生物化学实验讲义最后修改版Word文件下载.docx
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电泳仪、电泳槽（8套）
酶的特异性
2
了解酶的特异性；
掌握检查酶特异的方法和原理
恒温水浴槽（8）
离心机（6）
pH、激活剂、抑制剂对酶活性的影响
掌握测定酶性质的方法和原理
核酸的水解及组成成分的鉴定
掌握核酸的一种水解方法和原理；
学习测定核酸的组成成分
可调节电炉（8）
包埋法固定化酵母细胞
学习和掌握包埋法固定化酵母细胞
16
待开
维生素C的定量测定（磷钼酸法）
学习掌握维生素C测定方法
燕麦水解蛋白的制备和理化性质测定
香菇多糖的提取和理化性质测定
（二选一）
8
学习水解蛋白的制备过程及水解蛋白理化性质测定方法
学习多糖的提取方发及多糖理化性质的测定方法
综合
GPC高效凝胶色谱分析仪（1台）
水浴锅（8个）
恒温摇床（8台）
离心机（4个）
目录
实验一双缩脲法测蛋白质含量…………………………………………………4
实验二血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳…………………………………………6
实验三酶的特异性（专一性）…………………………………………………9
实验四激活剂、抑制剂、pH、温度对酶活性的影响………………………11
实验五酵母核糖核酸的水解及其组成成分的鉴定…………………………15
实验六包埋法固定化酵母细胞…………………………………………17
实验七维生素C的定量测定（磷钼酸法）…………………………………19
实验八综合设计实验（二选一）……………………………………………21
实验一：
双缩脲法测蛋白质含量
一、实验目的
了解并掌握双缩脲法测蛋白质浓度的原理和方法
二、实验原理
具有两个或两个以上肽键（-CO-NH-）的化合物皆有双缩脲反应，在碱性溶液中蛋白质与
形成紫色配合物，此反应和两个尿素分子缩合后生成的双脲（H2N-OC-NH-CO-NH2）在碱性溶液中与铜离子作用形成紫红色的反应相似，故称之为双缩脲反应。
这种紫红色络合物在540nm处有最大吸收。
在一定浓度范围内，蛋白质浓度与双缩脲反应所呈的颜色深浅成正比，可用比色法定量测定。
双缩脲法最常用于需要快速但不要求十分精确的测定。
硫酸铵不干扰此呈色反应，但
离子容易被还原，有时会出现红色沉淀。
三、实验器材
1．试管1.5cm×
15cm8支。
2．试管架：
1个
3．吸量管：
5.0ml3支、2.0ml1支、1.0ml1支。
4．S22pc型分光光度计。
四、实验试剂
1．双缩脲试剂：
溶解1.50g硫酸铜（
）和6.0g酒石酸钾钠（
）于500毫升水中，在搅拌下加入300毫升10％氢氧化钠溶液，用水稀释到1升，贮存在内壁涂以石蜡的瓶中。
此试剂可以长期保存，以备使用。
2．标准牛血清蛋白溶液：
牛血清蛋白溶液浓度为5mg/ml,用0.05N（2g氢氧化钠溶于1升水中）氢氧化钠溶液配置.
3．未知液：
可用酪蛋白配制，未知液浓度为0.5~5mg/ml。
五、实验操作
1．标准曲线的绘制
取干净试管6支，分别加入0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0毫升的标准蛋白溶液（牛血清蛋白溶液），用水补足到2毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂，在室温下（15－25℃）放置30分钟，于540nm波长下用分光光度计比色测定。
最后以吸光度为纵坐标，蛋白含量为横坐标绘制标准曲线,作为定量的依据。
未知样品蛋白质浓度的测定
2．吸取1毫升待测液，用水补足到2毫升，操作同前，平行做两份，于标准曲线的各管同时比色，比色后以标准曲线中查出其蛋白质浓度。
附录：
表1绘制标准曲线
编号
3
6
加入蛋白质的量，ml
0.0
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
加入水的量,ml
浓度,mg/ml
1.0
3.0
4.0
5.0
双缩脲试剂，ml
吸光度
参考资料：
[1]陈钧辉，陶力，李俊等·
《生物化学实验》·
第三版·
北京：
科学出版社，2003.4（21世纪高等院校教材）：
58
六思考题
1．如何选择未知样品的用量？
2．为什么作为标准的蛋白质必须用凯氏定氮法测定纯度？
3．对于作为标准的蛋白质应有什么要求？
实验二：
1、掌握醋酸薄膜电泳的原理及操作
2、定量测定人血清中各种蛋白质的相对百分含量
采用醋酸纤维素薄膜为支持物的电泳方法，叫做醋酸纤维素薄膜电泳。
醋酸纤维素，是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸脂。
将它溶于有机溶剂（如：
丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸、乙脂等）后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。
该膜具有均一的泡沫状的结构，有强渗透性，厚度约为120微米。
醋酸纤维素薄膜电泳是近年来推广的一种新技术。
它具有微量、快速、简便、分辨力高、对样品无拖尾和吸附现象等优点。
该技术已广泛应用于血清蛋白、血红蛋白、糖蛋白、脂蛋白、结合球蛋白、同功酶的分离和测定等方面。
目前，醋酸纤维素薄膜电泳趋向于代替纸电泳。
三、实验试剂和器材
1．实验试剂
（1）新鲜血清——无溶血现象
（2）巴比妥—巴比妥钠缓冲液（PH8.6,0.07M,离子强度0.06）：
称取巴比妥1.66克和巴比妥钠12.76克，溶入少量蒸馏水后定容1000毫升。
（3）染色液：
称取氨基黑1OB0.5克，加入蒸馏水40毫升，甲醇50毫升和冰乙酸10毫升，混匀，在具塞试剂瓶内贮存。
（4）漂洗液：
取95℅乙醇45毫升，冰乙酸5毫升和蒸馏水50毫升，混匀，在具塞试剂瓶内贮存。
（5）透明液：
甲液——取冰乙酸15毫升和无水乙酸85毫升，混匀，装入试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。
乙液——取冰乙酸25毫升和无水乙酸75毫升，混匀，装入试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。
（6）0.4N氢氧化钠溶液：
称取16克氢氧化钠（分析纯）用少量蒸馏水溶解后定容到1000毫升。
2．实验器材
（1）醋酸纤维素薄膜——2厘米×
8厘米（浙江黄岩曙光化工厂等处生产）
（2）培养皿（直径9—10厘米）
（3）点样器（自制）
（4）直尺和铅笔。
（5）镊子。
（6）电泳槽。
（7）玻璃板（8厘米×
12厘米）。
（8）普通滤纸。
（9）试管和试管架。
（10）吹风机。
染色液、漂洗液和透明液应在密封的瓶子内贮存。
否则，易挥发的成分蒸发，使溶液各组分配比发生改变，从而影响实验结果，在气温较高的季节，更要十分注意，特别是透明液。
四、实验操作
1．仪器和薄膜的准备
（1）醋酸纤维素薄膜的润湿和选择：
将薄膜小心地放入盛有缓冲液的培养皿内，使它漂浮在液面。
若迅速润湿，整条薄膜色泽深浅一致，则表明薄膜质地均匀；
若润湿时，薄膜上出现深浅不一的条纹或斑点等，则为薄厚不匀的薄膜。
实验中应选用质地均匀的薄膜。
因为，纤维素薄膜的质量对电泳的结果影响很大。
例如，膜厚薄不匀可以造成区带歪扭不齐、各区带界限不清、背景脱色困难、实验结果难于重复等现象。
将选用的薄膜用镊子轻压，使它全部浸入缓冲液内，待膜完全浸透（约半小时）后取出，夹在清洁的滤纸中间，轻轻吸去多余的缓冲液，同时分辨出光泽面和无光泽面。
无光泽面处点样，并向下放置。
（2）制作“滤纸桥”：
剪裁尺寸合适的滤纸条。
取双层附着在电泳槽的支架上，使它的一端与支架的前沿对齐，而另一端浸入电极槽的缓冲液内。
然后，用缓冲液将滤纸全部润湿并驱除气泡，使滤纸紧贴在支架上，即为“滤纸桥”。
按照同样的方法，在另一个电极槽的支架上制作相同的“滤纸桥”。
它们的作用是联系醋酸纤维素薄膜和两极缓冲液之间的中间“桥梁”。
（3）平衡：
用平衡装置（或自制的平衡管），使两个电极槽内缓冲液的液面彼此处于水平的状态。
一般需要15—20分钟。
注意，平衡后应将平衡装置的活塞关好（或除去平衡管）。
此步骤不做处理。
2．点样
在薄膜无光泽面的一面点样。
点样区距负极端1.5厘米处。
点样时，先用点样器蘸取清水均匀地点样在滤纸上练习，再用点样器蘸取待测血清印在薄膜的点样区内。
注意，应使血清均匀地分布在点样区，形成具有一定宽度、粗细均匀的直线，切不可用力过大把薄膜弄破。
事先在滤纸上练习点样极为重要，掌握点样技术，这是获得具有清晰区带的电泳图谱的重要环节之一。
3．电泳
将已点样的薄膜无光泽面向下贴在电泳槽支架的滤纸桥上，参照图，平衡十分钟，仔细检查电泳装置的线路是否正确，然后通电。
打开电源开关，调节电压和电流强度，先旋动仪器粗调旋钮，再旋动细调旋钮。
调节到薄膜每厘米宽的电流强度为0.3毫安，通电10—15分钟后，在将电压和电流强度提高到薄膜每厘米长度电压为10伏左右，薄膜每厘米宽电流强度为0.4—0.6毫安。
在电泳过程中，应注意控制电压和电流强度，防止过高或偏低。
待电泳区带展开约35厘米时，则关闭电源，一般通电时间约为60分钟左右。
4．染色
电泳完毕立即用镊子取出薄膜，直接浸入装有染色液的培养皿中，染色5分钟，然后，用漂洗液浸洗，每隔10分钟左右换一次漂洗液，连续更换三次，可使背景颜色脱去，将膜夹在干净的滤纸中，吸去多余的溶液。
操作中，要注意控制染色和漂洗的时间，防止背景过深或某些区带太浅。
（集中倒废液。
）
5．结果判断
一般在染色后的薄膜上可显现清楚的五条区带。
从正极端起依次为清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白和γ球蛋白。
6．透明
将染色后漂洗干净的薄膜用滤纸吸干，再浸入透明液的甲液中，浸泡2分钟后立即浸入透明液的乙液中，浸泡1分钟（要准确），然后迅速取出薄膜，将它紧贴在玻璃板上，不要存留气泡。
大约2—3分钟内薄膜完全透明，放置10—15分钟后，用吹风机将膜吹干。
在水龙头下将玻璃板上透明的薄膜润湿后，用单面刀片从膜的一角撬起，并划开一端，再用手捏住撬起的膜轻轻撕下，可以容易地从玻璃板上取下透明的薄膜。
用书压平薄膜暂时保存好，则成为色泽鲜艳又透明的血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳图谱，可长期保存不褪色。
7．定量（了解原理）
未经透明处理的血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳图谱可直接用于定量测定。
一般采用洗脱法或光密度计法，测定各蛋白质的相对百分含量。
（1）洗脱法：
将电泳图谱的各区带剪下，分别浸于盛有0.4N氢氧化钠溶液的试管中，清蛋白管加入4毫升，其余各管各加2毫升，摇匀，放入37℃恒温水浴中浸提30分钟，每隔10分钟充分摇动一次，以便将色泽完全洗脱下来。
该溶液颜色比较稳定，在室温24小时内颜色强度无显著变化。
然后在620毫微米波长处比色，测定各管的光密度值为O.D.A\O.D.α1\O.D.α2\O.D.β\O.D.γ。
按下列方法计算各部分蛋白质所占百分率。
先计算光密度值总和（简写为T）：
T=2×
O.D.A+O.D.α1+O.D.α2+O.D.β+O.D.γ
再计算血清各部分蛋白质所占百分率（即相对百分含量）：
清蛋白﹪=（2×
O.D.A／T）×
100
β球蛋白﹪=（O.D.β／T）×
100
α1球蛋白﹪=（O.D.α1／T）×
100
γ球蛋白﹪=（O.D.γ／T）×
α2球蛋白﹪=（O.D.α2／T）×
正常值：
清蛋白54.0—73.0﹪
α1球蛋白2.8—5.1﹪
α2球蛋白6.3—10.6﹪
β球蛋白5.2—11.0﹪
γ球蛋白12.5—20.0﹪
五、思考题
1．比较醋酸纤维素薄膜电泳与纸电泳有什么异同点？
2．指出醋酸纤维素薄膜用作电泳的支持物有何优点？
实验三：
酶的特异性（专一性）
一、实验目的
1.了解酶的特异性
2.掌握检查酶的特异性的方法及其原理
二、实验原理
酶是一种生物催化剂，它与一般催化剂最主要的区别是酶具有高度的特异性即专一性。
所谓特异性指的是一种酶只能对一种化合物或一类化合物（通常在这些化合物的结构中具有相同的化学键）起一定的催化作用，而不能对别的物质发生催化反应。
例如：
淀粉酶能催化淀粉水解，但不能催化脂肪水解。
而脂肪酶则能催化脂肪水解，却不能催化淀粉水解。
本实验以唾液酶（含淀粉酶及少量麦芽糖酶）和蔗糖酶对淀粉和蔗糖的作用为例，说明酶的特异性。
三、实验试剂
1、2%蔗糖溶液
2、0.3%氯化钠的1%淀粉溶液（新鲜配制）
3、200倍新鲜唾液
4、蔗糖酶溶液
5、本尼迪克特试剂
四、实验器材
1、试管
2、吸量管
3、烧杯
4、竹试管夹
5、电热炉
6、恒温热水器
五、实验操作
1、淀粉酶的特异性实验
取2支试管，各加入本尼迪克特（Benedict）试剂2毫升，再分别加入1%淀粉溶液或2%蔗糖溶液各4滴。
混合均匀后，放在沸水浴中煮2—3分钟。
观察有无红黄色沉淀产生，纯净的淀粉和蔗糖不呈阳性反应。
再取2支试管，每管各加入稀释200倍的新鲜唾液1毫升。
再分别加入1%淀粉溶液和2%蔗糖溶液各3毫升。
混匀，放入37℃恒温水浴中保温，15分钟后取出。
各加本尼迪克特试剂2毫升，摇匀，放在沸水浴中煮2—3分钟。
观察有无红黄色沉淀产生。
应该指出，关于新鲜唾液的稀释倍数，一般为200倍。
但是，由于不同人或同一人不同时间。
采收的唾液内淀粉酶的活性并不相同，有时差别很大，稀释倍数可以是50—300倍，甚至超出此范围。
因此，应事先确定稀释倍数。
另外，要注意除去唾液里的气泡，避免稀释倍数不准确而影响实验结果。
稀释好的新鲜唾液用滤纸过滤后待用。
2、蔗糖酶特异性实验
取2支试管，各加入蔗糖酶溶液1毫升，再分别加入1%淀粉溶液3毫升和2%蔗糖溶液3毫升。
摇匀，放入37℃恒温水浴中保温，10分钟后取出，各加入本尼迪克特试剂2毫升，混匀后放入沸水浴煮2—3分钟。
再取一支试管，加入蔗糖酶1毫升和蒸馏水3毫升，混匀，加入本尼迪克特试剂2毫升，摇匀，再沸水浴中煮2—3分钟。
可以观察到试管内溶液呈现轻度阳性反应，这是由于蔗糖酶溶液本身含有少量还原性杂质的缘故。
因此，用此管作为对照，即可解释上述用淀粉作底物的试管内呈现轻度阳性反应的原因。
六、思考题
1.什么是酶的特异性?
本实验结果为什么能说明酶具有这种性质？
2.为什么用于本实验的蔗糖必须是分析纯的试剂?
3.用煮沸后的蔗糖酶水解淀粉或蔗糖，会产生什么现象？
为什么？
这种试验与操作二的作法有何区别？
试说明酶学实验中安排对照试验的必要性。
实验四：
激活剂、抑制剂、pH、温度对酶活性的影响
第一部分激活剂和抑制剂对酶活性的影响
1.了解酶促反应的激活与抑制。
2.学习检定激活剂和抑制剂影响酶反应的方法和原理。
酶的活性常受某些物质的影响，有些物质能使酶的活性增加，称为酶的激活剂；
有些物质能使酶的活性降低，称为酶的抑制剂。
例如，氯化钠为唾液淀粉酶的激活剂，硫酸铜为其抑制剂。
很少量的激活剂或抑制剂就会影响酶的活性，而且常具有特异性。
值得注意的是激活剂和抑制剂不是绝对的，有些物质在低浓度时为某种酶的激活剂，而在高浓度时则为该酶的抑制剂。
例如，氯化钠达到1/3饱和时就可抑制唾液淀粉酶活性。
1、0.1%淀粉溶液
2、稀释100-200倍的新鲜唾液
3、1%氯化钠的溶液
4、1%硫酸铜溶液
5、碘化钾-碘溶液
2、烧杯
3、吸量管
4、恒温水浴器
5、滴管
取3支试管，编号。
向第一支试管中加入1%氯化钠溶液1毫升，向第2支试管加入0.1%硫酸铜溶液1毫升，向第3支试管中加入蒸馏水1毫升作对照了。
再向每支试管加入0.1%淀粉溶液3毫升和稀释的唾液1毫升。
摇匀各管内容物，一齐放入37℃恒温水浴中保温,10-15分钟后取出.冷后,各滴入2-3滴碘化钾-碘溶液,混匀。
观察比较3管颜色的深浅，并解释之。
如果激活剂或抑制剂的作用不明显，主要原因可能是唾液淀粉酶活性不够高，可以适当延长反应时间或者降低唾液稀释倍数，然后再继续实验。
1.激活剂可以分为哪几类？
本实验中氯化钠是属于其中哪一类？
2.抑制剂与变性剂有何不同？
试举例说明。
3.酶反应的抑制作用有哪些类型？
根据什么划分的？
它们都有什么特点？
第二部分PH对酶活性的影响
一、实验的和要求
1．了解pH对酶活性的影响
2．学习测定酶的最适pH的方法
酶的活性受环境pH的影响极为显著。
通常各种酶只有在一定的pH范围内才表现它的活性。
一种酶表现其活性最高时的pH值，成为该酶的最适pH。
低于或高于最适pH时，酶的活性逐渐降低。
不同酶的最适pH值不同，例如，胃蛋白酶的最适pH为1.5-2.5，胰蛋白酶的最适pH为8等。
应当指出酶的最适pH受底物性质和缓冲液性质的影响。
例如，唾液淀粉酶的最适pH约为6.8，但在磷酸缓冲液中，其最适pH为6.4-6.6，在醋酸缓冲液中则为5.6。
三、操作方法
取8个50毫升锥形瓶，编号。
按下表中的比例，用吸量管添加0.2M磷酸氢二钠溶液和0.1M柠檬酸溶液，制备pH5.0-8.0的8种缓冲溶液。
锥形瓶号
0.2M磷酸氢二钠（毫升）
0.1M柠檬酸（毫升）
缓冲液pH
5.15
4.85
5.0
5.80
4.20
5.6
6.31
3.69
6.0
6.92
3.08
6.4
7.72
2.28
6.8
8.69
1.31
7.2
7
9.36
0.64
7.6
9.72
0.28
8.0
取9支干燥的试管，编号将8个锥形瓶中不同pH的缓冲液各取3毫升，分别加入相应号码（1-8号）的试管中。
然后，再向每支试管中添加0.5%淀粉溶液2毫升。
第9号试管与第5号试管的内容物相同。
向第9号试管中加入稀释200倍的唾液2毫升，摇匀后放入37℃恒温水浴中保温。
每隔1分钟由第9号试管中取出一滴混合液，置于白瓷板上，滴一滴碘化钾-碘溶液，检验淀粉的水解程度，待结果呈橙黄色时，取出试管，记录保温时间。
注意，掌握第9号试管的水解程度是本试验成败的关键之一。
以1分钟的间隔，依次向第1至第8号试管中加入稀释200倍的唾液2毫升，摇匀，并以1分钟的间隔依次将8支试管放入37℃恒温水浴中保温。
然后，按照第9号试管的保温时间，依次将各管迅速取出，并立即加入碘化钾-碘溶液2滴，充分摇匀。
观察各管呈现的颜色，判断在不同pH值下淀粉被水解的程度，可以看出pH对唾液淀粉酶活性的影响，并确定其最适pH。
四、试剂和器材
一．试剂
⑴0.3%氯化钠的0.5%淀粉溶液（新鲜配制）
⑵稀释200倍的新鲜唾液⑶0.2M磷酸氢二钠溶液
⑷0.1M柠檬酸溶液⑸碘化钾-碘溶液（见实验三）
二．器材
⑴试管和试管架⑵吸量管（0.5，1.2，5，10毫升）
⑶锥形瓶（50，100毫升）⑷烧杯（100毫升）
⑸量筒（100毫升）（6）玻璃漏斗
⑺吸量管架⑻白瓷板
⑼恒温水浴⑽滴管
⑾秒表⑿滤纸
五、思考题
1．pH对酶活性有何影响？
什么是酶反应的最适pH？
2．酶反应的最适pH是否是一个常数？
它与哪些因素有关？
这种性质对于选择测定酶活性的条件有什么意义？
3．通过几个酶学实验，你对下面问题如何认识：
⑴酶作为生物催化剂具有哪些特性？
⑵进行酶的实验必须注意控制哪些条件？
第三部分温度对酶活性的影响
一、实验目的和要求
通过检验不同温度下的唾液淀粉酶和脲酶的活性，了解温度对酶活性的影响。
酶的催化作用受温度的影响很大，一方面与一般化学反应一样，提高温度可以增加酶促反应的速度。
通常温度每升高10°
C，反应速度加快一倍左右，最后反应速度达到最大值。
另一方面酶是一种蛋白质，温度过高可引起蛋白质变性，导致酶的失活。
因此，反应速度达到最大值以后，随着温度的升高，反应速度反而逐渐下降，以至完全停止反应。
反应速度达到最大值时的温度称为某种酶作用的最适温度。
高于或低于最适温度时，反应速度逐渐降低。
大多数动物酶的最适温度为37°
C—40°
C，植物酶的最适温度为50°
C—60°
C。
但是，一种酶的最适温度不是完全固定的，它与作用时间长短有关，反应时间增长时，最适温度向数值较低的方向移动。
通常测定酶的活性时，在酶反应的最适温度下进行。
为了维持反应过程中温度的恒定，一般利用恒温水浴等恒温装置。
酶对温度的稳定性与其存在的形式有关。
实践证明大多数酶在干燥的固体状态下比较稳定，能在室温下保存数月以至一年。
溶液中的酶，一般不如固体的酶稳定，而且容易为微生物污染，通常很难长期保存而不丧失其活性，在高温的情况下，更不稳定。
三、操作方法
唾液淀粉酶可将淀粉逐步水解成各种不同大小分子的糊精及麦芽糖。
它们遇碘各呈不同的颜色。
直链淀粉（即可溶性淀粉）遇碘呈蓝色；
糊精按分子从大到小的顺序，遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色和红色，最小的糊精和麦芽糖遇碘不呈现颜色。
由于在不同温度下唾液淀粉酶的活性高低不同。
则淀粉被水解的程度不同，所以，可由酶反应混合物遇碘所呈现的颜色来判断。
取3支试管，编号后各加入淀粉溶液2毫升。
将第1、2号试管放入37°
C恒温水浴中保温，第3号试管放入冰水中冷却，5分钟后，向第1号试管中加入煮沸5—15分钟的稀释唾液1毫升，向第2、3号试管加稀释唾液各1毫升。
摇匀，20分钟后取出3支试管，各加碘化钾—碘溶液2滴，混匀，比较各管溶液的颜色。
判断淀粉被唾液酶水解的程度，并说明温度对唾液酶活性的影响。
试剂
（1）0.3％氯化纳的0.5％的淀粉溶液。
（2）稀释200倍的唾液。
（3）碘化钾—碘溶液（见实验三）。
器材
（1）试管和试管架。
（2）吸量管
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