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三．Hela细胞核及染色质提取物的制备18

四．磷酸钙法转染真核细胞19

五．Hela细胞的RNAi转染20

六．提取Hela细胞的mtDNA21

七．昆虫细胞的培养及蛋白质的表达22

（一）.昆虫细胞的培养22

（二）.病毒的获得，培养与转染23

（三）.蛋白的表达和回收24

其它26

一．蛋白胶的银染26

二．WesternBlot实验26

三．电镜相关实验28

（一）．TMP的紫外偶联28

（二）．BND富集单链DNA29

（三）．电镜展膜30

（四）．ssDNA与单链结合蛋白的电镜展膜31

四.纯化oligoDNA31

实验的一些tips32

1.PCR相关：

32

2.酶切、连接相关：

3.乙醇脱色液配方：

4.浓缩蛋白溶液体积：

细菌病毒篇

一．SDS裂解法大量提取细菌质粒

相比质粒小提试剂盒，大量提取的质粒的质量比较好，可以进行人细胞转化，甚至测序等高要求的实验。

为了提高实验的成功率，建议进行质粒大提以保证后续酶切、连接等步骤的顺利进行。

本实验参考《分子克隆实验指南2，3》。

溶液配制：

●溶液I：

50mMGlucose，25mMTris-HCl（pH8.0），10mMEDTA（pH8.0）115℃灭菌冷却后，置于4℃冰箱中保存。

●溶液II：

0.2MNaOH（从10M储液中稀释），1%SDS（从10%储液中稀释）。

溶液2要求现配，在室温中使用，混合顺序是先稀释NaOH，最后加入SDS。

●溶液III：

60.0mL5MKAc，11.5mL冰醋酸，用水配至100mL，灭菌之后置于4℃冰箱中保存，使用时需在冰上。

●PEG8000-NaCl：

13%PEG8000，1.6MNaCl，配后用0.22um滤头过滤后室温保存，或者也可以使用40%PEG8000-30mMMgCl2的配方，效果差不多。

操作步骤：

1.挑取固体培养板上的单菌落接种到3mL含有相应抗生素的液体LB中，37℃振荡培养过夜；

2.取1mL菌液接种到50mL含有相应抗生素的LB培养基中，37℃振荡培养3-5小时；

3.将菌液收集到50mL圆底离心管中，4,000rpm离心5min；

4.弃去上清，用约20mL自来水洗菌体一次，4,000rpm离心5min；

5.用2mL溶液I悬浮菌体，在振荡器上将菌体全部悬浮；

6.用4mL溶液II悬浮，上下颠倒8次至全部混匀至所有溶液均呈透明粘着状态；

7.再加入冰上预冷的3mL溶液III，上下颠倒8次混匀至出现大量白色沉淀；

8.4,500rpm离心10min，将上清转移到干净的圆底离心管中，8,000rpm再次离心10min；

9.将上清转移至干净圆底离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，混匀后-20℃保存1小时以上；

10.10,000rpm离心15min，再用各5mL70%乙醇洗沉淀两次，于室温中晾干；

11.用400uLTE溶解沉淀后转移至1.5mL离心管中，取0.5uL跑胶检测，同时加入2uLRNaseA及0.3uLRNaseT1，取0.5uL跑胶检测RNA是否已经消化完全，消化不完全则补加1-2ulRNaseA；

12.RNA消化完全后，加入300uL平衡酚及300uL氯仿，盖紧盖子后剧烈震荡混匀，室温下最高转速离心10min；

13.可见上下界面之间有白色蛋白质沉淀，重复步骤112-3次（每次室温下最高转速离心5min）至分界面没有明显沉淀，用400uL氯仿抽提一次去除苯酚；

14.加入400uLPEG8000-NaCl沉淀液，上下颠倒彻底混匀，可见溶液变粘稠；

15.4℃离心机最大转速离心15min，用400uL70%乙醇洗沉淀两次，用100uLTE悬浮后取1uL跑胶检测。

注意事项：

1.可以跳过步骤1，直接将单菌落接种到50mL培养基中，但是注意抗生素为氨苄的菌株，不要培养时间过长（>

16h），因为到末期，氨苄消耗完全之后，质粒丢失情况比较严重；

2.不建议在异丙醇沉淀之间进行酚仿抽提，因为这一步体积较大，抽提效果不好，而且消耗酚仿比较多，11步中的抽提，总次数不要超过5次，否则质粒损失量也比较大；

3.超过10kb的质粒，用溶液II处理后，要轻柔一些，否则容易造成质粒的较大损伤，对于昆虫病毒这么大的质粒，最好剪去墙头前面部分以避免剪切力过大。

二．CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞

三．RbCl法制备超级感受态细胞

超级感受态的转化效率比较高，比CaCl2的转化效率要高100-1000倍左右。

参考资料不详。

●Psi培养基：

称取YeastExtract5g，Tryptone20g，MgSO45g溶于约800mLdH2O中，用KOH调pH至7.6，再定容到1L，灭菌冷却后使用；

●TfbI：

称取KAc1.176g，RbCl4.84g，CaCl20.588g，MnCl24.0g，甘油60mL，溶于350mLdH2O中，用冰醋酸调pH至5.8，再定容到400mL，灭菌冷却后置于4℃冰箱中保存；

●TfbII：

称取MOPS0.21g，CaCl21.1g，RbCl0.121g，甘油15mL，溶于80mLdH2O中，用NaOH调pH至6.5，再定容到100mL，灭菌冷却后置于4℃冰箱中保存；

1.挑取单菌落到50mLLB中，37℃振荡培养过夜；

2.接种10mL菌液到1LPsi培养基中，37℃振荡培养至OD550为0.48；

3.转移到500mL离心瓶中，冰浴15min；

4.4℃，4,000rpm，5min，去除上清，加入400mLTfbI，彻底悬浮菌体后，冰浴15min；

5.4℃，4,000rpm，5min，去除上清，用40mLTfbII悬浮菌体，冰浴15min后，分装至1.5mL离心管中，每管100uL，分装后立即在液氮中速冻，然后转入-80℃冰箱中保存；

1.细菌的OD生长到0.5-0.6的时候，并不影响制备的感受态的转化效率，一旦超过0.6，建议重新制备；

2.新鲜制备的感受态，效率可以达到109/ugDNA，冻化之后可稳定在107左右；

3.TfbI灭菌之后，会有红褐色沉淀产生，使用前不必悬浮，不会影响感受态的效果；

4.转化的操作步骤与一般感受态一样，42℃热激60-90s即可。

四．提取λ噬菌体基因组DNA

λ噬菌体是最早使用的克隆载体，λ噬菌体的基因组是一长度约为50kb的双链DNA分子，它在宿主细胞有两种生活途径，其一是裂解生长，环状DNA分子在细胞内多次复制，合成大量噬菌体基因产物，装配成噬菌体颗粒，裂解宿主菌再进行下一次感染；

其二是溶源性生长，即感染细胞内λ噬菌体DNA整合到宿主菌染色体DNA中与之一起复制，并遗传给子代细胞，宿主细胞不裂解。

平板培养时，裂解生长形成噬斑。

液体培养时，裂解生长使菌液中宿主菌最后全部被裂解而释放出大量的噬菌体颗粒。

经过改造的λ噬菌体克隆位点可插入几到几十kb的外源DNA。

许多cDNA和基因组文库是以λ噬菌体作为克隆载体构建的。

因此，在经文库筛选得到目的克隆后，我们常常需要利用λ噬菌体裂解生长的特点，培养获得大量的噬菌体颗粒，并提取λ噬菌体DNA来开展进一步的工作。

（本方法为粗略版，还需要进一步改进）。

本实验参考《分子克隆实验指南2，3》

●20%麦芽糖：

麦芽糖20g，加dH2O至100mL，0.22um滤膜过滤。

●SM液：

称取NaCl5.8g，MgSO4·

7H2O2g，1MTris·

Cl（pH7.5）50ml，2%明胶5ml，加dH2O至1L。

灭菌冷却后使用。

●RNaseA：

10mg/ml，TE配制，沸水浴15min，分装后贮存于-20℃。

●DNaseI：

10mg/ml，TE配制，分装后贮存于-20℃。

1.λ噬菌体培养

1.1λ噬菌体平板培养

1.1.1用SM液10倍梯度稀释λ噬菌体原种。

1.1.2取0.1ml各梯度稀释离心到一消毒微量离心管中，加0.2ml新鲜培养的宿主菌，加麦芽糖（0.2%），MgSO4（10mM），37℃温育20min，使噬菌体颗粒吸附于细菌。

1.1.3取熔化（47℃）0.7%琼脂LB固体培养基3ml与上述管混匀，立即倒入预备（2-4天）的含凝固1.5%琼脂LB固体培养基的平板内，轻轻晃动平板使均匀分布。

1.1.437℃培养6-8hr后，观察噬斑形成。

1.1.5用剪去部分头部的吸头挖取单个噬斑到0.5ml的SM液中，加0.05ml氯仿，震荡。

37℃温育10min。

1.1.6重复⑴-⑷，获得单个噬斑滴度。

1.2λ噬菌体液体培养

1.2.1取2ml新鲜培养的宿主菌，离心，0.4mlLB培养基重悬，加λ噬菌体0.1ml（新鲜获得的单个噬斑，依滴度使之与宿主菌比约1/500-1000）。

1.2.2加麦芽糖（0.2%），MgSO4（10mM），37℃温育20min，使噬菌体颗粒吸附于细菌。

1.2.3加到100mLLB液体培养基中，加麦芽糖（0.2%），MgSO4（10mM），37℃摇震培养9-12hr后可见裂解发生。

1.2.4加0.1mL氯仿，37℃继续摇震培养10-20min。

1.3原代λ噬菌体的培养

原代λ噬菌体整合到CI857细菌中，42℃热激20min即可将λ噬菌体变成裂解性，其它培养操作与上面相同。

2.λ噬菌体DNA提取

2.1将上述裂解液转移至离心管，离心4,000rpm，10min，去细菌碎片，取上清液。

2.2加RNaseA至1ug/mL，DNaseI至1U/mL，37℃温育30min，或者室温作用1h。

2.3加10%PEG8000，5.8gNaCl，摇匀至溶解，冰浴1hr或4℃过夜。

2.44℃离心10,000rpm，10min，去上清液。

2.5加2mLSM液，充分洗溶管壁及沉淀，移到新微量离心管，加20uL10%SDS，20uL0.5MEDTA，68℃15min。

2.6加等体积苯酚/氯仿，混匀，离心10,000rpm，5min，取上层液到一新微量离心管，加等体积氯仿，混匀，离心10,000rpm，5min。

2.7取上层液到一新微量离心管，加0.8倍体积异丙醇，混匀，-20℃1hr，4℃离心10,000rpm，10min，去上清液。

2.81ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀2次，4℃离心10,000rpm5min，弃上清，室温下晾干。

2.9沉淀溶于20uLTE，-20℃保存备用。

1.用于裂解的噬菌体、宿主菌为新鲜培养获得时，裂解好、裂解噬菌体收获量大。

2.液体培养裂解时，如到培养时间时裂解尚未发生，可适当提高培养温度或加大摇震速度。

3.RNaseA、DnaseI消化不全，DNA、RNA可粘走部分噬菌体。

4.苯酚/氯仿抽提时，注意PEG、蛋白质等杂质污染，它们会影响限制性内切酶切割。

五．提取M13mp19噬菌体单链DNA

M13mp19可以大规模的得到单链DNA。

1.将ET-Blue（或XL1-Blue）单菌落接种到5mLLB中，加入四环素使之终浓度为20ug/mL，37℃振荡培养过夜；

2.取1mL菌液加入1LLB（5mMMgCl2），37℃振荡培养至OD550约为0.3；

3.加入1.4mLM13mp19噬菌体溶液（可以从第一次感染得到），37℃振荡培养12h；

4.将培养液转移到500mL离心瓶中，4℃，1,000rpm，10min，收集上清；

5.加入RNaseA至1ug/mL，DNaseI至1U/mL，室温下作用30min；

6.加入NaCl，终浓度为1M，加入PEG8000，终浓度为10%，冰浴1h，或者过夜；

7.4℃，1,000rpm，30min，弃去上清，再4℃，5,000rpm，5min，彻底去除残留上清；

8.用1mLTE悬浮，转移到2mL离心管中，室温酚仿抽提直至没有蛋白出现；

9.加入0.1体积的3MNaAc和0.8体积的异丙醇，-20℃沉淀1h；

10.4℃，14,000rpm，15min，用300uL70%乙醇洗沉淀两次，4℃，14,000rpm，5min；

11.用300uLTE溶解之后跑胶。

1.在酚仿抽提之前，可以加入SDS到1%，65℃煮15min后抽提DNA；

2.为了提高DNA的质量，可以过SepharoseCL6B柱子进一步纯化或者用RNaseA处理RNA，以提高后续实验的成功率。

六．大肠杆菌表达蛋白（小量）

在大肠杆菌里面表达蛋白是实验室的常规操作之一，我们现在常用的表达菌株有三种：

A，最常见的是BL21-plys（DE3），适用于一般的常规表达；

B，Rosetta（DE3），该菌种含有6种大肠杆菌中稀缺的密码子（AUA、AGG、AGA、CUA、CCC、GGA），可以提高真核蛋白基因在大肠杆菌里的表达；

C，OrigamiB（DE3），该菌种包含突变的硫氧蛋白还原酶和谷胱甘肽还原酶基因，有利于蛋白在体内的正确折叠。

一般常规做法是直接使用BL21-plys（DE3），效果不佳的话，可以试用另外两个蛋白。

这里以pet28a质粒在BL21-plys（DE3）中表达来为例说明。

●BufferA：

50mMHEPES（pH7.5，可用Tris-HCl代替），100mMKCl（浓度可变），5mMMgAc2，5mMEDTA/EGTA，10%甘油，0.04%NP40。

●卡那霉素：

Kanamycin，购于Amersco，用水配制成50mg/mL的1000×

储液，分装后贮存于-20℃。

●氯霉素：

Chloramphenicol，购于Amersco，用无水乙醇配成34mg/ml的1000×

●PMSF：

购于Amersco，用异丙醇成17.4mg/ml的100×

储液，溶解后１ml分装，-20℃冻存。

1.在新鲜转化的平板上挑取单菌落接种到3mLLB（附加50ug/mL卡那霉素、34ug/mL氯霉素）中，在37℃培养过夜；

2.取1mL菌液接种到50mLLB（附加50ug/mL卡那霉素）中，在37℃继续培养2-3小时；

将剩余2ml菌液作为阴性对照保留下来，或者可以扩大到10mL培养液里面继续培养以作为对照；

3.待细菌的OD600达到0.4-0.6之间时，加入0.5mMIPTG诱导细菌在合适的温度下表达4小时；

4.将细菌转到50mL尖底离心管中，4℃，4500rpm离心5min；

5.用自来水洗菌体一次，将菌体悬浮到5mLbufferA（含有PMSF）中，转移到15mL尖底离心管中；

6.用细头超声破碎仪破碎，5s（W）/10s（R）/100W，超声60次后可以看到菌液变澄清；

7.取100uL破碎液出来，4℃，14,000rpm离心15min，其它的冻存到-20℃以备小规模柱子试纯化条件；

8.将上清取出来，用100uLbufferA悬浮沉淀，往上清和沉淀中加入50uL3×

SDSloadingbuffer，95℃煮5min后，直接跑胶检测或者于-20℃冻存。

1.如果有多个蛋白进行表达预实验，那么就不用设阴性对照，因为蛋白彼此之间的表达谱便可以作为对照；

2.BL21-plys（DE3）中，plys含有氯霉素抗性基因，所以扩增的时候要加入氯霉素，但是表达的时候不需要氯霉素；

Rosetta（DE3）中，含有tRNA基因的质粒具有氯霉素抗性，需要加氯霉素维持；

OrigamiB（DE3）感受态具有卡那霉素抗性和四环素抗性基因，需要加入这两种抗生素维持，适合转含有氨苄抗性的质粒；

3.氯霉素可以抑制蛋白的本地表达，所以在过夜培养时需要补加，以保证存货菌株的蛋白表达效率；

4.超声之后，如果澄清但不透明，那也是正常的，很可能是蛋白以包涵体形式存在；

5.如果准备用Ni-NTA柱来试条件的话，bufferA中就不要加入EDTA和DTT，因为这两种物质会螯合Ni2+，造成柱子效果的降低。

七．大肠杆菌表达蛋白（大量）

小量表达蛋白，取得适当的实验条件之后，就可以进行大量的表达。

1.在新鲜转化的平板上挑取单菌落接种到50mLLB（附加50ug/mL卡那霉素、34ug/mL氯霉素）中，在37℃培养过夜；

2.取10-20mL菌液接种到1LLB（附加50ug/mL卡那霉素）中，在37℃继续培养2-3小时；

3.待细菌的OD600达到0.4-0.6之间时，加入0.5mMIPTG诱导细菌表达4小时；

4.将细菌转到500mL离心瓶中，4℃，4500rpm离心5min；

5.用自来水洗菌体一次，将菌体悬浮到20mLbufferA（含有PMSF）中，并转移到50mL尖底离心管中；

6.用粗头超声破碎仪破碎，5s（W）/10s（R）/400W，超声60次后可以看到菌液变澄清（或略有浑浊）；

7.4℃，4,500rpm离心10min，将上清转移到干净的圆底高速离心管中，4℃，16,000rpm离心20min，然后再次转移到干净的圆底离心管中，4℃，16,000rpm离心30min；

8.将上清转移到干净的离心管中，补加PMSF，可以进行后续的实验。

1.菌体离心回收，用自来水洗过，可以悬浮转移到尖底离心管中，离心去除上清之后，冻存在-80℃冰箱；

高速离心分段的效果会比较好，速度提高到30,000rpm的话，30min就足够了。

酵母篇

生化篇

一．提取酵母基因组DNA

相比其它物种的细胞而言，酵母细胞有较厚的细胞壁，所以细胞不能很好的直接破碎。

而提取基因组DNA的方法则和其它细胞差不多。

所以，提取酵母基因组DNA首先必须能够迅速裂解酵母细胞壁，同时又尽可能的保持细胞内基因组DNA的完整性。

溶液配置：

●1.2MSorbitol：

称取218.6g固体溶于800mL水，定容到1L，115℃灭菌15min后贮存于常温，也可用磷酸缓冲液调节pH为6.8。

●lysingEnzyme：

称取150mglysingexzyme固体，溶于1mL无菌水中，-20℃保存。

●1MDTT：

称取1.54g固体，溶于10mL无菌水中，分装到10管中，-20℃保存。

●lyticase：

lyticase直接溶解于甘油缓冲液之中，置于冰上备用。

●0.3MNaN3：

配置0.3M，灭菌后常温保存。

1.往50mL细胞的培养基中补加NaN3到1-3mM，冰上静止1-3min；

2.1000g，5min，将培养好的50mL细胞离心下来，去除上清，加入约20mL自来水，将细胞悬浮起来；

3.1000g，5min，将细胞离心上来，去除上清，用500uL1.2MSorbitol悬浮细胞，将细胞转移到干净无菌的2mL离心管中；

4.加入10uL0.5MEDTA，5uL1MDTT，20uLlyticase，在32℃下消化约30min直到90%以上的细胞在等体积的1%SDS中变成ghostcell[这一步非常关键，请一定仔细阅读注意事项]；

5.4℃，1000g，5min，将细胞离心下来，用冰上预冷的2ml1.2MSorbitol悬浮细胞；

6.4℃，1000g，5min，将细胞离心下来，用冰上预冷的500uLTE悬浮细胞，补加10uL0.5MEDTA；

7.加入50uL10%的SDS裂解细胞，迅速上下颠倒使细胞破碎；

8.立即往离心管中加入500uLTris饱和酚和500uL氯仿，迅速上下颠倒抽提蛋白，重复该步骤直至没有明显的蛋白出现为止，最后一步只用500uL氯仿抽提；

9.往离心管中加入50uL3MNaAc（pH5.3）和1mL无水乙醇，在-20℃中沉淀1h以上；

10.离心沉淀DNA，用70%无水乙醇洗沉淀两次，再用200uLTE溶解基因组DNA，这一步可以加入5uLRNaseA和0.5uLRNaseT1，一边消化RNA，一边促进基因组DNA的溶解；

11.消化RNA之后，继续用酚/氯仿抽提两次，用乙醇沉淀后，用50uLTE溶解DNA即可。

NoteThat：

1.NaN3可以有效防止提取的基因组DNA产生缺口，保持DNA的完整性；

2.在进行操作的时候，一定要使用去头的枪头，防止剪切力破坏DNA复制叉的结构，如果仅仅为了进行PCR检测则不需要此操作；

3.裂解细胞壁时，加入DTT的终浓度为10mM，加入的lyticase的量应该适中，使细胞可以在30-60min之内消化比较好。

如果收集细胞时，细胞的OD接近1，可以将lyticase加到DTT的5-10倍，如果OD比较低，可以加到DTT的2-5倍，这个跟lyticase的批次关系也很大。

如果收集的细胞的体积比较大，超过100mL之后，可以往体系中补加0.5-1个DTT体积的150mg/mLlysingenzyme（sigmaL1412）以补充蛋白酶促进细胞壁的裂解。

在提取酵母基因组的时候，裂解不太充分仍可以提出足够量的DNA进行PCR检测；

4.裂解细胞壁时候的温度，也应该根据实验需要来确定，如果是普通的细胞，建议在30-32℃进行，如果是温度敏感株则可能根据实验需要在2