基于脂蛋白纳米载体的小干扰RNA靶向递送方法研究毕业论文1 精品Word格式.docx

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rHDL纳米粒都很小，直径约12至18纳米。

为了研究siRNA靶向输送途径，一些肿瘤细胞受体已被获知。

SR-B1受体主要在肝脏中的表达，也在肾上腺或正常卵巢组织也较小程度表达。

然而，在恶性肿瘤细胞中SR-B1非常显著表达。

增加HDL摄取可使肿瘤细胞产生较高增殖率。

例如，乳腺癌细胞通过增加SR-B1的表达来增加胆固醇酯的摄取。

因此，考虑到SR-B1在HDL中的作用，我们认为rHDL纳米粒可以作为选择性输送的有效载体。

siRNA基因沉默治疗非常有效，其他方法很难靶向这些基因。

信号传感器和转录激活因子3[STAT3]都可以介导正常细胞对多种细胞因子和生长因子的反应。

激活STAT3是恶性肿瘤转化和发展（例如，细胞增殖，分化和存活）的关键过程。

虽然STAT3可以在许多实体瘤里激活，但是它在正常组织中表达，并且参与许多正常细胞过程。

因此，使用小分子抑制剂或其他非特异性靶向STAT3的手段可能会导致许多不必要的副作用，因此需要有效途径限制毒性。

同样，粘着斑激酶（FAK）对于肿瘤细胞存活，转移，入侵也非常重要。

在卵巢癌患者中，FAK过度表达与侵袭性肿瘤的特征相关，这有助于弱势细胞生存。

概念证明，我们在卵巢癌和大肠癌模型中证实使用rHDL纳米粒靶向STAT3和FAK治疗有效性。

原料与方法

rHDL纳米粒的制备和siRNA的偶联

siRNA偶联到rHDL纳米粒，并储存在-20°

C。

简单地说，载脂蛋白A-I，是rHDL纳米粒的主要核蛋白，在生产蛋白过程中用质粒载体进行分离和纯化。

然后，脂类混合物（胆固醇[C]/胆固醇油酸[CE]/蛋黄卵磷脂[PC]，摩尔比的1:

5:

1.3:

115）在氮气流中干燥。

5mg的siRNA用25μg低聚赖氨酸（平均分子量为500-2000）在30℃预先孵育30分钟，然后加入到脂质成分中。

低聚赖氨酸/siRNA混合物偶联脂质，分散在60μl的DMSO和1.4ml的缓冲液（10mMTris，0.1MKCl，1mMpH为8.0的EDTA）。

胆酸钠，140μL（100mg/ml溶于为PBS）形成的蛋黄卵磷脂摩和胆酸的摩尔比为1:

1.6。

载脂蛋白A-I（12.7mg/ml）溶于0.4mlPBS加入到混合物中，终体积用PBS调整到2ml。

4℃孵育12h，接着用2L的PBS透析2天，换3次透析缓冲液。

制剂的稳定性凝胶排阻色谱中用的RiboGreen检测。

rHDL/靶向siRNA溶液用0.9％的生理盐水稀释到为0.2mg/Kg的siRNA/0.2mlrHDL的溶液。

此外，rHDL纳米粒子的ζ电位使用电位粒度分析仪检测。

简单地说，1ml的纳米粒加入1ml的比色皿中作zeta电势检测。

透射电子显微镜法

在0.125M乙酸铵，2.6mM的碳酸铵，0.26mM的EDTA，pH值7.4中透析后，rHDL样品用pH值7.2的2％磷钨酸钠并放在福尔瓦/200目镍网支持膜包裹的碳涂层进行负染。

颗粒明显可见（放大50000倍），通过使用Zeiss910透射型电子显微镜。

得到的图片有所增强，粒径可通过AdobeImageCS2软件检测。

细胞系和培养条件

衍生和源于人体上皮卵巢癌细胞系的HeyA8，SKOV3ip1，HeyA8-MDR细胞系在之前已有研究。

人类大肠癌细胞株（HCT116）对于DrLeeEllis。

本篇文章中所用到所有细胞株都是德克萨斯大学MD安德森癌症中心的，通过表征细胞线芯的研究得到认证。

简单地说,HeyA8和SKOV3ip1细胞在添加15%胎牛血清和0.1%硫酸庆大霉素的RPMI1640培养基中培养。

HeyA8-MDR细胞在添加有15%的FBS和300ng/ml紫杉醇以及0.1%硫酸庆大霉素的RPMI1640培养基培养。

HCT116细胞在添加10%的FBS和0.1%硫酸庆大霉素的改良伊格尔培养基中培养。

所有的细胞都保存在37°

C，5%CO2/95%的孵箱中。

体外基因沉默

STAT3（靶序列5'

-GCCUCUCUGCAGAAUUCAA-3'

），粘着斑激酶（靶序列5'

CCACCUGGGCCAGUAUUAU-3'

），和一个非定标性的控制序列（靶序列的5'

-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3'

）均购自Sigma-Aldrich公司，RNAiFect转染试剂按照厂家建议使用。

简单地说，SKOV3ip1和HeyA8-MDR卵巢癌细胞系在一式三份的六孔板用1.33μg特定siRNA/孔进行转染，在70％处汇合。

分别使用1:

3.75的siRNA和转染试剂进行转染，对照siRNA和STAT3siRNA组无血清培养基培养6h。

RNA提取和互补DNA的制备

　细胞使用Trizol而均化。

RNA通过提取（氯仿）,沉淀（异丙醇）和纯化（75%乙醇）。

cDNA通过使用SuperScript-II逆转录酶得到2.0μg高质量的RNA　　

微序列分析

在SKOV3细胞使用Illumina平台得到cDNA微序列。

根据厂家的建议使用RNAiFect转染试剂,该细胞置于一式三份含STAT3（8.0μg）或对照siRNA（8.0μg）的10厘米细胞培养板。

在微序列分析前，STAT3基因沉默利用蛋白质印迹在蛋白质水平得到证实。

从微序列分析得到的基因表达数据，加载到异丙醇独创性通路数据库，关于凋亡基因的不同表达可以验证选择性。

聚合酶链反应分析

反转录聚合酶连锁反应（RT-PCR）可以利用cDNA预先形成正常人体器官和癌症细胞系。

人类肝中的cDNA利用SR-B1表达作为阳性对照组。

RT-PCR在应用生物系统公司9500系列中完成，使用条件为之前已作介绍。

肌动蛋白作为一个内源性对照。

平均改变倍数已经报道。

蛋白质印迹分析

用改良放射免疫沉淀裂解缓冲液制备细胞裂解液。

在8％SDS-PAGE中分离蛋白质，并转移到硝酸纤维素膜，随后与STAT3（1:

2500）或FAK（1:

5000）抗体在4°

C孵育过夜。

主要抗体通过抗鼠免疫球蛋白G和化学发光检测试剂盒检测。

肌动蛋白或黏着斑蛋白证实相同的负载量。

卵巢癌细胞细胞凋亡分析

对照或STAT3siRNA　处理后24小时后,卵巢癌细胞（SKOV3ip1和HeyA8-MDR）细胞用多烯紫杉醇（分别为1或500nM）处理72小时，水洗，并用5μl膜联蛋白V/PE和7AAD抗体孵育30分钟。

流式细胞仪分析之前的样品。

免疫组织化学

新鲜冷冻部分由CD31染色（1:

800稀释），ki-67染色是在5μm厚的福尔马林固定石蜡包埋标本上。

为了定量微血管密度，细胞增殖指数（ki-67）和半胱氨酸蛋白酶-3清除率，5个随机区域每个肿瘤放大100倍进行研究。

在人类上皮卵巢肿瘤（n=50）在SB-R1的表达可以用福尔马林固定石蜡包埋标本检测，这种方法源于德克萨斯大学MD安德森癌症中心，是经过机构审查委员会批准。

高表达或低表达都是由妇科病理学家使用下列程序来决定的:

强度从1到3,分布是从1到4。

TUNEL染色

取新鲜冷冻的实验组（SKOV3ip1模型）肿瘤组织部分，通过末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口尾部标记进行末端染色，再用1:

10,000的Hoechst进行复染。

凋亡小体通过绿色荧光表示。

Tunel阳性细胞在10个200×

区域，每组分为5个部分进行计数，得到平均值。

siRNA选择性递送

　SKOV3ip1雌性裸鼠用0.2mg/Kg的荧光标记对照siRNA或无标记对照siRNA（每组n=3时）静脉注射或腹腔注射。

48小时后，处死小鼠，收集肿瘤和器官（脑，心脏，肺，肝，肾，脾）并冷冻。

荧光染色

取新鲜冰冻得原位卵巢癌模型（SKOV3ip1）的肿瘤组织，置于丙酮中，用PBS洗涤，并用Hoechst（1:

10,000）复染。

荧光显微镜在400×

的视野来分析幻灯片。

每张幻灯片有十个高倍区域，取平均值。

原位卵巢癌模型雌性裸鼠（10〜12周龄）购自美国美国国家癌症研究所。

所有的实验都是由MD安德森癌症中心机构动物护理和使用委员会批准。

体内FAK靶向

对于FAK靶向实验（SKOV3ip1模型），治疗组分为（每组n=10）：

1）空rHDL纳米粒，2）对照siRNA/rHDL，3）FAKsiRNA/rHDL，4）对照siRNA+多烯紫杉醇，5）FAKsiRNA/rHDL+多烯紫杉醇

体内STAT3靶向

STAT3基因沉默实验，根据以下各组（每组n=10）进行试验：

1）对照siRNA/rHDL，2）对照siRNA/rHDL+多烯紫杉醇，3）STAT3siRNA/rHDL，4）STAT3siRNA/rHDL+多烯紫杉醇。

适合的肿瘤细胞来源于卵巢癌小鼠模型（HeyA8，SKOV3ip1和HeyA8MDR）用腹腔注射接种。

小鼠随机饲养并在第7天后开始处理。

约HeyA8模型3周后或SKOV3ip1和HEYA8-MDR5周后，解剖小鼠，收集肿瘤。

大肠癌转移模型

对于大肠癌转移模型，HCT116细胞注入雌性裸鼠脾脏（治疗组N=10）。

两个星期后，按照前面描述的开始用奥沙利铂处理，根据图2C所示。

4周后，解剖小鼠，收集肿瘤

体内沉默STAT3或FAK基因的有效剂量通过在SKOV3ip1模型小鼠注入剂量范围为0.1〜0.2mg/KgSTAT3siRNA/rHDL或FAKsiRNA/rHDL来测定。

小鼠在第2，4或6天解剖。

收集肿瘤组织，采用蛋白质印迹分析蛋白表达

统计分析

如果呈正态分布连续变量可以使用t检验（在两个组）或方差分析（所有组）进行比较。

在非参数值中,连续变量使用曼-怀氏等级和检验或秩和检验（所有组）进行比较。

rHDL体内研究将治疗组每10只小鼠被随机分配。

我们使用SPSS和GraphPadPrism软件对所有结果进行处。

我们认为P<

0.05就是显著差异。

本研究中所有的数据使用双侧分析。

结果

包含RNAi的rHDL纳米粒的制备

因为RNAi分子是高度离子化,主要是因为磷酸基团带负电荷，我们设计　　了一个新颖制剂是将siRNA偶联到rHDL里。

反义寡赖氨酸多肽含有大约40赖氨酸残基，这可使siRNA偶联到rHDL。

siRNA偶联后，rHDL纳米粒的直径约10nm（图1，A和B）和带中性电荷（ζ电位−3.2mV）。

rHDL纳米粒具有强大的有效载荷承载能力（最高至4mgsiRNA/ml）。

此外，含有siRNA纳米粒是非常稳定的。

因为样品储存两周并再次透析后siRNA没有从rHDL损失。

SR-B1表达在肿瘤细胞

在研究rHDL作为siRNA的有效递送系统之前，我们首先分析了多个细胞系和人类肿瘤存在的SR-B1受体。

在50种人类卵巢上皮癌,96%的肿瘤细胞表达了SR-B1受体（图1C）。

此外，我们检测在人类正常器官的SR-B1表达并用RT-PCR分析乳腺癌、直肠癌、胰腺癌和卵巢癌细胞系的表达（图W1）。

用RT-PCR也检测了一些细胞系（图1D）。

所有的癌症细胞系测试证实了SR-B1的高水平表达。

在正常的组织里，只有肝脏SR-B1高度表达，而其他组织很少表达。

Figure1.CharacterizationofrHDLnanoparticles.（A）IllustrationsofrHDLnanoparticlecomposition.（B）ElectronmicrographofrHDLnanoparticlescontainingcontrolsiRNA.（C）ExpressionofSR-B1inhumanepithelialovariancancer（IHC）.（D）mRNAexpressionofSR-B1inovarianandcolorectalcancercelllines.

在体内rHDL纳米粒的选择性输送

比起正常组织，考虑到SR-B1受体在肿瘤细胞中的高度表达，我们接下来检测用rHDL纳米粒递送siRNA在体内的有效性。

荧光标记（Alexa555）siRNA被包入到rHDL纳米粒子，并进行IV或IP（图2）。

单剂量注射后，siRNA均匀分布到约80%的特定肿瘤组织。

我们进一步验证rHDL纳米粒的递送是否由受体介导。

为了解决这个问题,，我们首先分析了用Alexa555标记siRNA/rHDL纳米粒处理的小鼠器官（图W2）。

rHDL纳米粒在肝脏中的吸收最高，而在大脑、心脏、肺、肾、或脾中吸收很少。

静脉注射或腹腔注射rHDL/Alexa555后，肿瘤组织对rHDL纳米粒的吸收无显著差异。

用该方法进行长期治疗实验之前，我们下一个验证STAT3siRNA偶联到rHDL纳米颗粒（siRNA/rHDL）在体内基因沉默的有效性。

STAT3siRNA的有效性首先在体外SKOV3细胞上测试（图W3A），与对照组siRNA相比，5μg的STAT3siRNA导致STAT3蛋白表达超过80%的减少。

接下来，检测在体内沉默STAT3基因的有效剂量。

在SKOV3ip1小鼠模型中我们注射STAT3siRNA/rHDL，剂量范围从0.1至0.2mg/Kg。

第四天，单剂量注射0.2mg/Kg的siRNA，我们发现降低了88%STAT3蛋白水平（图W3B），在第6天，蛋白表达有些回升。

根据这个实验，我们在后续实验中使用0.2mg/Kg的剂量。

另一个关于癌症生长和转移的关键基因，FAK也具有类似的结果（图W3C）。

在SKOV3ip1小鼠模型中单剂量注射FAKsiRNA/rHDL纳米粒4天后，FAK水平降低了87%。

Figure2.SystemicdeliveryofsiRNAusingrHDLnanoparticles.（A）UptakeofAlexa555-labeledsiRNA/rHDLinSKOV3ip1tumors.AsingleIVorIPinjectionof0.2mg/kgofAlexa555labeledor0.2mg/kgofIVandIPinjectionofuntaggedsiRNA/rHDLwasadministeredinmicebearingSKOV3ip1tumors,and48hourslater,tumorswereharvestedandcounterstainedwithHoechst（blue）,andsiRNA（red）uptakewasassessedwithfluorescencemicroscopy.TheH&

Eimageshowstumorhistologicdiagnosis.TheadjacentgraphshowspercentAlexa555-positivecells.（B）InvivoefficacyofSTAT3siRNA/rHDLinchemosensitive（HeyA8andSKOV3ip1）andchemoresistant（HeyA8-MDR）mousemodelsofovariancarcinoma.*P<

.05comparedwithcontrols.**P<

.05comparedwithcontrolsaswellasdocetaxelalone.（C）InvivoefficacyofSTAT3siRNA/rHDLincolorectalcancermodeloflivermetastases（HCT116）.*P<

.05comparedwithcontrolsiRNA/rHDL,**P<

.05comparedwithSTAT3oroxaliplatinalone.InvivoefficacyofFAKsiRNA/rHDLintheSKOV3ip1ovariancancermodel.*P<

.05comparedwithcontrolsaswellasdocetaxelalone.Errorbars,SEM

STAT3或FAK基因沉默对肿瘤的生长和转移的影响

体内成功沉默FAK或STAT3基因后（图W3B），我们接下来测试了这种是否用多烯紫杉醇化疗药方法的治疗有效性。

我们首先用STAT3siRNA/rHDL靶向STAT3（图2B）。

在三个原位卵巢癌小鼠模型中用单独STAT3siRNA/rHDL或偶联多烯紫杉醇进行治疗。

在HeyA8模型中，单独给STAT3siRNA/rHDL或多烯紫杉醇减少了的62%的肿瘤重量（P<

0.5年,两者）。

与对照组比较，STAT3siRNA/rHDL和多烯紫杉醇的联合治疗使肿瘤重量减少的最多（92%，P<

0.05）。

在SKOV3ip1模型中结果类似（图2B）。

另外，当STAT3siRNA/rHDL有无多烯紫杉醇处理小鼠，HeyA8和SKOV3ip1卵巢癌模型中证实了肿瘤结数量的剧减。

（图W4A）

考虑到STAT3的耐药性，我们还进行了紫杉醇耐药HeyA8-MDR模型实验（图2B）。

正如预期，多烯紫杉醇对肿瘤的生长无显著影响。

STAT3siRNA/rHDL单药疗法使肿瘤生长减少了76%（P<

0.01）。

多烯紫杉醇和STAT3siRNA/rHDL联合疗法使肿瘤细胞的增长减低的更多（比起对照组，91%，P<

0.001；

比起多烯紫杉醇，89%，P<

0.1）。

肿瘤节数量也有类似的效果（图2）。

我们在每一个治疗组的动物的局部转移频率进行了分析。

相比于对照组和多烯紫杉醇单药疗法，STAT3siRNA/rHDL是否偶联多烯紫杉醇都能显著降低上腹部和薄壁肝组织的转移。

接下来，我们研究在转移性结直肠癌小鼠模型（HCT116）研究STAT3沉默基因的治疗效果，该模型使SR-B1表达（图2C）。

肿瘤细胞注射到脾脏后，转移扩散到肝脏。

STAT3siRNA/rHDL单独治疗导致在肿瘤的重量减少79％（P<

0.01）。

对于这些实验，我们常用细胞毒性，奥沙利铂，偶联STAT3siRNA/rHDL。

奥沙利铂降低55％的肿瘤生长（P<

0.01）。

与对照组相比，奥沙利铂和STAT3siRNA/rHDL偶联治疗可使肿瘤重量（96％，P<

0.01）和肝脏中转移损坏数目（86％，P<

0.01）显着减少。

为了评估rHDL纳米粒的安全性，我们评估用rHDL纳米粒处理小鼠的几个参数（图W5）。

在两个不同治疗组中，动物体重或肝功能测试（AST和ALT比值）没有显着差异（图W5，A和B）。

与对照组相比，治疗结果显示没有显着变化后，多个正常器官用苏木精和伊红（H＆E）染色（图W5C）

为了测试rHDL纳米粒对其他靶点的效用潜力,我们进行了FAKsiRNA/rHDL实验。

我们在SKOV3ip1原位卵巢癌模型中用FAKsiRNA/rHDL纳米粒靶向FAK（图2C）。

FAK或多烯紫杉醇单药治疗可使肿瘤重量减少62%和74%（两者P<

联合治疗显著减少肿瘤重量（96%，P<

0.01），肿瘤节的数量（74%，P<

0.05）。

空rHDL纳米粒和对照siRNA/rHDL处理的小鼠之间没有显著差异。

　STAT3靶向肿瘤微环境的影响

为了了解STAT3/rHDL的生物效应，在药物敏感的（SKOV3ip1）和药物耐药（HeyA8-MDR）卵巢癌模型中进行一系列的体内体外实验。

在SKOV3ip1卵巢癌模型中（图3）,STAT3基因沉默减少26%细胞增殖（P<

0.05），而多烯紫杉醇抑制30%肿瘤细胞增殖（P<

与对照组比较，STAT3siRNA/rHDL和多烯紫杉醇联合治疗可抑制48%肿瘤细胞增殖（P<

0.05）（图3）。

在HeyA8-MDR卵巢癌模型中（图W6），就多烯紫杉醇处理对于细胞增殖就没有效果，STAT3siRNA/rHDL单药可减少19%细胞增殖。

对照组比较，STAT3siRNA/rHDL和多烯紫杉醇偶联治疗可显著降低细胞增殖（39%，P<

为了确定STAT3沉默对肿瘤相关血管生成的影响,我们从所有四个实验组取新鲜冷冻肿瘤组织的样品进行CD31染色实验（图3和W5）和检测MVD。

在SKOV3ip1模型,STAT3siRNA/rHDL或多烯紫杉醇单药治疗在MVD（图3）产生66%至69%的降低（P<

比起对照组，STAT3siRNA/rHDL和多烯紫杉醇偶联治疗在MVD可减少88%（P<

同样,在HeyA8-MDR模型中，就多烯紫杉醇处理对MVD　的降低没有影响，但多烯紫杉醇和STAT3siRNA/rHDL偶联治疗可显著降低（图W6）。

众所周知，STAT3被认为是增加细胞存活和抑制细胞凋亡。

因此，我们在SKOV3ip1卵巢癌模型中用TUNEL染色法（图3）