发酵工艺原理讲稿Word格式.docx
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按获取能量的方式分——好氧发酵，厌氧发酵
2.
按产物类型分——初级代谢物发酵，次级代谢物发酵；
食品发酵，有机酸发酵，氨基酸发酵，维生素发酵，抗生素发酵……
3.
按操作类型分——自然发酵，纯种发酵，混种发酵；
分批发酵，半连续发酵，连续发酵；
固态发酵，液态发酵
4.按发酵生物类型分——细菌发酵，真菌发酵，基因工程菌发酵，动植物细胞发酵
二．发酵工程的发展史
发酵现象的早期认识：
1680年制成显微镜───微生物的存在
1857年巴斯德证明了酒精是由活的酵毋发酵引起的
1897年毕希纳发现磨碎的酵母仍使糖发酵形成酒精───酶
发酵工程的早期阶段：
人们的对发酵技术的认识起始于19世纪末，主要来自于厌氧发酵,如利用酵母菌、乳酸菌生产酒精、乳酸和各种发酵食品。
20世纪初期，1916年英国采用梭状芽孢杆菌生产丙酮丁醇，德国采用亚硫酸盐法生产甘油（第一次世界大战）──由食品工业向非食品工业发展
好氧发酵技术,速酿法从乙醇生产醋酸，通气法大量繁殖酵母，用米曲霉的麸曲代替麦芽糖作糖化剂生产酒靖，用微小毛霉生产干酪。
⏹1933年等人发明了摇瓶培养法代替了传统的静置培养法。
生长均匀，增殖时间短。
发酵工程的重大转折点：
二十世纪四十年代初，第二次世界大战爆发，青霉素的发现，迅速形成工业大规摸生产。
1928年由Fleming发现青霉素
1941年美国和英国合作对青霉素进行生产研究
链霉素、金霉素、新霉索、红霉素等发酵品种的开发
主要的技术进展：
通气搅拌解决了液体深层培养时的供氧问题。
抗杂菌污染的纯种培养技术：
无菌空气、培养基灭菌、无污染接种、大型发酵罐的密封与抗污染设计制造。
意义：
抗生素工业的发展
建立了一套完整的好氧发酵技术，大型搅拌发酵罐培养方法
推动了整个发酵工业的深入发展。
50年代，瓦克斯曼发现了链霉素，直至60年代后期，先后发现了几千种抗生素，投入生产上百种，可谓是抗生素工业大发展的时代。
为现代发酵工程奠定了基础
代谢调节控制发酵：
氨基酸发酵工业──谷氨酸、赖氨酸
核酸发酵工业──肌苷酸、乌苷酸
微生物变异株通过代谢调节──代谢控制发酵技术
切断支路代谢转折点:
酶的活力调控,酶的合成调控（反馈控制和反馈阻遏）→解除菌体自身的反馈调节,特殊调节控制的利用,突变株的应用,前体、终产物、副产物等
20世纪70年代：
细胞融合技术、基因操作技术等生物技术发展，打破了生物种间障碍，能定向地制造出新的有用的微生物：
增加微生物体内控制代谢产物产量的基因拷贝数，可以大幅度地提高目标产物的产量
发酵工艺扩展为包括微生物、工程菌和动植物细胞培养的新型发酵工程菌发酵生产以前不能产生的产物
三、发酵工业的特点
1．主要优点2．缺点
1.产物结构复杂性和特异性：
手性或光学活性
2.过程安全性：
水相、常温、常压、中性、不燃不爆
3.主要原料可再生性：
阳光和土地
4.原料可替换性
5.反应自控性
6.设备通用性
7.副产物可综合利用性
8.生产能力可提高性：
突变与基因扩赠
9.产物类型可塑性：
突变与转基因
1.副产物多，分离精制困难
2.反应速度慢
3.原料转化率低
4.反应浓度低
5.生产稳定性差
6.设备庞大，辅助设备多，投资大
7.废水、废渣排放量大，处理费用高
8.生产过程容易受到其他微生物的污染
9.通气、搅拌、冷却等能耗大
四.发酵在经济发展中的作用
发酵是工业生物技术（生物制造）的产业化的主要技术
生物制造是有效的资源替代和文明替代方式
生物制造是什么？
是生物技术革命的第三次浪潮，
是工业可持续发展最有希望的技术，
将为人类现代新文明提供充裕的物质财富，是现代新文明的支柱。
五、发酵工业的范围
1．酿酒和酒精发酵工业：
白酒，黄酒，米酒，葡萄酒，啤酒，果酒，工业酒精等。
2．发酵食品工业：
酱油，食醋，豆瓣酱，酸菜，活性酵母，活性乳酸菌，面包，酸奶，奶酪，酱豆腐，纳豆等。
3．有机酸发酵工业：
醋酸，乳酸，柠檬酸，葡萄糖酸，苹果酸，衣康酸，琥珀酸，丙酮酸，反丁烯二酸，曲酸等。
4．氨基酸发酵工业：
谷氨酸，赖氨酸，色氨酸，苏氨酸，精氨酸，酪氨酸，异亮氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸等。
5．核苷酸发酵工业：
肌苷酸（IMP），鸟苷酸（GMP），黄苷酸（XMP）。
6．低聚糖与多糖发酵工业：
低聚果糖，香菇多糖，云芝多糖，葡聚糖，出芽短梗孢糖，黄原胶等。
7．抗生素发酵工业：
青霉素，头孢菌素，链霉素，红霉素，四环素，制霉菌素，丝裂霉素等。
8．维生素发酵工业：
维生素C，异维生素C，维生素B2，维生素B12等。
9．基因工程制药工业：
促红细胞生成素（EPO），集落刺激因子（CSF），表皮生长因子（EGF），人生长激素，干扰素，白介素，各种疫苗，单克隆抗体等。
10．分子量药理活性物质发酵工业：
免疫抑制剂，免疫激活剂，HMG-CoA还原酶抑制剂，糖苷酶抑制剂，脂酶抑制剂，类固醇激素等。
11．制剂发酵工业：
淀粉酶、蛋白酶、脂酶、青霉素酰化酶、青霉素酶、葡萄糖氧化酶、氨基酸氧化酶、海因酶等。
12．发酵饲料工业：
干酵母、单细胞蛋白、酵素菌、益生菌、青贮饲料、抗生素和维生素饲料添加剂等。
13．生物肥料与农药工业：
细菌肥料、赤霉素、除草菌素、苏云金杆菌、白僵菌、绿僵菌、杀稻瘟菌素、有效霉素、春日霉素等。
14．其他发酵工业：
甘油、乙醇、丙酮、丁醇溶剂等。
15．植物或中药材细胞培养工业：
冬虫夏草，人参皂甙，紫杉醇等
16．水生物处理工业：
活性污泥、沼气发酵等。
六、发酵工程的基本技术过程流程
无菌空气的制备
《发酵工程工艺原理》课程的内容
绪论、菌种的筛选与选育、培养基、灭菌与无菌空气的制备、生产菌种的制备、氧的供需与控制、发酵动力学、发酵工艺过程控制、染菌的防治
主要参考书：
发酵工艺原理》中国医药科技出版社
《新编生物工艺学》华东化工大学出版社
《生物化学工程》上海科学技术出版社
《微生物工程工艺原理》华南理工大学出版社
《现代生物技术概论》北京师范大学出版社
《微生物工程》科学出版社
《发酵工业概论》中国轻工业出版社
主要专业期刊
微生物学报、微生物学通报、食品与发酵工业、工业微生物、生物工程学报、生物工程进展、食品与生物技术、生物技术通报、医药生物技术、生物加工过程
第二章生产菌种的选育
第一节工业微生物的分离筛选（Separationandscreening）
一、菌种的来源
根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；
从大自然中分离筛选新的微生物菌种。
二、从自然界中分离筛选菌种的方法步骤
目的：
高效地获取一株高产目的产物的微生物
有针对性地采集样品
采样样
让目的微生物在种群中占优势，
使筛选变得可能。
富集培养
纯种分离的原则就是使培养物获
得单个菌落。
纯种分离
菌落的选择
利用筛选模型，选择具有目的产物合成
能力相对高的菌株
生产性能测定
采样
1、采样对象
以采集土壤为主。
根据微生物营养类型。
根据微生物的生理特性。
极端环境条件下。
2、采样季节：
以温度适中，雨量不多的秋初为好。
3、采土方式：
在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。
为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。
富集方法（enrichement）
物理方法：
加热、膜过滤等，表2-2（P31）
通过定向培养的方法：
5、抑菌剂
2、pH条件
4、培养温度
3、培养时间
1、底物
等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养（固体、液体；
分批连续）后使目的微生物在种群中占优势。
纯种分离
1．稀释分离法
2．平板划线分离法
⑴涂菌：
⑵划线分离：
菌落的筛选-筛选依据
从产物角度出发
在培养时以产物的形成有目的的设计培养基
利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素（P35）
从形态的角度
菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。
如多糖产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观上就可以初步识别。
菌落的筛选方法——分初筛和复筛
初筛以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，以量为主。
菌落直接涂布法
琼脂挖块法
纸片法
复筛则是精选，以质为主，也就是以精确度为主。
因此在具体方法上就有差异。
一般是将初筛菌株接入液体培养，当目的产物达到高峰时期，终止培养，用精确的检测手段，进行目的产物的定量测定。
变色圈法
在底物平板中加入指示剂或显色剂使所需微生物很快鉴别出来.
如：
碱性纤维素酶产生菌的筛选，糖苷酶抑制剂产生菌的筛选
透明圈法:
在平板培养基中加入溶解性较差的底物,使培养基浑浊,能分解底物的微生物便会在菌落周围形成透明圈。
例.-淀粉酶的筛选
例、蛋白酶产生菌的分离筛选
生长圈法：
通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素等生长因子产生菌。
工具菌采用抗生素敏感菌，将待筛选菌涂布于（或用纸片浸润发酵液贴于）含有工具菌的平板上，若待筛选菌能分泌抗菌物质，在菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈。
环保降解菌筛选：
采用以该物质为唯一碳源或氮源的液体培养基上进行培养，能分解该物质的微生物正常生长，其他菌则被淘汰。
浓度梯度法
产物合成能力与抗自身产物能力有关，有毒物质的降解能力与抗此毒物能力有关
第二节工业微生物的诱变育种
育种方法：
基因突变：
自然选育、诱变育种
基因重组：
杂交、原生质体融合、基因工程
基因的直接进化：
点突变、易错PCR、DNAShuffling等
一、自然选育
自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为10-8～10-9
自然突变有两种情况：
一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰退和生产质量的下降，这种突变成为负突变。
另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利，这种突变成为正突变。
自然选育在工业生产上的意义
自然选育操作步骤：
一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。
单细胞（孢子）悬液的制备
平板分离
单细胞分离
挑选单菌落（注意形态的观察）
发酵试验
二、诱变育种
用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选，称为诱变育种
诱变剂：
能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂
诱变剂:
物理：
紫外，快中子，X、γ射线，航天育种
化学：
硫酸二乙酯，亚硝基胍，5—氟尿嘧
*确定出发菌株
↓
*菌种的纯化选优
↓←出发菌株的性能鉴定
*同步培养
*制备单细胞（或单孢子）悬液
↓←活菌浓度测定
*诱变剂的选择与确定诱变剂量的预试验
*诱变处理
*平板分离
↓计形态变异的菌落数，计算突变率
*挑取疑似突变菌落纯培养
↓
*突变体的初步筛选
↓←用简单快捷的方法
*重复筛选
↓←摇瓶发酵试验
*选出突变体（根据情况进行生产试验或重复诱变处理
出发菌株的选择:
1．自然界新分离的野生型菌株，对诱变处理较敏感，容易达到好的效果。
2．在生产中经生产选种得到的菌株与野生型较相像，也是良好的出发菌株。
3．每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多次诱变能积累较多的提高。
4．出发菌株开始时可以同时选2～3株，在处理比较后，将更适合的出发菌株留作继续诱变。
5．要尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细胞体来作出发诱变细胞，这是由于变异性状大部分是隐性的，特别是高产基因。
6．根据采用的诱变剂或根据细胞生理状态或诱变谱选择诱变剂，因为同一诱变剂的重复处理会使细胞产生抗性，使诱变效果下降。
有的诱变剂是作用于营养细胞，就要选对数期的细胞：
有的作用于休止期，就可选用孢子。
处理菌悬液的制备
这一步骤的关键是制备单细胞和单孢子状态的、活力类似的菌悬液，为此要进行合适培养基的培养，并要离心，洗涤，过滤。
诱变处理
根据前面有关诱变剂及诱变处理的介绍，结合诱变对象的实际，设计诱变处理方案。
紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯，波长为2537A．灯与处理物的距离为15～30cm，照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。
一般我们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量死亡率控制在70～80%为宜。
被照射的菌悬液细胞数，细菌为106个／ml左右，霉菌孢子和酵母细胞为106～107个／ml。
由于紫外线穿透力不强，要求照射液不要太深，约0.5～1.0cm厚，同时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌，使照射均匀。
由于紫外线照射后有光复活效应，所以照射时和照射后的处理应在红灯下进行。
（二）操作步骤
1．将细菌培养液以3000r／min离心5min，倾去上清液，将菌体打散加入无菌生理盐水再离心洗涤。
2．将菌悬液放入一巳灭菌的，装有玻璃珠的三角瓶内用手摇动，以打散菌体。
将菌液倒入有定性滤纸的漏斗内过滤，单细胞滤液装入试管内，一般处于浑浊态的细胞液含细胞数可达108个／ml左右，作为待处理菌悬液。
3．取2～4m1制备的菌液加到直径9cm培养皿内，放入一无菌磁力搅拌子，然后置磁力搅拌器上、15W紫外线下30cm处。
在正式照射前，应先开紫外线10min，让紫外灯预热，然后开启皿盖正式在搅拌下照射10～50s。
操作均应在红灯下进行，或用黑纸包住，避免白炽光。
4．取未照射的制备菌液和照射菌液各o.5ml进行稀释分离，计数活菌细胞数。
5．取照射菌液2ml于液体培养基中（300ml三角瓶内装30ml培养液），120r／min振荡培养4～6h。
6．取中间培养液稀释分离、培养。
7．挑取菌落进行筛选。
（三）、筛选的方法
随机筛选：
形态
理性化筛选:
代谢控制育种
从产物形成的生理生化途径着手，进行有的放矢的筛选。
如结构类似物抗性、营养缺陷型等，筛选而产生的这些特性，称为遗传标记。
代谢控制育种：
通过遗传变异来改变微生物的正常代谢，使某种代谢产物形成和积累。
例1、营养缺陷型突变体的筛选及其应用
营养缺陷型：
auxotroph
野生型菌株失去合成某种生长及代谢所需物质（生长因子）的能力，只有在基本培养基中补充所缺乏的营养因子才能生长的突变株。
营养缺陷型可以使发生障碍的前一步的中间代谢产物大量积累。
营养缺陷型在生物合成中发生障碍，合成反应不能完成，可通限量过外加缺陷的营养物，克服生长障碍，并解除了终产物反馈阻抑，而有利于中间产物或另一途径终产物的积累。
如Thr缺陷型
营养缺陷型突变体的筛选及其应用
1筛选用培养基
⑴基本培养基：
凡是能满足某种野生型菌株营养要求的最低成分的合成培养基，称为基本培养基；
常以‘[-]’表示；
MM
⑵在基本培养基中加入一些富含氨基酸、维生素及含氮碱基之类的天然有机物质如蛋白胨、酵母膏等，以满足该微生物的各种营养缺陷型菌株都能生长繁殖的培养基，称为完全培养基，常用‘[+]’表示；
CM
⑶在基本培养基中只是有针对性地加入某一种或某几种营养缺陷成分，以满足相应的营养缺陷型生长的培养基，称为补充培养基，补充培养基可按所加入营养成分相应地用‘[A]’、‘[B]’等来表示。
SM
2．营养缺陷型菌株筛选的一般方法
（1）诱变剂处理
（2）淘汰野生型菌株
①抗生素法
②菌丝过滤法
（3）检出营养缺陷型
（4）鉴定营养缺陷型
淘汰野生型
抗生素法：
野生型能在MM中生长，而缺陷型不能，于是将诱变处理液在MM中培养短时让野生型生长，处于活化阶段，而缺陷型无法生长，仍处于休眠状态。
由于细菌或酵母对一些抗生素敏感，于是就相应加入一定量的抗生素，结果活化状态的野生型就被杀死，保存了缺陷型。
一般细菌可以采用青霉素，酵母可采用制霉菌素。
菌丝过滤法：
对于霉菌，因孢子生长后会长出菌丝体，就可用滤纸过滤法将菌丝滤去，而缺陷型孢子却因未发芽而不能滤过。
检出缺陷型
原理：
在固体基本培养基和完全培养基上，生长情况完全不同，缺陷型在CM上生长良好，而在MM上则不生长，野生型都能生长。
具体方法：
影印法、点种法、夹层法、限量补充培养法
夹层培养法
限量补充培养法
影印接种法
逐个检出法
例2：
抗结构类似物菌株筛选及应用
结构类似物：
在化学和空间结构上和代谢的中间物（终产物）相似，他们和终产物一样对酶有反馈阻抑作用，但细胞不能以其作为自身的营养物质，且对微生物具致死或抑菌作用。
在含一定剂量的结构类似物的培养基中，野生型不能生长，抗结构类似物菌株可以生长，这样的变株也就解除了代谢产物的阻抑现象，使目的产物大量积累。
黄色短杆菌中赖氨酸的合成调节机制
结构类似物抗性：
Lys的类似物AEC（2-氨基乙基L半胱氨酸）
Thr的类似物AHV（2-氨基-3羟基戊酸）
抗结构类似物菌株筛选方法
低浓度
高浓度
上层加入结构类似物
下层不加入结构类似物
梯度平板上菌落生长情况
中抗性菌株
高抗性菌株
第三节基因工程育种
是运用体外DNA各种操作或修改手法获得目的基因，再借助于病毒、细菌质粒或其他载体，将目的基因转移至新的宿主细胞并使其在新的宿主细胞系统内进行复制和表达，则可获得目的基因产物或表现出有益性状。
重组DNA操作一般步骤：
（1）分离：
提取和获得目的基因
和载体DNA；
（2）切割：
分别对目的基因和载体DNA
酶切；
（3）连接：
目的基因与载体连接，
形成新的重组DNA分子；
（4）转化：
用重组DNA分子转化受体
细胞；
（5）筛选：
能在受体细胞中复制和遗
传；
对转化子筛选和鉴定；
（6）表达：
对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。
1目的基因的获取
1）化学合成法
较短的基因（60-80bp）
用途：
PCR引物
测序引物
定点突变
2）基因组文库
用限制性内切酶切开染色体DNA，与用产生同样末端的酶打开的载体DNA环相连接，然后进行克隆、转化、培养、鉴定。
cDNA：
用mRNA反转录成单链DNA，再经DNA聚合酶的作用产生双链DNA。
可去除真核生物基因中不表达的内含子。
3）用PCR方法扩增目的基因片段（PolymeraseChainReaction）
变性：
双链DNA解链成为单链DNA
退火：
部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合
延伸：
以目的基因为模板，合成互补的新DNA链
经过以上过程的循环，可使目的基因扩增。
2载体（vector）DNA的选择
存在于细菌染色体外的小型环状DNA分子。
功能：
为目的基因提供进入受体细胞的转移能力。
为目的基因提供在受体细胞中的复制能力或整合能力。
为目的基因提供在受体细胞中的扩增和表达能力。
理想载体的基本条件：
可转移性
合适的复制位点
多克隆位点：
广泛、特异
选择标志，便于筛选和鉴定
分子较小，可容纳较大的外源DNA
种类：
质粒（plasmid）
噬菌体（phagemids）:
λ噬菌体、M13噬菌体
穿梭质粒（Shuttlevectpr）
柯斯质粒（Cosmidvector）
3、限制性内切酶酶切
限制性内切酶（restrictionendonuclease）是存在于微生物细胞内、用于分解外源DNA的一种酶。
它能识别特定的脱氧核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子。
限制性内切酶的特点：
特异性。
每一种酶都有其各自的识别序列的作用位点
常用限制性内切酶
3、目的基因与载体的连接
DNA连接酶催化两条双链DNA片段相邻的5’-磷酸和3’-羟基间形成磷酸二酯键。
在分子克隆中最有用的的DNA连接酶是来自Ｔ４噬菌体的DNA连接酶。
T4DNA连接酶在分子克隆中主要用于：
１、连接具有同源互补粘性末端的ＤＮＡ片段；
２、连接双链DNA分子间的平端；
３、在双链平端的DNA分子上添加合成的人工接头或适配子。
4、重组体的转化或转染（transformationandtransfection）
转化:
指以细菌质粒为载体，将外源基因导入受体细胞的过程。
转化时，细菌必须经过适当的处理使之处于感受态－即容易接受外源DNA的状态，然后利用短暂热休克使DNA导入细菌宿主中。
转化方法：
CaCl2诱导转化
电穿孔
PEG介导转化
人工体外包装
5、重组体克隆的筛选与鉴定
基因克隆的最后一步是从转化细菌菌落中筛选出含有阳性重组子的菌落，并鉴定重组子的正确性
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