各种表达载体Word格式.docx
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本公司目前有含OmpA分泌信号肽和不含任何信号肽的二种PBAD表达质粒，其多克隆位点区域图谱如下:
（a）、含OmpA分泌信号肽的PBAD表达质粒多克隆区域
SD
PBAD….TACCCGTTTTTTTCC….GCTAGCAGGAGGAAACGATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGT
AMAEL
TTCGCTACCGTAGCCATGGCCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGCCTGCAGGCATCCAAGCTT
Nco1Sac1Kpn1Smal1BamH1Pst1Hind111
（b）、不含分泌信号肽的PBAD表达质粒多克隆区域
EcoR1Kpn1BamH1Pst1
PBAD….TACCCGTTTTTTTGG….GCTAGCGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGCCTGCAGGCATCCAAGCTT
Nde1Sac1Smal1Hind111
下图显示本公司应用pBAD表达载体完成的实验结果:
pBAD载体驱动大分子蛋白质在原核细胞
Origami（DE3）内高效表达
2.pCAl-n&
pCAl-pelB载体
特点:
该原核细胞表达载体是来源于以T7RNA聚合酶为基础的pET载体，含有T7/LacO启动子、编码钙调素结合多肽标鉴和凝血酶切点的核苷酸序列。
因此，该表达载体在E.coliBL21（DE3）或BL21（DE3）pLysS宿主菌中能高水平表达外源蛋白质、且这种表达的外源蛋白质因带有钙调素结合多肽和凝血酶切点，故该蛋白产物易于纯化和产业化。
此外，本公司利用分泌信号肽PelB，构建成新型的的原核细胞表达载体Pcal-PelB。
此载体表达的蛋白产物能在分泌肽PelB的指引下进入细胞周质。
（a）.Pcal-n
MKRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGALLVP
CATATGAAGGGACGATGGAAAAAACAATTTCATAGCCGTCTCAGCAGCCAACCCGCTTTAAGAAAATCTCATCCTCCGGGGCACTTCTGGTTCC
Nde1
RGSPGILDSMGRLELKLRSA
GCGTGGATCCCCGGGAATTCTAGACTCCATGGGTCGACTCGAGCTCAAGCTTAGATCCGCC
BamH1Sma1EcoR1Nco1Sal1Xho1Sac1Hnd111
（b）.Pcal-PelB:
Nde1
actggagactcatATGAAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTCGCGGCCCAGGGC
MKYLLPTAAAGLLLLAAQP
Nco1Msc1BamH1EcoR1Sal1
GCCATGGCCaaggatcctaagtaagtagaattctgagtaggtaagtcgacaatcgcgtctagagccccgacgcgctggg
AMA******
3.pPOW3.0表达载体
该原核表达质粒含有噬菌体的重叠λPRPL热诱导启动子和编码热敏感抑制子的C1857基因，可使宿主细胞在合成蛋白前获得高密度的宿主细菌，进行高水平目的蛋白表达，并对蛋白合成提供紧密控制。
PelB分泌信号肽能指引合成的外源蛋白通过胞浆膜进入胞质。
特别提示:
在进行重组质粒时，最好在N-未端用Nco1或Msc1位点，C-末端则可用BamH1、EcoR1位点进行拼接。
图示为启动子、PelB分泌信号肽和多克隆位点区域
Xho1
λPRPL启动子ggggtgtgtgatacgaaacgaagcattggcgcctcgagtaatttaccaacactactacgttttaactgaaacaa
RBSNde1
actggagactcatATGAAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTCGCG
MKYLLPTAAAGLLLLA
GCCCAGGGCGCCATGGCCaaggatcctaagtaagtagaattctgagtaggtaagtcgacaatcgcgtctagagccc
AQPAMA******
说明:
RBS为核糖体结合位点;
*为终止密码子
二、真核细胞表达载体
1.pCMVp-NEO-BAN载体
该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。
更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。
扦入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。
注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。
2.pEGFP,增强型绦色荧光蛋白表达载体
（EnhancedFluorecentProteinVector）
pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40T抗原的真核细胞内进行复制。
Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。
此外，载体中的pUCorigin能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。
用途:
该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。
借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。
亦可用于检测克隆的启动子活性（取代CMV启动子,Acet1-Nhe1）。
Excitationmaximum=488nm;
Emissionmaximum=507
图示为启动子分泌信号肽和多克隆位点区域：
Ase1.pCMV…ccgctagcgctaccggtcgccaccatg-.EGFP…BamH1…SV40polyA+
Nhe1Age1
3.pEGFT-Actin,增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体
pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
pEGFP-Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融合蛋白，该蛋白能整合到胞内正在生的肌动蛋白，因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动蛋白的亚细胞结构。
图示为启动子和多克隆位点区域：
pCMV….Nhe1….Age1….EGFP…Bgl11…Actin…BamH1…SV40polyA+
4.pSV2表达载体
特点：
该表达质粒是以病责SV40启动子驱动在真核细胞目的基因进行表达的，克隆位点为Hind111。
SV40启动子具有组织/细胞的选择特异性。
此载体不含neo基因，故不能用来筛选、建立稳定的表达细胞株。
Pvu11…pSV40….Hind111….SV40IVS….SV40polyA+
5．CMV4表达载体
该真核细胞表达载体由CMV启动子驱动，多克隆区域酶切位点选择性较多。
含有氨苄青霉素抗性基因和生长基因片段以及SV40复制原点和fl单链复制原点。
但值得注意的是，该表达载体不含有neo基因，转染細胞后不能用G418筛选稳定的表达细胞株。
CMVp…Bgl11…Kpn1…Mlu1…Cla1…Hind111…Xbal1…Sma1…GH…….SV40ori
其他常用克隆Vector：
pBluscriptIIKSDNA15ug
pUC18DNA25ug
pUC19DNA25ug
保存液:
TEBuffer
TEBuffer组成:
10mMTris.HCL（Ph8.0）
1mMEDTA
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