生化分离技术考试要点Word文件下载.docx
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电渗流：
当一个电场加在一个带电荷的表面或者多孔的固体介质的两端，同时该表面或介质处在电解质溶液中的时候，溶液会以某一固定的速度流动。
蛋白包涵体：
由外源基因在宿主细胞中表达的不溶性蛋白聚合体。
双水相萃取法：
根据聚合物分子的不相容性，两种聚合物的水溶液可以分成两相。
（常用于蛋白质的分离）
第二部分：
复习
一、发酵液预处理
1.发酵液的特点
含水多，产物含量低；
含菌体蛋白；
溶有原来培养基成分；
相当多的副产物和色素；
易被杂菌污染或使产物进一步分解；
易起泡，粘性物质多。
发酵液黏度大，浑浊；
目标产物浓度低；
发酵液成分十分复杂
所以，对发酵液进行预处理是生化物质分离纯化的首要步骤
2.预处理的目的主要有三个：
⑴改变发酵液的物理性质，促进从悬浮液中分离固形物的速度，提高固液分离器的效率；
⑵尽可能使产物转入便于后处理的一相中（多数是液相）；
⑶去除发酵液中的部分杂质，以利于后续各步操作。
3.预处理方法
A．高价无机离子的去除（★）
Ca2+草酸:
为去除钙离子，宜加入草酸,可用其可溶性盐，如草酸钠。
反应生成的草酸钙还能促使蛋白质凝固，提高滤液（也称为原液）质量。
但草酸价格较贵，加入硫酸铅，在60℃下反应生成草酸铅。
后者在90－95℃下用硫酸分解，经过滤、冷却、结晶后可以回收草酸。
草酸镁的溶解度较大。
故加入草酸不能除尽镁离子。
要除去镁离子，可以加入三聚磷酸钠，它和镁离子形成可溶性络合物
Mg2+三聚磷酸钠
Fe3+黄血盐（普鲁士蓝沉淀）
B、蛋白质去除：
加热，调pH（草酸，无机酸或碱），有机溶剂，蛋白沉淀剂
4.凝聚与絮凝其处理过程就是将化学药剂预先投加到悬浮液中，改变细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，破坏其稳定性，使它们聚集成可分离的絮凝体，再进行分离。
（凝聚、絮凝概念和基本原理区分★）
1）凝聚：
指在投加的化学物质（铝、铁的盐类或石灰等）作用下，胶体脱稳并使粒子相互聚集成１mm大小块状凝聚体的过程。
胶体粒子（10-100nm）中性盐促进下脱稳相互聚集成大粒子（1mm）
机理：
a中和粒子表面电荷
b消除双电层结构
2）絮凝：
指使用絮凝剂（天然的和合成的大分子量聚电解质）将胶体粒子交联成网，形成10mm大小絮凝团的过程。
其中絮凝剂主要起架桥作用。
大分子聚电解质将胶体粒子交联成网状，形成絮凝团的过程。
架桥作用
5、常用凝聚剂——高价阳离子（凝聚剂的凝聚能力哪种最强？
高价离子和低价离子★）
凝聚能力的次序为：
Al3+>
Fe3+>
H+>
Ca2+>
Mg2+>
K+>
Na+>
Li+
常用电解质：
Al2（SO4）3·
18H2O、AlCl3·
6H2O、FeCl3、ZnSO4、MgSO4
6.常用的絮凝剂聚丙烯酰胺类★的优缺点★
目前最常见的高分子聚合物絮凝剂是有机合成的聚丙烯酰胺类衍生物。
聚丙烯酰胺类絮凝剂具有用量少，絮凝体粗大，分离效果好，絮凝速度快以及种类多等优点，所以适用范围广。
聚丙烯酰胺的主要缺点是存在一定的毒性，特别是阳离子型聚丙烯酰胺，要考虑这些物质最终能否从产品中去除。
无机高分子聚合物也是较好的一类絮凝剂，如聚合铝盐和聚合铁盐等。
天然有机高分子絮凝剂，如壳聚糖和葡聚糖等聚糖类，还有明胶、骨胶、海藻酸钠等。
微生物絮凝剂是近年来研究和开发的新型絮凝剂，它是一类由微生物产生的具有絮凝细胞功能的物质。
主要成分是糖蛋白、粘多糖、纤维素及核酸等高分子物质。
微生物絮凝剂和天然絮凝剂与化学合成的絮凝剂相比，最大的优点是安全，无毒和不污染环境。
常用絮凝剂：
人工高分子聚合物：
聚丙烯酰胺、聚苯乙烯，聚乙稀亚胺的衍生物
无机高分子聚合物：
聚合铝盐、聚合铁盐
天然有机高分子絮凝剂：
壳聚糖、葡聚糖、明胶、骨胶
微生物絮凝剂：
糖蛋白，粘多糖，纤维素，核酸
7.混凝的概念（凝聚和絮凝）★
先加入无机电解质，使悬浮粒子间的相互排斥能降低，脱稳而凝聚成微粒，然后，再加入絮凝剂。
这种包括凝聚和絮凝机理的过程，常称为混凝。
膜过滤：
错流过滤概念，过滤时候加入助滤剂的原理和作用
二、细胞破碎和分离提取
细胞破碎的目的是使细胞壁和细胞膜受到不同程度的破坏，从而释放其中产物，以便进行分离收集。
主要采用的方法有机械法和非机械法
一）细胞破碎的化学法和机械法，各有什么优缺点（★）
A.机械法：
有珠磨法、高压匀浆法、超声破碎法等。
在机械破碎法中，由于消耗的机械能转为热量会使温度上升，在大多数情况下要采用冷却措施，以防止生物产品受热破坏。
珠磨法：
细胞悬浮液与极小的研磨剂一起高速搅拌，细胞与研磨剂之间相互碰撞、剪切，使细胞在一定程度上破碎的方法
高压匀浆法：
利用高压迫使悬浮液通过针型阀，由于突然减压和高速冲撞造成细胞破裂。
在高压匀浆器中，细胞主要经受高速剪切，碰撞和从高压到低压的突变。
纳米级微生物破碎机：
高压细胞液流碰撞，并在高速震荡片上破碎成纳米级别的颗粒
超声波破碎法：
利用频率高于50kHz的超声波引起的空穴作用，对液体中的细胞产生巨大的剪切和撕裂作用，是一种很剧烈的细胞破碎方法。
破碎率高，操作方便，但是处理的量较小，并且会产生大量热量。
同时应注意避免溶液中气泡的存在。
处理一些超声波敏感的蛋白质酶时宜慎重。
渗透压法：
利用渗透压的突然变化，引起细胞壁和细胞膜的膨胀破裂，是一种比较温和的方法。
适用于较易破碎的细胞，细胞壁经过预先处理的细胞，同时要注意高渗溶液对产品的污染问题
干燥法：
菌体经干燥后，细胞膜渗透性发生变化，同时部分菌体自溶，可分为空气干燥，真空干燥，冷冻干燥等。
反复冻融法：
利用水结晶和融化的过程使细胞破碎成本较高，破碎率不高，并且容易导致生物产品失活
B.化学法：
EDTA、有机溶剂、表面活性剂
化学法的优点在于不会产生大量的细胞碎片，浆液粘度低，溶液较澄清，可实现有选择的释放胞内物质.缺点在于效率较低，时间长，成本较高，并且容易导致污染
C．生物法破碎
酶溶法：
利用相关酶类破坏微生物细胞壁或细胞膜。
噬菌体法
溶菌酶，作用于肽聚糖上的β1-4糖苷键，是目前最常用的细菌融酶
D其他
超临界细胞破碎技术：
利用超临界流体的萃取和压力差作用，使细胞壁破碎
电脉冲提取法：
电脉冲可以导致细胞壁的损伤，使细胞的通透性增加，操作条件温和，时间短，易于控制，并且可以做到不影响细胞生长
⏹多种破碎方法相结合，可以提高细胞破碎率，实现目标产物的精确提取
选择破碎方法的依据
（1）细胞的处理量
（2）细胞壁的强度和结构（3）目标产物对破碎条件的敏感性（4）破碎程度
适宜的操作条件应从高的产物释放率，低的能耗和便于后步提取等方面进行权衡
二）固液分离技术
收集胞内产物的细胞或菌体，分离除去液相，或者是收集含生化物质的液相，分离除去固体悬浮物，如细胞、菌体、细胞碎片、蛋白质的沉淀物和它们的絮凝体等。
常用的方法为过滤和离心分离等化工单元操作。
1）过滤（常规过滤）：
在一定的压力差下，利用多孔性介质截留固液悬浮液中的固体粒子，进行固液分离的方法称为过滤。
过滤设备：
板框、鼓式真空过滤机、错流过滤
A）过滤介质
无定形颗粒：
无烟煤、砂、颗粒活性炭、铁矿砂等
成形颗粒：
烧结金属、烧结塑料以及用合成树脂粘结的硅砂、塑料颗粒等，做成圆筒形或板状。
非金属织补棉：
化学纤维、玻璃纤维织品、长纤维滤布、短纤维滤布。
金属织布：
不锈钢丝或铁丝等的织布。
无纺品：
纸、毡、石棉板、合成纤维无纺布等。
B）助滤剂：
在过滤操作中，为了降低过滤阻力，增加过滤速率或得到高度澄清的滤液所加入的一种辅助性的粉粒状物质，称为助滤剂。
其原理（为什么加粉状的东西反而帮助过滤？
（★））是减少滤渣的可压缩性，保持滤饼疏松不至堵塞滤孔。
通常是具有硬度的，惰性的固体颗粒，例如硅藻土，石棉等。
助滤剂的原理是减少滤渣的可压缩性，保持滤饼疏松不至堵塞滤孔。
作用：
降低过滤阻力，增加过滤速率或得到高度澄清的滤液
为什么加粉状颗粒有助于过滤？
粉状颗粒质地坚硬而能形成疏松饼层，将其混入悬浮液或预涂在过滤介质上，可以改善饼层的性能，使阻力减小，滤液得以顺畅通过。
（其实答案同上题）
C）板框、鼓式真空过滤机
板框压滤机的过滤推动力来自泵产生的液压或进料贮槽中的气压。
它最重要的特征是通过过滤介质时产生的压力降可以超过0.1MPa,这是真空过滤器无法达到的。
板框压滤机已有很长历史。
真空转鼓过滤机
优点：
真空转鼓过滤机具有自动化程度高、操作连续、处理量大。
特别适合固体含量大（>
10％）的悬浮液的分离，在发酵工业中广泛用于霉菌、放线菌和酵母发酵液或细胞悬浮液的过滤分离。
缺点：
由于受真空度的限制，不适于菌体较小和粘度较大的细菌发酵液的过滤，且过滤所得固相的干度不如加压过滤。
2）离心：
借助离心机旋转所产生的离心力的作用，促使不同大小，不同密度的粒子分离的技术。
A、离心方法：
差速离心——工业上最常用的离心分离方法
区带离心——多用于生化研究
事先在离心管中用某种低分子溶质调配好密度梯度，在密度梯度之上加待处理的料液后进行离心。
常用密度梯度物质：
蔗糖、CsCl、NaBr
B．离心设备
碟片式离心机：
传统离心机，为目前工业上应用最广泛的离心机。
最大处理量达到300m3/h，常用于大规模的分离过程。
适用范围：
细菌、酵母菌、放线菌、细胞碎片
是传统离心机，为目前工业上应用最广泛的离心机。
分离因数可达1000-20000，最大处理量达到300m3/h，常用于大规模的分离过程。
a人工排渣的碟片离心机b喷嘴排渣的碟片离心机c活门（活塞）排渣的碟片离心机
d活门排渣的喷嘴碟片式离心机（这是近年来开发的机型，它和相同直径的活塞机相似，其速度可增加23%~30%,故可使分离因素达15000左右，该机型可用于酶制剂，疫苗和胰岛素生产中分离物的澄清，醇的生产中细菌的采集以及r-DNA中采集和澄清。
特别适合固形物含量较多的悬浮液的分离。
管式离心机：
是一种分离效率很高的离心分离设备，其转鼓细长，可在15000-50000的高转速下工作，分离因数可达104-6×
105。
它设备简单、操作稳定。
细胞、细胞碎片、细胞器、病毒、蛋白质、核酸等。
特别适合一般分离机难以分离的固形物含量<
1%发酵液的分离。
倾析式离心机：
是一种靠离心力和螺旋的推动力作用自动连续排渣的离心机。
具操作连续、适应性强、结构紧凑和维修方便的优点。
三）从固液混合体系中直接提取产物（双水相分离技术、膨胀床技术、泡载分离技术）
1）膨胀床吸附（膨胀床的基本原理和特点（★）？
？
）
膨胀床吸附：
兼有固定床和流化床的优点。
流化的固相介质基本可以悬浮在床内的固定位置，流体流动状态流经床层．集料液澄清，目标产物浓缩和分离纯化为一体的生物集成分离技术．
膨胀床装置与传统色谱柱吸附装置的最大区别在于底部有个液体分布器，上端有个床层调节器，用于调节床层高度。
膨胀床所用吸附剂首先要求有较好的吸附性能和较高的沉降速率，所以常常在惰性高密度内核外包上具有良好吸附能力的材料，其次，吸附剂要有粒径和密度的差异，这对于保持膨胀床稳定，提高吸附效率很有帮助。
膨胀床操作过程
2）泡载分离技术（基本原理（★））
泡载分离是通过鼓泡使细胞或溶质聚集在气液界面，借助浮力上升至溶液主体上方形成富集层，以达到分离，浓缩溶质和净化液相主体的目的，特别适于低浓度产物的富集。
泡载分离是利用物质在气泡表面的吸附性质差异进行分离的技术，特别是针对表面活性差异大的物质。
泡载分离不使用无机盐或者有机溶剂，仅消耗动力，所以污染较小，成本较低。
3）萃取技术：
利用生物物质在不同溶剂中的分配系数不同进行分离纯化的技术
A．有机溶剂萃取
B．生物萃取技术
双水相萃取（双水相的基本原理（★））
理论：
聚合物的不相溶性（incompatibility）：
当两种高分子聚合物之间存在相互排斥作用时，由于相对分子质量较大，分子间的相互排斥作用与混合过程的熵增加相比占主导地位，一种聚合物分子的周围将聚集同种分子而排斥异种分子，当达到平衡时，即形成分别富含不同聚合物的两相。
这种含有聚合物分子的溶液发生分相的现象称为聚合物的不相容性。
双水相萃取技术（aqueous-twophaseextraction,ATPE），又称水溶液两相分配技术（Partionoftwoaqueousphaseextraction）两相为互不相溶的两水相，而目标组分因为在两相中溶解度不同而分离。
双水相形成：
将两种亲水性的聚合物都加在水溶液中,超过某一浓度产生两相;
成相是由于聚合物间不相溶,利用生物物质在两相中不同的分配实现分离.
两水相体系的种类：
高聚物-高聚物两水相、高聚物-盐两水相、非离子表面活性剂水胶束两相体系、阴阳离子表面活性剂两水相体系、醇盐两水相体系
双水相优缺点（★）
双水相的优势总结
ATPs作为一种新型的分离技术，对生物物质、天然产物、抗生素等的提取、纯化表现出以下优势：
（1）含水量高（70％--90％），在接近生理环境的体系中进行萃取，不会引起生物活性物质失活或变性；
（2）可以直接从含有菌体的发酵液和培养液中提取所需的蛋白质（或者酶），还能不经过破碎直接提取细胞内酶，省略了破碎或过滤等步骤；
（3）界面张力小（10-7～10-4mN／m），有助于两相之间的质量传递，界面与试管壁形成的接触角几乎是直角；
（4）不存在有机溶剂残留问题，高聚物一般是不挥发物质，对人体无害；
（5）大量杂质可与固体物质一同除去；
（6）易于工艺放大和连续操作，与后续提纯工序可直接相连接，无需进行特殊处理；
（7）操作条件温和，整个操作过程在常温常压下进行；
双水相的问题
1、含水量高，后续分离需经浓缩；
2、含高分子聚合物或盐类，分离后需进一步分离纯化以除去。
3、高聚物成本较高，回收困难
4、高聚物粘度高，易乳化
双水相萃取的应用
a细胞器及生物大分子，生物小分子的分离；
b核酸和细胞碎片的去除
C.有机溶剂萃取技术，操作容易，便于控制，易于放大，但难以用于萃取蛋白类物质。
如何利用溶剂萃取的优点，来进行蛋白质的分离提取呢？
——反胶团萃取
1）表面活性剂的结构：
“双亲结构”
2）临界胶束浓度（CriticalMicelleConcentrationCMC）：
是胶团形成时所需表面活性剂的最低浓度，用CMC来表示，与表面活性剂的化学结构、溶剂、温度和压力等因素有关。
CMC的数值可通过测定各种物理性质的突变（如表面张力、渗透压等）来确定。
3）胶团：
当水溶液中表面活性剂浓度超过一定值时，表面活性剂会聚集成在一起，成板状，束状，棒状或团状，称之为胶团。
同理相反，如果在非极性的有机溶剂中，表面活性剂的浓度达到一定程度，表面活性剂也会聚集在一起成聚集体，称为反胶束。
反胶束：
反胶束（reversedmicelle）是表面活性剂分散于连续有机相中一种自发形成的纳米尺度的聚集体。
表面活性剂是反胶束溶液形成的关键。
反胶束溶液是透明的、热力学稳定的系统。
反胶团形成（★）：
表面活性剂在有机相表面（界面）聚集达到“饱和”时，再增加浓度，溶液中的分子的亲水基相互吸引，分子自发聚集，形成球状、层状胶束，将亲水基埋在胶束内部，其分子将以反胶束的形式存在于有机相中，（是在适当配比下）形成自发生成的热力学稳定的、各向同性的、透明的分散体系。
在反胶束萃取蛋白质的研究中，用得最多的是阴离子表面活性剂AOT（AerosolOT），丁二酸－2－乙基己基磺酸钠（另一个版本：
在非极性的有机溶剂中，表面活性剂的浓度超过临界胶束浓度，表面活性剂就会聚集在一起成聚集体，其中非极性基团在外，极性基团则排列在内，形成一个极性核。
蛋白质进入反胶团的推动力是什么（★）：
蛋白质溶入反胶束溶液的推动力主要包括表面活性剂与蛋白质的静电作用力和疏水作用。
静电作用力：
在反胶束萃取体系中，表面活性剂与蛋白质都是带电的分子，因此静电相互作用是萃取过程中的一种主要推动力。
一个最直接的影响因素是pH值，它决定了蛋白质带电基团的离解速率及蛋白质的净电荷。
当pH＝pI时，蛋白质呈电中性；
pH＜pI时，蛋白质带正电荷；
pH＞pI时，蛋白质带负电荷，即随着pH的改变，被萃取蛋白质所带电荷的符号和多少是不同的。
离子强度（盐浓度）：
离解的反离子在表面活性剂极性头附近建立了双电层，，从而屏蔽了静电吸引力的作用，抑制了蛋白质的萃取。
所以一般来说，萃取时需要较低的离子强度，而反萃取时用较高的离子强度。
所以，可以通过调节体系的pH和离子浓度来对萃取过程进行控制。
某些具有高疏水性的蛋白能在很高离子强度下被反胶束萃取，这说明在静电引力之外，蛋白质与表面活性剂之间的疏水作用对于蛋白质的萃取也有重要作用。
反胶束萃取的优势:
1、成本低、溶剂可反复使用2、萃取率和反萃取率都很高。
3、表面活性剂往往具有溶解细胞的能力，因此可用于直接从整细胞中提取蛋白质和酶。
4、保护蛋白质免受有机相的影响。
反胶束萃取技术的应用:
1.蛋白质，氨基酸，抗生素等生物分子的分离2.用于蛋白质的复性：
变性蛋白分子的分离，提供蛋白复性所需的微环境。
3.利用表面活性剂的细胞破碎作用，直接提取细胞内产物。
4.同时提取脂类和蛋白质：
油进入有机相而蛋白质进入反胶束。
5.有机染料的分离。
D.凝胶萃取（什么是凝胶萃取？
（★））
凝胶：
在水中不溶解的亲水性交联聚合物
亲水性有机凝胶的两大特性：
涨缩特性和相变特性
1）凝胶萃取：
利用凝胶的相变特性，在凝胶收缩时，把吸收的物质和水分排出，可以使凝胶复性重复使用。
2）凝胶萃取的基本步骤：
1.凝胶对溶剂和小分子的吸收2.膨胀凝胶的分离回收3.在适当条件下，使凝胶释放所吸收的物质，重复再生。
3）凝胶萃取的优点：
操作简单，能耗低，高效经济，污染小，对于被分离物质影响小，凝胶的回收和再利用比较容易
4）凝胶萃取的应用:
由于凝胶所具有的大小选择性，对于大分子的纯化浓缩具有很高效率
E.超临界流体萃取技术
超临界流体（supercriticalfluid,简称SCF或者SC）：
超临界流体萃取是利用超临界流体具有的特异溶解能力而发展出来的生物物质分离新方法。
1）临界流体的特点（★）超临界萃取的优势（★）
超临界萃取的特点
（1）萃取时间短:
由于超临界流体强穿透力和高溶解度,它能快速地将提取物从载体中萃出。
（2）萃取彻底（3）溶剂回收简单无残留，无三废产生。
（4）条件温和:
在较低温度下萃取。
（5）萃取剂的溶解能力易于通过调节温度和压力控制。
（6）节省能源，无需大量的蒸馏浓缩等操作
2）超临界萃取的基本原理和过程
SCF所具有独特的物理化学性质，使其极易于渗透到样品基体中去，通过扩散、溶解、分配等作用，使基体中的溶质扩散并分配到SCF中，从而将其从基体中萃取出来。
超临界流体的密度随着密闭体系压力的增加而增加，利用程序升压可将不同极性的成分进行分部提取。
提取完成后，改变体系温度或压力，使超临界流体变成普通气体逸散，已提取的成分就可以析出，达到提取和分离的目的。
超临界萃取结合了溶剂萃取和蒸馏两种功能和特点。
2）超临界主要用的是那种溶（★）剂？
常用的超临界流体有如二氧化碳、甲醇、一氧化亚氮、六氟化硫、乙烷、庚烷、氨、二氯二氟甲烷......
超临界氨：
较易操作，但刺激性强，很容易与其他物质反应，腐蚀严重，使用危险。
超临界甲醇：
很好的溶剂，但是临界温度太高（240.5度），常温下是液体。
小分子烃类：
溶解度较大，超临界压力低，操作成本较低，但是临界温度高，同时多易燃易爆且有毒。
超临界流体的选择
对于超临界流体的要求：
1、具有良好的溶解性能。
2、具备良好的选择性。
3、化学性质稳定，无毒，无腐蚀性，不易燃易爆4、操作温度应接近常温，以节约能源，并不会导致目标物质热变性分解。
5、操作压力应尽可能低6、来源广泛，价格低廉。
CO2超临界流体溶剂的主要特点：
1、CO2的临界温度接近常温，临界压力较低，容易形成临界流体，不易对热敏发生降解变质作用。
2、惰性气体，化学性质稳定。
无毒无色无味无残留，不污染环境，不影响萃取物。
3、属于非极性溶剂，可以从天然产物中选择提取产物。
4、价廉易得，工艺简单，效率高，能耗低，使用安全。
5、极强的均一化作用，液态及超临界态二氧化碳能容易的与众多极性，非极性溶剂混溶
超临界萃取存在的问题:
需要高压，设备投入大，操作工艺要求高。
某些产物的萃取与传统萃取有差别，在收集萃取产品时，由于相变，会发生巨大的能量变化。
尤其在收集植物精油成分时，如干姜、辛夷，最初收集时会有强烈的辛辣味（干姜）、馨香味（辛夷）逸散出来，这些往往是小分子的萜类物质，影响目标萃取组分的完整性。
大量的文献报道也表明，传统的水蒸气蒸馏法与超临界流体萃取法获得的产品其组成有很大的不同。
F．液膜分离技术
液膜萃取：
是将第三种液体展开成膜状以隔开两个液相，使料液中溶质透过液膜进入接受液，从而实现溶质的分离纯化。
其分离过程是由3个液相形成的两个界面上的传质分离过程。
液膜萃取机理（★）
在液膜萃取过程中，溶质从料液
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