扫描电镜与透射电镜样品制作完全版Word文档下载推荐.docx
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TEM样品包埋块制作有关注意事项
一、取材：
1、动作迅速：
组织离体后，应将其快速放入固定液中，使组织细胞尽可能保持原来的生活状态；
2、减少损伤：
选择锋利切割器械，减少牵拉或挤压组织；
3、组织块大小：
一般要小于1mm3。
二、固定：
固定是指用化学固定剂或一些物理方法迅速杀死细胞
的过程，目的是尽可能保持细胞的原有生活状态，不发生位移，减少组织结构变化。
固定剂的主要作用是使蛋白质、脂质等生物大分子发生某种交联。
1、用固定液固定的样品若漂浮在溶液表面，应通过抽真空的方法让样品沉入溶液中
2、使用锇酸的注意事项
I通风橱中的锇酸溶液为2%的储备液，使用之前需用0.2MPBS或二甲砷酸盐缓冲液稀释成1%的锇酸溶液。
II锇酸为剧毒、极易挥发的试剂，必须在通风橱中操作，废液必须收集在密闭容器中。
第一次使用锇酸的同学，请务必获得老师或其它熟悉操作人员的指导。
三、漂洗：
应彻底漂洗干净，减少固定液与固定液或与脱水剂之间的反应。
四、脱水：
脱水是将组织中的游离水彻底清除的过程。
由于常用的包埋剂大都是非水溶性树脂，只有将生物组织中的游离水清除干净，包埋剂才能浸入组织。
脱水过程中应注意：
I逐级脱水而不能急剧脱水；
II更换溶液时动作要快，特别是不要让组织离开溶液，否则会在组织内外产生气泡；
III脱水过程中若要长时间停留或过夜，应放在70%脱水剂中，并在
4℃保存。
五、渗透：
渗透就是用包埋剂逐渐取代组织中的脱水剂，使细胞内外
空隙被包埋剂所填充。
包埋剂通常由树脂、硬化剂、增塑剂及催化剂4种试剂按一定比例配制而成。
包埋剂配制及使用过程中的注意事项：
I所有容器及玻璃棒等应是清洁和干燥的；
II配制过程中应搅拌均匀，使用过程中应避免异物，特别是水、乙醇、丙酮等混入包埋剂；
III配制好的包埋剂应密封保存，避免受潮。
剩余包埋剂可密封并储存在-10—-20℃冰箱中，延长其使用期。
表1戊二醛溶液的配制
终浓度
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
4.0
5.0
0.2MPBS/ml
50
25%戊二醛水溶液/ml
4
6
8
10
12
16
20
重蒸水加至/ml
100
表20.2M磷酸缓冲液（PBS）的配制
A液：
0.2mol/L磷酸氢二钠溶液
B液：
0.2mol/L磷酸二氢钠溶液
Na2HPO428.4g
或Na2HPO4.H2O31.61g
或Na2HPO4.2H2O35.6g
或Na2HPO4.7H2O53.63g
或Na2HPO4.12H2O71.64g
加双蒸水至1000mL
NaH2PO424.0g
或NaH2PO4.H2O27.6g
或NaH2PO4.2H2O31.21g
按下表比例混合A、B液后，配成0.2mol/L的母液，其中pH7.0为常用配方
pH值
5.86.06.26.46.66.87.07.27.47.67.88.0
A液
8.012.318.526.537.549.061.072.081.087.091.594.7
B液
92.087.781.673.562.551.039.028.019.013.08.505.30
在缓冲液中加入葡萄糖，蔗糖或氯化钠等均能改变渗透压。
表3多聚甲醛-戊二醛固定液的配制
溶液名称
剂量
10%多聚甲醛溶液
20ml
0.2MPBS或二砷酸盐缓冲液
50ml
25%戊二醛水溶液
10ml
重蒸水
表42%锇酸溶液的配制
试剂
用量
锇酸/g
1
重蒸水/ml
表5Spurr包埋剂配方
药品名称
硬配方
软配方
我们现用的配方
VCD树脂
10g
DER736
6g
7g
8g
NSA
26g
DMAE
0.4g
注：
通过改变DER736的用量可以调节包埋剂的硬度。
DMAE的用量则调节聚
合反应的速度。
透射电镜样品制备程序：
No.1包埋切片样品的制作过程
样品在2.5%的戊二醛溶液中4℃固定过夜，然后按下列步骤处理样品：
✧倒掉固定液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min；
✧用1%的锇酸溶液固定样品1-2h；
✧用梯度浓度（包括50%，70%，80%，90%和95%五种浓度）的乙醇溶液对样品进行脱水处理，每种浓度处理15min，再用100%的乙醇处理一次，每次20min；
最后过度到纯丙酮处理20min。
✧用包埋剂与丙酮的混合液（V/V=1/1）处理样品1h；
✧用包埋剂与丙酮的混合液（V/V=3/1）处理样品3h；
✧纯包埋剂处理样品过夜；
将经过渗透处理的样品包埋起来，70℃加热过夜，即得到包埋好的样品。
样品在Reichert超薄切片机中切片，获得70-90nm的切片，该切片经柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液各染色15min，即可在日本JEOL公司的JEM-1230型透射电镜中观察。
1）.Doublefixation:
Thespecimenwasfirstfixedwith2.5%glutaraldehydeinphosphatebuffer（pH7.0）formorethan4hours;
washedthreetimesinthephosphatebuffer,oncefor15min;
thenpostfixedwith1%OsO4inphosphatebuffer（pH7.0）for1hourandwashedthreetimesinthephosphatebuffer.
2）.Dehydration:
Thespecimenwasfirstdehydratedbyagradedseriesofethanol（50%,70%,80%,90%,95%and100%）forabout15to20minutesateachstep,transferredtoabsoluteacetonefor20minutes.
3）.Infiltration:
Thespecimenwasplacedin1:
1mixtureofabsoluteacetoneandthefinalSpurrresinmixturefor1houratroomtemperature,thentransferredto1:
3mixtureofabsoluteacetoneandthefinalresinmixturefor3hoursandtofinalSpurrresinmixtureforovernight.
4）.Embeddingandultrathinsectioning:
Specimenwasplacedincapsulescontainedembeddingmediumandheatedat70℃forabout9hours.Thespecimensectionswerestainedbyuranylacetateandalkalineleadcitratefor15minutesrespectivelyandobservedinTEMofModelJEM-1230.
No.2负染样品的制作（以细菌为例）
Negativestainingofbacterium
Thebacteriumsuspensionwasstainedby1to2%solutionofphosphotungsticacid（PTA，磷钨酸）inapHrangeof6.5to7.0for15to30seconds.Then,thebacteriumwasobservedinTEMofModelJEM1230.
扫描电镜样品制备方法
倒掉固定液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min；
用1%的锇酸溶液固定样品1-2h；
用梯度浓度（包括50%，70%，80%，90%和95%五种浓度）的乙醇溶液对样品进行脱水处理，每种浓度处理15min，再用100%的乙醇处理两次，每次20min。
用乙醇与醋酸异戊酯的混合液（V/V=1/1）处理样品30min，再用纯醋酸异戊酯处理样品1-2h。
临界点干燥。
镀膜，观察。
处理好的样品在荷兰Philips公司的XL30ESEM型环境扫描电镜中观察。
Spurr低粘度包埋剂
ERL-42062.5g
NSA6.5g
DER-7362.0g
DMAE0.1g
前三种试剂混合均匀后，加入DMAE，充分混合。
按每个样品2.5g的用量配制。
70℃聚合8h以上。
干脆把透射电镜样品的制备方法一起发了：
透射电镜样品制备方法
用梯度浓度（包括50%，70%，80%，90%和95%五种浓度）的乙醇溶液对样品进行脱水处理，每种浓度处理15min，再用100%的乙醇处理一次，每次20min；
用包埋剂与丙酮的混合液（V/V=1/1）处理样品1h；
用包埋剂与丙酮的混合液（V/V=3/1）处理样品3h；
纯包埋剂处理样品过夜；
样品在Reichert超薄切片机中切片，获得70-90nm的切片，该切片经柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液各染色15min，即可在***JEOL公司的JEM-1230型透射电镜中观察
SEM需前处理样品制备过程中的注意事项
I取材：
1cm3左右即可，不需要象TEM样品那么小；
II脱水：
样品较大，脱水时间可适当延长；
III临界点干燥：
一般采用液体二氧化碳为置换液，二氧化碳与乙醇或丙酮互溶性较差，而与醋酸异戊酯互溶液性较好。
因此，样品脱水后需逐渐过渡到醋酸异戊酯溶液中浸泡，以便置换存留于组织中的脱水剂。
注意：
醋酸异戊酯挥发性较强，应在通风橱中操作，废液用密闭容器装好后丢弃。
IV金属喷镀：
新鲜样品自身就可导电，而经过干燥的生物样品不能导电。
这种不导电的样品在SEM中观察时，会产生电荷积累而影响观察稳定性。
使样品导电的方法通常是在样品表面喷一层厚度约100埃的金膜。
No.1直接观察的扫描电镜样品
I样品粘附在样品台上，在EikoIB5型离子溅射仪中喷镀4-5min。
II样品在荷兰Philips公司的XL30型ESEM（环境扫描电镜）中观察。
The
specimenwascoatedwithgold-palladiuminEikoModelIB5
ioncoaterfor4-5min
andthenobservedinPhilipsModelXL30ESEM.
No.2需前处理的SEM样品制备程序
✧用梯度浓度（包括50%，70%，80%，90%和95%五种浓度）的乙醇溶液对样品进行脱水处理，每种浓度处理15min，再用100%的乙醇处理两次，每次20min。
✧用乙醇与醋酸异戊酯的混合液（V/V=1/1）处理样品30min，再用纯醋酸异戊酯处理样品1-2h。
✧临界点干燥。
✧镀膜，观察。
处理好的样品在荷兰Philips公司的XL30型环境扫描电镜中观察。
IDoublefixation:
IIDehydration:
Thespecimenwasfirstdehydratedbyagradedseriesofethanol（50%,70%,80%,90%,95%and100%）forabout15to20minutesateachstep,transferredtothemixtureofalcoholandiso-amylacetate（v:
v=1:
1）forabout30minutes,thentransferredtopureiso-amylacetateforabout1hour.Intheend,thespecimenwasdehydratedinHitachiModelHCP-2criticalpointdryerwithliquidCO2.
IIICoatingandobservation:
Thedehydratedspecimenwascoatedwithgold-palladiumandobservedinPhilipsModelXL30ESEM.
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