
将核酸疫苗转入癌细胞鼠模型中
COX生存分析、T淋巴细胞亚群分析、抗β-Gal抗体测定来研究其体内抗肿瘤效应
4.年度研究计划及预期进展
1.DNA芯片技术对低转移性的ACC－2细胞系和肺高转移性克隆株ACC－M细胞株的基因的大规模扫描分析.
2.肺高转移相关抗原基因筛选。
肺高转移相关抗原基因的分析和鉴定。
1.构建核酸疫苗。
1.建立癌细胞动物模型。
2.测定分析抗肿瘤效应。
5.预期研究成果
1.获得人腺样囊性癌细胞系ACC-2及其肺高转移性克隆株ACC-M二者完整的基因表达差异谱。
2.口腔癌肺高转移相关抗原基因的筛选和鉴定。
2.核酸疫苗抗肿瘤方法的应用。
4.在国内、外专业刊物上发表论文5-6篇,参加国际、国内会议交流2-3次。
5.预期研究成果
1.获得人腺样囊性癌细胞系ACC-2及其肺高转移性克隆株ACC-M二者完整的基因表达差异谱。
2.口腔癌肺高转移相关抗原基因的筛选和鉴定。
3.核酸疫苗抗肿瘤方法的应用。
4.在国内、外专业刊物上发表论文5-6篇,参加国际、国内会议交流2-3次。
四、研究基础
1.与本项目有关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩
1
2.预初实验结果表明，肺低转移性的ACC－2细胞系和肺高转移性的ACC－M细胞株比较，有显著差异的基因36个，有差异的基因213个。
这些基因涉及细胞信号传导、细胞代谢过程、跨膜蛋白等诸方面，为进一步进行肺高转移相关抗原基因的筛选和鉴定及核酸疫苗的设计提供了宝贵的数据。
3.申请者本人在攻读研究生期间致力于肿瘤的分子外科和核酸疫苗的研究，该研究首次将含报告基因的质粒导入兔舌肌和胸锁乳突肌中，建立了分子外科转基因技术。
并已熟练了掌握分子克隆和基因重组技术.
2.已具备的实验条件，尚缺少的实验条件和拟解决的途径（包括利用国家重点实验室和部门开放实验室的计划和落实情况）
1.口腔肿瘤生物实验室具备细胞生物学和分子生物学的各项有关设备,包括达到GFP标准的细胞培养室、进口培养箱、无菌标准操作台、低温超高速离心机、-80℃低温冰箱、PCR扩增仪、核酸蛋白分析仪等。
2.拥有DNA芯片分析的全套设备,包括96孔板和384孔板、PCR仪自动点膜仪、信号扫描仪、杂交炉等。
3.建有达SPF标准的实验动物中心。
主要预初实验结果
1.DNA芯片对肺低转移性的ACC－2细胞系和肺高转移性克隆株ACC－M细胞的14,000个基因的定量对比扫描分析结果表明,有显著差异的基因36个，有差异的基因213个。
下面列出的是部分显著差异基因的基因序列号及其相关信息。
2.这些基因涉及细胞信号传导、细胞代谢过程、跨膜蛋白等诸方面，为肺高转移相关抗原基因的筛选和核酸疫苗的设计提供了可靠的数据和坚实的基础。
Hs.201967cds=（26,997）/gb=U05861/gi=487134/ug=Hs.201967/len=1222
Hs.79748cds=（111,1700）/gb=AB018010/gi=5926733/ug=Hs.79748/len=1879
Hs.183698cds=（29,508）/gb=Z49148/gi=793842/ug=Hs.183698/len=630
Hs.111515gb=AA484881/gi=2213948/ug=Hs.111515/len=436
Hs.78183cds=（51,1022）/gb=D17793/gi=457407/ug=Hs.78183/len=1204
Hs.255772clone_end=5'
/gb=AA186737/gi=1774854/ug=Hs.255772/len=511
Hs.58593cds=（119,868）/gb=X16901/gi=35864/ug=Hs.58593/len=1408
Hs.75069cds=（0,1451）/gb=U23143/gi=746435/ug=Hs.75069/len=1452
Hs.150741clone_end=3'
/gb=AW072071/gi=6027069/ug=Hs.150741/len=467
Hs.109798cds=（41,421）/gb=AJ249732/gi=5921472/ug
升级会员 