苯酚氯仿法从小鼠尾巴中抽提基因组DNAWord文档格式.docx

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⑸轻轻吸取上清至一新的1.5mlEP管中（宁可少吸，也不要吸到下层的苯酚或沉淀物）。

⑹向上清中加入等体积苯酚/氯仿，用力摇晃2分钟；

12000g，离心2分钟。

⑺吸取上清至另一新的1.5mlEP管中，加入1/10体积的醋酸钠溶液和2.5倍体积的无水乙醇，摇匀。

⑻12000g，离心1分钟，尽可能吸除上层乙醇。

⑼加入1ml，70%乙醇漂洗DNA，用力摇匀。

（此步为了去除残留的SDS和苯酚）

⑽12000g，离心1分钟，去除乙醇，再重复⑼、⑽一次（为了尽可能把DNA清洗干净）。

⑾将EP管倒置在吸水纸上，以吸干乙醇。

⑿用65℃预热的无菌ddH2O,35ul溶解DNA，-20℃保存。

⒀分光光度计检测纯度、浓度。

DNA提取的注意事项

1、裂解液要预热,以抑制DNase,加速蛋白变性,促进DNA溶解。

2、酚一定要碱平衡。

苯酚具有高度腐蚀性，飞溅到皮肤、粘膜和眼睛会造成损伤，因此应注意防护。

氯仿易燃、易爆、易挥发，具有神经毒作用，操作时应注意防护。

3、各操作步骤要轻柔,尽量减少DNA的人为降解。

4、取各上清时,不应贪多,以防非核酸类成分干扰。

5、异丙醇,乙醇.NaAc,KAc等要预冷,以减少DNA的降解,促进DNA与蛋白等的分相及DNA沉淀。

6、提取DNA过程中所用到的试剂和器材要通过高压烤干等办法进行无核酸酶化处理。

7、所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制。

8、用大口滴管或吸头操作，以尽量减少打断DNA的可能性。

9、要用新鲜样品或液氮冷冻-70度保存的样品。

这样通过降低内切酶的活性DNA的降解。

10、避免剧烈吸打DNA，不能搅动基因组DNA。

11、吸取基因组DNA时，要用专用的粗口吸头，普通吸头可能会切断DNA或造成DNA缺口。

12、基因组应4度保存，如-20度保存可能导致DNA断裂。

13、在准备实验的过程中，应将DNA样品放在碎冰上。

14、用Tris缓冲液溶解DNA。

15、加缓冲液后，为了加速DNA溶解，可以轻轻晃动或轻弹试管。

16、加入缓冲液后，置于4度过夜，也可以溶解DNA

17、将DNA溶液65度温育10分钟，可以灭活DNase。

18、在抽提过程中如果水相和有机层的界面不太清楚，说明其中蛋白质含量较高，可增加酚/氯仿抽提的次数或适当延长离心的时间。

19、酚抽提时如果上清液太粘稠，无法进行水相转移时，可加入适量TES稀释后再抽提。

基因组DNA提取方法

　　制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。

在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。

主要是CTAB方法，其他的方法还有1物理方式:

玻璃珠法,超声波法,研磨法,冻融法。

2化学方式：

异硫氰酸胍法,碱裂解法3生物方式:

酶法。

根据核酸分离纯化方式的不同有:

硅质材料、阴离子交换树脂等

试验步骤：

1、贴壁细胞用胰酶消化，离心收集。

2、细胞重悬于冰冷的PBS漂洗一次，离心收集。

试验步骤2再重新作一边。

3、加入5mlDNA提取缓冲液，（10mmol/LTris-cl,0.1mol/LEDTA,o.5%SDS）,混匀。

4、加入25ul蛋白酶K,使终浓度达到100ug/ml,混匀，50℃水浴3h,

5、用等体积的酚抽提一次，2500rpm离心收集水相，用等体积的（酚，氯仿，异戊醇）混合物抽提一次，2500r/min离心收集水相

6、用等体积的氯仿，异戊醇抽提一次。

加入等体积的5mol/L的LiCL,混匀，冰浴，10min.。

7、2500rpm离心10min.转上清于一离心管中。

加入等体积的异丙醇。

室温10min。

2500rpm,离心10min。

弃上清。

8、加入0.1倍体积3mol/L乙酸钠（PH5.2）与2倍体积-20℃预冷无水乙醇。

-20℃20min。

9、12000r/min,室温离心5min。

将DNA溶于适量TE中。

外周血DNA提取技术

分离外周血白细胞提取方法：

1、取人肘静脉血5ml，EDTA抗凝，2500rpm离心10min。

2、小心吸取上层血浆，分装到3个0.5ml离心管中。

3、在血细胞中加入3倍体积的溶血液，摇匀，冰浴15min。

4、2500rpm离心10min，弃上清。

5、加入10ml溶血液，摇匀，冰浴15min。

6、3000rpm离心10min，弃上清。

7、倒置离心管，去掉残液。

8、得白细胞，－80?

C冻存。

试验要求：

血至分离白细胞之间隔时间在室温下放置不超过2h，4℃放置不超过5h，以防白细胞自溶。

氯仿法抽提外周血白细胞基因组DNA：

试验试剂：

Ligsisbuffer：

133mMNH4ClNHCl7.12g0.9mMNH4HCO3NH4HCO30.071g0.1mMEDTA0.5mMEDTA0.2ml；

最后加灭菌去离子水至1000ml，高压灭菌。

ACD抗凝剂：

柠檬酸1.68g柠檬酸钠4.62g葡萄糖5.15g；

最后加灭菌去离子水至350ml，高压灭菌。

提取缓冲液（Extractionbuffer）：

10mMTrisCl（PH=8.0）1MTris.Cl（PH=8.0）1ml0.1mMEDTA（PH=8.0）0.5mMEDTA（PH=8.0）20ml0.5%SDS10%SDS0.5ml；

最后加灭菌去离子水至100ml，高压灭菌

1、在500μl抗凝血中加入ligsisbuffer1000μl，充分颠混至清亮。

以4000rpm，离心5min。

弃上清液。

2、沉淀中加入ligsisbuffer1500μl，充分匀浆。

以6000rpm，离心5min。

3、彻底弃去上清，加入extractionbuffer500μl（裂解细胞），混匀置于37℃，水溶1h。

4、加入8μl的蛋白酶K，颠混，37℃过夜（或55℃，3h，但是37℃效果要好些）。

5、每管加入450μl饱和酚（取溶液下层）缓慢摇晃10min，以5500rpm，离心15min。

6、取上清，每管加入250μl饱和酚和250μl氯仿－异戊醇，摇匀10min，以5500rpm，离心15min。

7、取上清，每管加入500μl氯仿－异戊醇，摇匀10min，以5500rpm，离心15min。

8、取上清，每管加50μl的3M的NaAC＋，适量无水乙醇（预冷）至满，摇匀放入-20℃保存2h以上。

9、以12000rpm，离心20min。

去上清，加入70％乙醇500μl，以12000rpm，离心5min，去上清，50－60℃干燥。

10、加入50μl灭菌去离子水，转弹，混匀。

NaI提取法提取外周血白细胞基因组：

实验步骤：

1、取外周抗凝血（全血）100ul于eppendorf管中，12000rpm离心12min。

2、弃上清，加双蒸水200ul溶解，摇匀20s。

3、混匀后加6MNaI溶液200ul，摇匀20s。

4、加入氯仿/异戊醇（24：

1）400ul，边加边摇，摇匀20s，12000rpm离心12min。

5、取上层液350ul，加入另一新eppendorf管中，加0.6倍体积异丙醇，摇匀20s，室温放置15min，静置后的反应体系15000rpm离心12min，使沉淀紧贴eppendorf管壁。

6、弃异丙醇，加70％乙醇1ml（不振动），以15000rpm离心12min。

7、弃乙醇，敞开eppendorf管盖，烘干（37℃恒温箱）后，加1xTE溶液30ul，溶解DNA＞12h以上，制成的DNA液-20℃冰箱保存备用。

常用的外周血白细胞基因提取方法：

试验原理：

　　苯酚/氯仿提取DNA是利用酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质变性，SDS（十二烷基磺酸钠）将细胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子，核蛋白变性降解，使DNA从核蛋白中游离出来。

DNA易溶于水，不溶于有机溶剂。

蛋白质分子表面带有亲水基团，也容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。

当有机溶液存在时，蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀。

离心后有机溶剂在试管底层（有机相），DNA存在于上层水相中，蛋白质则沉淀于两相之间。

酚-氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白质。

氯仿的作用是有助于水相与有机相分离和除去DNA溶液中的酚。

抽提后的DNA溶液用2倍体积的无水乙醇在1/103mol/LNaCl存在下沉淀DNA，回收DNA用70%乙醇洗去DNA沉淀中的盐，真空干燥，用TE缓冲液溶解DNA备用。

1、将1mlEDTA抗凝贮冻血液于室温解冻后移入5ml离心管中，加入1ml磷酸缓冲盐溶液（PBS），混匀，3500rpm离心15min,倾去含裂解红细胞的上清。

重复一次。

用0.7mlDNA提取液混悬白细胞沉淀，37℃水浴温育1h。

2、将上述DNA提取液混悬白细胞，37℃水浴温育1h后，加入1mg/ml蛋白酶K0.2ml,至终浓度为100-200ug/ml,上下转动混匀，液体变粘稠。

50℃水浴保温3h，裂解细胞，消化蛋白。

保温过程中，应不时上下转动几次，混匀反应液。

3、反应液冷却至室温后，加入等体积的饱和酚溶液，温和地上下转动离心管5-10min，直至水相与酚相混匀成乳状液。

5000rpm离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。

重复酚抽提一次。

加等体积的氯仿﹕异戊醇（24﹕1），上下转动混匀，5000rpm离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。

4、加入1/5体积的3mol/LNaAc及2倍体积的预冷的无水乙醇，室温下慢慢摇动离心管，即有乳白色云絮状DNA出现。

用玻璃棒小心挑取云絮状的DNA，转入另一1.5ml离心管中，加70%乙醇0.2ml，以5000rpm离心5min。

洗涤DNA，弃上清，去除残留的盐。

室温挥发残留的乙醇，但不要让DNA完全干燥。

加TE液20ul溶解DNA,置于摇床平台缓慢摇动，DNA完全溶解通常需12-24h。

制成的DNA液-20℃冰箱保存备用。

真核细胞DNA的制备

　　一般真核细胞基因组DNA有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。

这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。

　　根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的DNA提取方法大体类似，但都应考虑以下两个原则：

1、防止和抑制DNase对DNA的降解。

2、尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。

试剂准备：

1、TE:

10mMTris-HCl（pH7.8）;

1mMEDTA（pH8.0）。

2、TBS:

25mMTris-HCl（pH7.4）;

200mMNaCl;

5mMKCl。

3、裂解缓冲液：

250mMSDS;

使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。

4、20%SDS

5、2mg/ml蛋白酶K

6、Tris饱和酚（pH8.0）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿

7、无水乙醇、75%乙醇

材料处理：

1、新鲜或冰冻组织处理：

1）取组织块0.3-0.5cm3,剪碎，加TE0.5ml，转移到匀浆器中匀浆。

2）将匀浆液转移到1.5ml离心管中。

3）加20%SDS25ml，蛋白酶K（2mg/ml）25ml，混匀。

4）60°

C水浴1-3hr。

2、培养细胞处理：

1）将培养细胞悬浮后，用TBS洗涤一次。

2）离心4000g×

5min，去除上清液。

3）加10倍体积的裂解缓冲液。

4）50-55°

C水浴1-2hr。

DNA提取：

1、加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和、充分混匀3min。

2、离心5000g×

10min，取上层水相到另一1.5ml离心管中。

3、加等体积饱和酚，混匀，离心5000g×

10min，取上层水相到另一管中。

4、加等体积酚/氯仿，轻轻混匀，离心5000g×

如水相仍不澄清，可重复此步骤数次。

5、加等体积氯仿，轻轻混匀，离心5000g×

6、加1/10体积的3M醋酸钠（pH5.2）和2.5倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀。

7、待絮状物出现后，离心5000g×

5min，弃上清液。

8、沉淀用75%乙醇洗涤，离心5000g×

3min，弃上清液。

9、室温下挥发乙醇，待沉淀将近透明后加50-100mlTE溶解过夜。

植物组织中DNA的提取

　　脱氧核糖核酸（deoxribonucleicacid，DNA）是一切生物细胞的重要组成成分，主要存在于细胞核中，盐溶法是提取DNA的常规技术之一。

从细胞中分离得到的DNA是与蛋白质结合的DNA，其中还含有大量RNA，即核糖核蛋白。

如何有效地将这两种核蛋白分开是技术的关键。

DNA不溶于0.14mol/L的NaCl溶液中，而RNA则能溶于0.14mol/L的NaCl溶液之中，利用这一性质就可以将二者从破碎细胞浆液中分开。

制备过程中，细胞破碎的同时就有Dnase释放到提取液中，使DNA因被降解而影响得率，在提取缓冲液中加入适量的柠檬酸盐和EDTA，既可抑制酶的活性又可使蛋白质变性而与核酸分离，再加入阴离子去垢剂0.15％的SDS，经过2h搅拌，或用氯仿－异醇除去蛋白，通过离心使蛋白质沉淀而除去，得到的是含有核酸的上清液。

然后用95％的预冷乙醇即可把DNA从除去蛋白质的提取液中沉淀出来。

植物DNA的SDS提取法：

1、研磨缓冲液：

称取59.63gNaCl，13.25g柠檬酸三钠，37.2gEDTA－Na分别溶解后合并为一，用0.2mol/L的NaOH调至pH7.0，并定容至1000ml。

2、10×

SSC溶液：

称取87.66gNaCl和44.12g柠檬酸三钠，分别溶解，一起定容至1000ml。

3、1×

用10×

SSC溶液稀释10倍。

4、0.1×

用1×

5、Rnase溶液：

用0.14mol/LNaCl溶液配制成25mg/ml的酶液，用1mol/LHCl，pH至5.0，使用前经80℃水浴处理5min（以破坏可能存在的Dnase）。

6、氯仿－异戊醇：

按24ml氯仿和1ml异戊醇混合。

7、5mol/L高氯酸钠溶液：

称取NaClO4．H2O70.23g，先加入少量蒸馏水溶解再容至100ml。

8、SDS（十二烷基硫酸钠）化学试剂的重结晶：

将SDS放入无水酒精中达到饱和为止，然后在70～80℃的水浴中溶解，趁热过滤，冷却之后即将滤液放入冰箱，待结晶出现再置室温下凉干待用。

9、1mol／LHCl。

10、0.2mol/LNaOH。

11、二苯胺乙醛试剂：

1.5g二苯胺溶于100ml冰醋酸中，添加1.5ml浓硫酸，装入棕色瓶，贮存暗处，使用时加0.1ml乙醛液［浓乙醛：

H2O＝1：

50（V／V）］。

12、1.0mol/L高酸溶液（HClO4）。

13、0.05mol/LNaOH。

14、DNA标准液：

取标准DNA25mg溶于少量0.05mol.L-1NaOH中，再用0.05mol/LNaOH定容至25ml，后用移溶管吸取此液5ml至50ml容量瓶中，加5.0ml1mol/LHClO4，混合冷却后用0.5mol/LHClO4定容至刻度，则得100μg/ml的标准溶液。

1、称取植物幼嫩组织10g剪碎置研钵中，加10ml预冷研磨缓冲液并加入0.1g左右的SDS，置冰浴上研磨成糊状。

2、将匀浆无损转入25ml刻度试管中加入等体积的氯仿－异戊醇混合液，加上塞子，剧烈振荡30s，转入离心管，静置片刻以脱除组织蛋白质。

以4000rpm离心5min。

3、离心形成三层，小心地吸取上层清液至刻度试管中，弃去中间层的细胞碎片、变性蛋白质及下层的氯仿。

4、将试管置72℃水浴中保温3min（不超过4min），以灭活组织的DNA酶，然后迅速取出试管置冰水浴中冷却到室温，加5mol/L高氯酸钠溶液［提取液：

高氯酸钠溶液＝4：

1（V／V）］，使溶液中高氯酸钠的最终浓度为1mol/L。

5、再次加入等体积氯仿－异戊醇混合液至大试管中，振荡1min，静置后在室温下离心（4000rpm）5min，取上清液置小烧杯中。

6、用滴管吸95％的预冷乙醇，慢慢地加入烧杯中上清液的表面上，直至乙醇的体积为上清液的两倍，用玻璃棒轻轻搅动。

此时核酸迅速以纤维状沉淀缠绕在玻璃棒上。

7、然后加入0.5ml左右的10×

SSC，使最终浓度为1×

SSC。

8、重复第6步骤和第7步骤即得到DNA的粗制品。

9、加入已处理的Rnase溶液，使其最后的作用浓度为50～70μg/ml，并在37℃水浴中保温30min，以除去RNA。

10、加入等体积的氯仿－异戊醇混合液，在三角瓶中振荡1min，再除去残留蛋白质及所加Rnase蛋白，室温下以4000rpm离心5min，收集上层水溶液。

11、再按6、7步骤处理即可得到纯化的DNA液。

植物DNA的CTAB提取法：

1、称取新鲜叶片2-3g，剪碎放入研钵中，在液氮中研磨成粉末。

2、将粉末转移到加有7ml经预热的15×

CTAB提取缓冲液15ml离心管中，迅速混匀后置于65℃水浴中，温育30min。

3、取出离心管,冷却至室温，加入氯仿/异戊醇（24:

1），充分混匀，室温下2300转离心20min。

4、将上清转移至另一新的15ml离心管中，加入1/10体积10%的CTAB和等体积的氯仿/异戊醇。

充分混匀，2300rpm离心20min。

5、转移上清至另一新的15ml离心管中，加入等体积1%的CTAB沉淀缓冲液，轻轻摇晃至形成DNA絮状沉淀。

1000rpm离心10min，使DNA沉淀于管底。

6、加入1.5-2ml的1mol/LNaCl及5μlRNase置于56℃水浴中过夜。

7、待DNA完全溶解后，加2-3ml4℃预冷的95%的冰乙醇使DNA沉淀，挑出DNA，置于15ml离心管中，用70%乙醇清洗30min。

8、离心机甩5s，倒出70%乙醇，再用95%乙醇浸泡5min，倒出95%乙醇，在超净工作台上吹干。

9、将风干的DNA直接在4℃保存备用或溶于100μlTE溶液中于-20℃保存。

细菌DNA的提取方法

针对一些不易于提取的细菌的方法:

抽提缓冲液：

2%CTAB（W/V）2%PVPK25（w/v）（去色素）100mMTris-HCl（pH8.0）

25mMEDTA（pH8.0）2.0MNaCl

10MLiCl

2MLiCl

DEPC-water（抑制RNA酶活性）

3MNaAc（pH5.2）

96%乙醇

70%乙醇

1、抽提缓冲液65℃预热。

2、加菌体到已经预热的缓冲液（700ul）中混匀，65℃，10min。

3、加酚/氯仿/异戊醇（25：

24：

1），振荡，以12,000rpm，离心10min。

4、取上清，加氯仿/异戊醇（24：

1）振荡，以12,000rpm，离心10min。

5、重复再作一次步骤4。

6、加入1/10体积的3M醋酸钠和1.5倍体积的乙醇（或加入等体积的异丙醇），－20C下沉淀。

7、以2,000rpm，离心10min。

8、弃上清，以70％乙醇条洗沉淀，也可以再用100％乙醇洗，然后溶解于100ml水中。

较为常用的细菌DNA提取方法：

1、将菌株接种于液体LB培养基，37℃震荡培养过夜。

2、取1.5ml培养物12000rpm离心2min。

3、沉淀中加入567ul的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入30ul10%SDS和15ul的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h.

4、加入100ul5mol/LNaCl,充分混匀，再加入80ulCTAB/NaCl溶液，混匀后再65℃温育10min。

5、加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4-5min,将上清转入一只新管中，加入0.6-0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，沉淀可稍加离心。

6、沉淀用1ml的70%乙醇洗涤后，离心弃乙醇．

真菌DNA提取总结的两种方法：

第一种方法：

1、取真菌菌丝0.5g,在液氮中迅速研磨成粉。

2、加入4mL提取液，快速振荡混匀。

3、加入等体积的4mL的氯仿:

异戊醇（24:

1），涡旋3～5min（此处是粗提没有加酚）。

4、以4℃，1000rpm，离心5min。

5、上清再用等体积的氯仿:

1）抽提一次。

以4℃，10,000rpm，离心5min。

6、取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷的异丙醇或2.5倍体积的无水乙醇沉淀,混匀,静置约30min。

7、用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干，重悬于500ulTE中。

8、加入1ulRNaseA（10mg/mL），37℃下处理1h。

9、用酚（pH8.0）:

氯仿:

异戊醇（25:

24:

1）和氯仿:

1）各抽提1次。

10、取上清，加入1/10倍体积的3MNaAc,2.5倍体积的无水乙醇,-70℃沉淀30min以上。

11、沉淀用75%乙醇漂洗，风干,溶于200ulTE中，-20℃保存备用。

DNA提取液：

0.2MTris-HCl（pH7.5），0.5MNaCl，0.01MEDTA，1％SDS，3MNaAc。

第二种方法：

1、真菌菌丝0.5-1g,在液氮中迅速研磨成粉。

2、加入3mL65℃预热的DNA提取缓冲液，快速振荡混匀65℃水浴30min,期间混匀2-3次。

3、加入1mL5MKAc，冰浴20min。

4、等体积的氯仿:

1）抽提1次（10,000rpm，4℃离心5min）。

5、取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇,混匀,静置约30min。

6、用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇反复漂