有机酸苹果酸的发酵生产工艺设计Word文档下载推荐.docx
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中国的“醋”一词有陈酒之意。
能生产食醋的原料很多，如葡萄、苹果、麦芽、谷物原料、乳清等天然含糖原料皆可。
我国食醋生产的历史非常悠久，现已有多种风味和特色的食醋生产方法。
早先获得醋酸的方法有天然发酵醋的蒸馏和木材的分解蒸馏（所
谓“木醋”）。
真正的醋酸发酵应该说是从快速制醋法开始发展起来的，它是现代淋醋工艺的前身。
快速制醋工艺由德国学者舒莱巴赫在1823年首先提出，因此在国外称为“德国工艺”。
4、葡糖酸
1880年，Boutroux首先发现利用微生物的氧化作用，能将葡萄糖氧化成葡糖酸。
他发现用醋化醋杆菌能发酵葡萄糖产生一种不挥发酸，后来确定为葡糖酸。
以后许多研究者也相继报道，其他数种细菌也能产生葡糖酸或酮基葡糖酸。
本世纪30年代以前，细菌发酵是生产葡糖酸的主要方法。
1922年，Molliard发现，利用霉菌的氧化作用也能产生葡糖酸。
后来人们知道，黑曲霉、米曲霉、文民曲霉和青霉都有上述氧化作用。
Bernhager1942年发现，采取中和生成酸的方法，黑曲霉能高效地将葡萄糖转化成葡糖酸，而添加碳酸钙最好。
在
较低温度、限制氮源的条件下，生成的葡糖酸几乎可达理论产率。
我国在1955年由轻工业部上海工业试验所试制葡糖酸成功，选出
了黑曲霉87号菌种，不久即在山东投入生产。
目前，我国已经有数家葡糖酸发酵工厂。
5、衣康酸
衣康酸（又称为甲叉琥珀酸、分解乌头酸）最早是由Baup1836
年蒸馏分解柠檬酸时发现的。
而微生物产生衣康酸的能力是日本人木下广野1929年在一种嗜高参压的霉菌培养物中首先发现的，他称之为衣康酸曲霉。
原来Raistrick通过对霉菌代谢物的长期研究发现，土曲霉表面培养时也能产生衣康酸。
我国的衣康酸生产尚属空缺。
金其荣等人于1984年开始着手对衣康酸产生菌进行选育和工艺条件的研究。
6、苹果酸
苹果酸广泛存在于生物体中，它在很多水果中是占优势的酸。
微生物产生苹果酸的能力也早已被人们所认识，早在1928年，Yuill就
报道过，在培养黄曲霉时，有少量苹果酸伴随琥珀酸和富马酸产生。
Schreyer1931年报道，在丛花青霉的表面培养液中，生成的有机酸钙相当于耗糖的1/4，其中大部分是苹果酸钙。
Bernhauer等报道，在蔗糖为碳源的黑曲霉发酵液中，除生成大量的柠檬酸之外，也有少量苹果酸生成。
我国在发酵法生产苹果酸方面也有很大进展。
北京微生物研究所研究了固定化皱褶假丝酵母的苹果酸生产技术。
福建三明真菌研究所试验过L-苹果酸的霉菌固体发酵。
6/1苹果酸的性质
苹果酸是一种较强的有机酸，又名羟基丁二酸，是一种白色或荧白色粉状、粒状或结晶状固体。
晶体中不含结晶水，DL-型熔点129C,L-型熔点100C，加热到180C可以失水分解成富马酸或马来酸。
在通常条件下，苹果酸是稳定的，但其纯晶体稍有吸湿性，在高湿度条件下可能液化。
在相对湿度98%,25C下放置6天，约增重50.4%.
苹果酸在催化剂存在下与醇可发生酯化反应。
以三氟化硼为催化剂与醇回流可形成单酯。
与多元醇、芳香多元羧酸作用，可形成树脂类产品，如醇酸聚酯树脂。
在氧化银存在下，苹果酸酯与卤代烷反应可以产生醚类，如乙氧基琥珀酸。
在醇溶液中，苹果酸酯与氨作用，可以生成苹果酸酰胺。
6/2苹果酸的发酵机理
L-苹果酸在生物体中普遍存在，它作为三羧酸循环的一员而参与细胞代谢。
在一般生物中它只参与循环而不会大量积累，否则会造成
代谢流的阻塞。
要想积累苹果酸，必须要有补充4碳酸的途径。
理论上讲，补充4碳酸的途径有两种：
乙醛酸循环和丙酮酸羧化支路。
实际上，苹果酸的生物合成机理虽然早就研究得很清楚，但它只
是从生物生理学的角度去研究的。
对于微生物发酵中苹果酸合成机理尚没有进行过细致研究。
一般认为，苹果酸发酵牵涉到CO的固定（即丙酮酸羧化），其证据有：
发酵依赖于CaCO或其他碳酸盐，添加生物素可以促进苹果酸积累等。
但是，CO固定反应在各种菌的发酵中究竟占多大比例还未见有报道。
毫无疑问，无论有无乙醛酸循环存在，提高丙酮酸羧化的比例则能提高碳源的利用率，也即能提高苹果酸产率。
因此，这是苹果酸发酵值得研究的课题。
6/3苹果酸发酵微生物的分类
、
黄曲霉
、
米曲霉
三、
寄生曲霉
四、
华根霉
五、
无根根霉
六、
膜瞨毕赤酵母
七、
短乳杆菌
八、
产氨短杆菌
6/4苹果酸的发酵工艺
L-苹果酸的发酵工艺大体可以分为三类：
一步发酵法、两步发酵法和酶法转化。
一步发酵又称为直接发酵，它用糖类为原料，用霉菌直接发酵产生苹果酸。
两步发酵法也是用糖类为原料，先由根霉发酵成富马酸（或富马酸-苹果酸混合物），再由酵母或细菌转化成苹果酸。
酶法转化是用富马酸（盐）或马来酸为原料，用微生物酶（包括全细胞）转化成苹果酸。
与化学合成法不同的是，发酵方法利用了微生物酶的立体异构专一性，生产的都是L-苹果酸，是生物体内所存在和可以利用的构型，而化学合成法只能生产DL-苹果酸，如作为食品和药物，则有一半不能得到利用。
6/4.1直接发酵工艺
（一）菌种扩大培养
用于苹果酸直接发酵的黄曲霉和米曲霉都易于产生孢子。
将保
存在麦芽汁琼脂斜面上的黄曲霉孢子用无菌水洗下，接到三角瓶中。
瓶中装有种子培养基。
在33C静置培养2~~4天，待长出大量孢子，接到种子罐中。
种子罐装有下述种子培养基（g/L）
葡萄糖（水解糖中）30
豆饼粉10FeSO40.5
K2HPO0.2NaCL0.01
MgSO40.1CaCO360（单独灭菌）
种子罐培养的目的是使孢子发芽，以缩短生产罐的发酵迟滞
期。
种子罐的体积是生产罐的10%,装液70%,例如50L罐装液35L。
在100C灭菌20~30min后，冷至40C以下，加入单独灭菌的CaCO接种黄曲霉孢子后在33~34C通气搅拌培养。
通气量0.15~0.3vvm，罐压维持100KPa加入泡敌（50l罐加20ml）抑制泡沫生成。
培养18~20h后接入生产罐。
（二）发酵规程
发酵培养基采用葡萄糖70~80g/l,其余成分与种子培养基相
同。
生产培养基除CaCO以外，直接在生产罐内配制，在缓慢搅拌
下直接通蒸汽升温至100C，维持20min灭菌。
冷至40C时，加入单独灭菌（干热160C,2h）的CaCO。
当品温降到34C时，接种10%种子培养液，通气搅拌进行发酵。
发酵时控制温度33~34C，通气量
0.7vvm,搅拌转速180r/min,泡沫自由控系统流加泡敌控制。
整个发酵过程约需40h。
待残糖降到1g/l以下，放罐进入提取工序。
（三）、影响苹果酸发酵的因素
1.氮源
2.碳酸盐种类
3.碳酸钙用量
4.碳源种类
5.金属离子
6.铁盐
7.抑制剂
8.氨基酸和维生素
9.温度
6/4.2两步发酵工艺
两步发酵是先用根酶将糖类发酵成富马酸（或富马酸与苹果酸混合物），再由酵母或细菌发酵成L-苹果酸的工艺。
这前一步称为富马酸发酵，后一步称为转换发酵。
（一）富马酸发酵
根霉产生富马酸的能力早就被人们所认识。
著名的根霉富马
酸发酵菌种有华根霉、无根霉和黑根霉。
根霉在葡萄糖马铃薯汁琼
脂斜面上，于30C培养7天后，易于长出大量孢子
对于华根霉6508的富马酸发酵，可以采用下述培养基（％）
葡萄糖10（NH4）2SO0.5
K2HPO0.1MgSO4•7HO0.05
FeCI3•6HO0.002CaCO35
在500ml三角瓶中装液50ml，另外还要加入各种表面活性剂，具体添加量见后述。
接种华根霉孢子后，先静置培养一段时间，再振荡培养，维持温度30C。
（二）转换发酵
转换发酵是在根霉发酵一定时间后，再加入第二种微生物使富马酸发酵转换成苹果酸发酵。
有这种转换能力的微生物很多。
佐佐木等普查了分别属于假丝酵母属、德巴利酵母属、汉逊酵母属、毕赤酵母属、红酵母属、酵母属和球拟酵母属的23株酵母，发现膜璞毕赤
酵母的转化率最高。
6/4.3酶法转化工艺
酶法转化工艺相当于两步发酵工艺中的转换发酵。
转换发酵是将第一
步发酵生成的富马酸转化成苹果酸；
而酶法转化是用富马酸盐（一般是化学合成的）为原料，利用微生物的富马酸酶转化成苹果酸（盐）。
酶法转化是现在国外生产L-苹果酸的主要方法。
如果转化是以钙盐的形式进行的，则称为“转晶”，即富马酸钙晶体转化成苹果酸钙晶体：
Ef
CaF―a2++Fu2-Ma2+~+Ca2+CaMa——►
6/4.4固定化细胞转化工艺
前面已经提到，富马酸向L-苹果酸的转化只牵涉一步酶催化反
应，因此只要把富马酸酶提取出来，固定到载体上，就可以利用固相酶反应柱连续生产L-苹果酸。
但实际上遇到的问题是，酶的提纯手续复杂，酶的回收率低，成本高。
（一）产氨短杆菌细胞固定与苹果酸生产
（二）黄色短杆菌细胞固定与苹果酸生产
2.碳源
3.玉米浆
4.通气
5.温度
6.培养时间
6/4.5其他发酵方法
（一）
担子菌发酵法
（二）
产碱杆菌酶法转化
（三）
解脂假丝酵母转化法
（四）
解烃富马酸假丝酵母发酵法
（五）
假丝酵母酶法转化
（六）
栖热菌酶法转化
（七）固定化皱褶假丝酵母转化法
6/5苹果酸的提取和精制
苹果酸结晶工艺流程
6/6苹果酸的检验
6/6.1定性检验
1.三氯化钛法
2.美国药典法
3.纸层析法
6/6.2定量检验
1.酸碱滴定法
2.紫外分光光度法
3.荧光分光光度法
6/7苹果酸的用途
苹果酸广泛存在于各种生物体中，是生物体重要的代谢循环一一
三羧酸循环的成员之一。
在天然水果（苹果、山楂、葡萄、樱桃）中含量较高，它具有明显的呈味作用，其酸味柔和别致，解渴爽口。
苹果酸广泛用于食品和医药工业中，它的质地稳定，在水中溶解度大。
它在食品等部门中的用途简介如下：
1.食品酸味剂
2.食品加工
3.食品添加剂加工
4.烟草加工
5.医药
6.日用化工
7.化学工业
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