第5章+细胞培养++讲义Word格式文档下载.docx

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上述人员就没能从所试验过的大多数其他植物的叶片中分离出活细胞。

现在广泛用于分离叶肉细胞的方法是先把叶片轻轻研碎，然后再通过过滤和离心把细胞净化。

具体做法是：

在研钵中放人10g叶片和40ml研磨介质（20μmol蔗糖，10μmolMgCl2，20μmoltris-HCl缓冲液，pH值7.8），用研杆轻轻研磨。

之后，将匀浆用两层细纱布过滤，在研磨介质中以低速离心将得到的细胞净化。

除了双子叶植物外，很多单子叶植物（其中可能包括禾本科植物，但尚未证明）也能通过这个方法产生完整的叶肉细胞。

应用类似方法后人由马唐中分离出具有代谢活性的叶肉细胞和维管束鞘细胞，由菠菜中分离出叶肉细胞，由篱天剑、石刁柏等叶片中分离大量游离薄壁细胞，由大豆子叶分离出了活细胞。

和酶解法相比，用机械法分离细胞至少有两个明显的优点：

①细胞不受酶的伤害；

②不会发生质壁分离。

这点对生理和生化研究来说是很理想的。

一般用机械法分离的细胞能够发生分裂并形成愈伤组织。

但这种机械分离细胞的方法并不普遍适用，只有在薄壁组织排列松散，细胞间接触点很少时，用机械法分离叶肉细胞才能取得成功。

1.1.2酶解法

利用果胶酶（pectase）处理植物叶片，使细胞间的中胶层发生降解，分离出具有代谢活性的细胞。

Takebe等（1968）最早报道了由烟草叶片通过果胶酶处理分离叶肉细胞的方法（p98～99，附录6.2）：

首先取烟草植株上充分展开的叶片进行表面消毒，无菌蒸馏水冲洗干净，用镊子撕去下表皮，用解剖刀将撕去下表皮的叶片切成4cm×

4cm的小块，放人经过过滤灭菌的酶液（含果胶酶0.5％+甘露醇0.8％+硫酸葡聚糖钾1％）中，用真空泵抽气，使酶液渗入叶肉组织内。

在摇床上保温培养，每30min更换一次酶液，将第一次30min后换出的酶液弃掉，第二次30min后，酶液中主要分离出海绵薄壁细胞，第三和第四次以后主要分离出栅栏细胞。

Takebe等（1968）证明，在离析混合液中加入硫酸葡聚糖钾可作为原生质膜的稳定剂，降低酶液中核糖核酸酶的活力，保持质膜稳定性，提高游离细胞的产量。

用于分离细胞的果胶酶不仅能降解中胶层，而且还能软化细胞壁。

因此，用酶解法分离细胞时，必须对酶溶液给予渗透压保护，防止细胞的胀裂。

如果所用的甘露醇的浓度低于0.3mol／L，烟草原生质体将会在细胞壁内崩解。

酶解法分离细胞能得到较均匀一致的海绵组织细胞或栅栏组织细胞。

但在有些物种中，特别是大麦、小麦、玉米等单子叶植物中，很难通过酶解法使细胞分离，因为与双子叶植物相比，这些植物的叶肉细胞较长，并在若干地方发生收缩，细胞间可能形成一种互锁结构，阻止细胞的分离。

1.2由培养组织中分离单细胞

用于基础研究和应用研究的单细胞系统，在传统上常常是由离体培养的组织分离得到的，因为这个途径不但方便，而且广泛适用。

只要把由经过表面消毒的器官上刚刚切取下来的一小块组织，置于含有适当比例的生长素和细胞分裂素的培养基上，即可建立起组织培养物。

在这样一种培养基上，外植体愈伤组织化。

这个过程一般是由切口开始，逐渐扩展到接种组织的整个表面。

把愈伤组织由外植体上剥离，转移到成分相同的新鲜培养基上，促使愈伤组织生长，这个过程称做继代培养（subculture）。

通过反复地在琼脂培养基上继代，不但可使愈伤组织不断增殖，扩大数量，而且还能提高愈伤组织的松散性，这对于在液体培养基中建立充分分散的细胞悬浮培养物是非常必要的。

然而Wilson和Street（1975）观察到，当把新切取下来的橡胶树愈伤组织转移到液体培养基中并加以搅动时，愈伤组织只能破碎成小块，想由此建立高度分散的细胞悬浮液的努力全部归于失败。

于是他们又把在液体培养基中生长的愈伤组织块转回到琼脂培养基上。

两个月后形成了很易散碎的愈伤组织，当把这些愈伤组织再转移到液体培养基中以后，产生了很好的悬浮液。

由愈伤组织获得游离细胞的具体做法是，把未分化的和易散碎的愈伤组织约2g转移到装有30～50m1液体培养基的三角瓶中，在25℃±

1℃，弱光或黑暗中，将三角瓶置于摇床上不断振荡（120r／min）。

初期每10d左右用新鲜培养液更换掉三角瓶中大约4／5的旧液，同时将飘浮在原培养液上层的细胞碎片和长弯形衰败细胞淘汰。

几个周期之后，培养液由浊变清，开始出现胞质浓密的单细胞和小细胞团。

此后不断进行继代培养，直至建成良好的悬浮培养物。

在这里振荡至少有两种作用。

首先，它可对细胞团施加一种缓和的压力，使它们破碎成小细胞团和单细胞；

其次，振荡可以使细胞和小细胞团在培养基中保持均匀的分布。

此外，培养基的运动还会促进培养基和容器内空气之间的气体交换。

2细胞悬浮培养

2.1细胞悬浮培养的概念及优点

悬浮培养（suspensionculture）是指将游离的植物细胞按一定的细胞密度，悬浮在液体培养基中进行培养的方法。

植物细胞的悬浮培养是从愈伤组织的液体培养基础上发展起来的。

自20世纪50年代以来，从试管的悬浮培养发展到大容量的发酵罐培养，从不连续培养发展到半连续和连续培养。

80年代以来，植物细胞培养作为生物技术的一个组成部分，正在发展成为一门新兴的科技产业体系。

悬浮细胞培养的主要优点是：

能大量提供比较均匀一致的细胞，也就是同步分离的细胞；

细胞增殖的速度比愈伤组织快；

适宜大规模培养，成为细胞工程中独特的产业。

2.2细胞悬浮培养的类型

2.2.1分批培养

分批培养（batchculture）是指把细胞分散在一定容积的培养基中进行培养，当培养物增殖到一定量时，转接继代，建立起单细胞培养物。

在培养过程中除了气体和挥发性代谢产物可以同外界环境交换外，一切都是密闭的。

当培养基中的主要成分耗尽时，细胞停止分裂和生长。

分批培养所用的容器一般是100～250ml三角瓶，每瓶装20～75ml培养基。

为了使分批培养的细胞不断增殖，必须及时进行继代。

继代的方法可以是取出培养瓶中一小部分悬浮液，转接到成分相同的新鲜培养基中（约稀释5倍）。

也可以用纱布或不锈钢网进行过滤，滤液接种，这样可提高下一代培养物中单细胞的比例。

培养用的液体培养基虽因物种而异，但凡适合愈伤组织生长的培养基，除去琼脂，均可作为悬浮细胞培养基。

在分批培养中，细胞数目会发生不断变化，呈现出细胞生长周期。

在整个生长周期中，细胞数目增加的变化过程大致呈“S”形（图5-1）。

图5-1在分批培养中每单位容积悬浮培养液内的细胞数

与培养时间关系的示意图（引自wilson等，1971）

初期增长慢，称延滞期（lagphase），特点是细胞很少分裂，细胞数目不增加；

中期生长快，称对数增长期（logarithmicphase），特点是细胞分裂活跃，数目迅速增加；

到了细胞增殖最快的时期，单位时间内细胞数目增长大致恒定，细胞数目达到最高峰，称为直线生长期（linearphase）；

随后由于培养基中某些营养物耗尽，或是有毒代谢物的积累，细胞增长逐渐变慢进入缓慢期（retardphase）；

最后生长趋于完全停止，进入静止期（stationaryphase）。

滞后期的长短主要取决于在继代时原种培养细胞所处的生长期和转入细胞数量的多少。

当转入的细胞数量较少时，不但滞后期较长，而且在一个培养周期中细胞增殖的数量也少。

如果转入的细胞密度很低，则在加入培养单细胞或小群体细胞所必需的营养物质之前，细胞将不能生长。

另外，如果缩短两次继代的时间间隔，例如，每2～3d即继代一次，则可使悬浮培养的细胞一直保持对数生长。

如果使处在静止期的细胞悬浮液保存时间太长，则会引起细胞的大量死亡和解体。

因此，当细胞悬浮液达到最大干重产量之后，即在刚进入静止期的时候，须尽快进行继代。

在分批培养中，细胞繁殖一代所需的最短时间，即在对数生长期中细胞数目加倍所需的时间因不同植物而异，烟草为48h，蔷薇36h，菜豆24h。

一般讲，这些时间都长于在整体植株上分生组织中细胞数目加倍所需的时间。

在对悬浮培养细胞进行继代时可使用吸管或注射器，但其进液口的孔径必须小到只能通过单细胞和小细胞团（2～4个细胞），而不能通过大的细胞聚集体。

继代前应先使三角瓶静置数秒，以便让大的细胞团沉降下去，然后再由上层吸取悬浮液。

如果每次继代都依这个办法操作，就有可能建立起理想的细胞悬浮培养物。

分批培养对于研究细胞的生长代谢并不是一种理想的培养方式。

在分批培养中，由于细胞生长和代谢的方式以及培养基成分不断改变，没有一个稳定的生长期，相对于细胞的数目，代谢产物和酶的浓度也不能保持恒定。

这些问题在某种程度上可通过连续培养加以解决。

2.2.2半连续培养

半连续培养是利用培养罐进行细胞大量培养的一种方式。

在半连续培养中，当培养罐内细胞数目增殖到一定量后，倒出一半细胞悬浮液于另一个培养罐内，再分别加入新鲜培养基继续进行培养，如此这样频繁地进行再培养。

半连续培养能够重复获得大量均匀一致的培养细胞供生化研究之用。

2.2.3连续培养

连续培养（continuousculture）是利用特制的培养容器进行大规模细胞培养的一种方式。

连续培养的特点是：

在连续培养中由于不断注入新鲜培养基，排掉旧的培养基，保证养分的充足供应，不会出现悬浮培养物发生营养亏缺的现象。

连续培养可在培养期间内使细胞长久地保持在对数生长期中，细胞增殖速度快。

连续培养适于大规模工厂化生产。

连续培养有封闭型和开放型之分。

（1）封闭型连续培养

封闭型连续培养是指在培养过程中，排出的旧培养基由加入的新鲜培养基进行补充，进出数量保持平衡，从而使培养系统中营养物质的含量总是超过细胞生长的需要。

悬浮在排出液中的细胞经机械方法收集后再放回到培养系统中，因此在这种培养方式中，随培养时间延长，细胞密度会不断增加。

（2）开放型连续培养

在开放连续培养中，注入的新鲜培养液的容积与流出的培养液容积相等，其中细胞的密度也保持恒定，并通过调节流入和流出的速度，使培养细胞的生长速度一直保持在一个稳定状态，流出的细胞数相当于培养系统中新细胞的增加数。

开放型培养又可分为两种主要方式：

一是化学恒定式；

二是浊度恒定式。

①浊度恒定式。

在浊度恒定培养中，新鲜培养基是间断注入的，受细胞密度增长所引起的培养液浑浊度增加的控制。

可以选定一种细胞密度，当超过这个细胞密度时，使细胞随着培养液一起排出，以保持细胞密度的恒定。

②化学恒定式。

在化学恒定式培养中，为使细胞密度保持恒定状态，可采用两种方法。

一种是以固定速度注入新鲜培养基，将培养基内的某种营养成分（如氮、磷或葡萄糖）的浓度调节成为一种生长限制浓度，从而使细胞的增殖保持稳定状态。

在这种培养基中，除生长限制成分以外的其他成分的浓度都保持在细胞生长所需要的水平上，而生长限制因子被调节在一定水平上，它的任何增减都可由细胞增长速度的增减反映出来。

二是控制培养液进入的速度，使细胞稀释的速度正好和细胞增殖的速度相同，因此培养液中细胞密度一直保持恒定状态。

化学恒定式的最大特点是通过限制营养物质的浓度来控制细胞的增长速度。

此方法在大规模细胞培养的工业上有巨大的应用潜力。

连续培养是植物细胞培养技术中的一个重要进展，这种培养技术对于植物细胞代谢调节的研究、各个生长限制因子对细胞生长的影响以及对次生物质的大量生产等都有重要的意义。

由悬浮细胞可以再生植株，其再生植株通常有2条途径：

一是由悬浮细胞直接形成体细胞胚；

二是先将悬浮细胞在半固体培养基上诱导形成愈伤组织，然后再由愈伤组织分化植株。

2.3细胞悬浮培养的培养基

要获得高质量的悬浮培养物，最初使用疏松的愈伤组织十分重要。

由于愈伤组织质地是遗传控制的，所以要获得细胞分散良好的悬浮培养物常常不是一件轻而易举的事情。

改变培养基成分和继代培养程序有助于获得松散的培养组织，在培养基中加入2,4-D、少量水解酶（纤维素酶和果胶酶）或酵母提取物之类的物质，也可能对细胞分散有促进作用。

有时，必须把小愈伤组织块或细胞团转回到琼脂固体或半固体培养基上。

经过2～3次继代培养后，愈伤组织块生长发育成疏松的愈伤组织，再将其转入液体培养基中，就能产生高质量的悬浮培养物了。

从理论上讲，能形成生长快、疏松愈伤组织的培养基一般来说也同样适用于建立该物种的悬浮培养，只是琼脂当然要从中去掉。

但是，在实际研究中，迅速生长的细胞悬浮液对培养基成分的需要不同于组织或愈伤组织培养。

如烟草细胞悬浮培养基需要将2,4-D的浓度从0.3mg／L提高到2mg／L，还要在愈伤组织培养基中添加额外的维生素和酪蛋白水解物（p83表6.1）。

此外，旺盛生长的悬浮培养物中，无机磷酸盐迅速地被利用，以致使无机磷酸盐成为了一个限制生长的因素。

因此，为了进行高等植物的细胞悬浮培养，特别设计了B5和ER两种培养基，但一般来说，这两种培养基，以及其他一些合成培养基，也只有当细胞的初始群体密度约为5×

104细胞／ml或更高时才是适用的。

当细胞密度较低时，在培养基中还须加入各种其他成分（见单细胞培养p92～93），或是使用条件培养基。

此外，许多培养基几乎没有缓冲能力，pH值可能随细胞生物产量的增加而改变。

需要监测和调整悬浮培养物中的pH值。

在启动低密度细胞培养时，有必要使用条件培养基。

所谓条件培养基是在培养基中加入高密度的细胞进行培养，一定时间后这些细胞就会向培养基中分泌一些物质，使培养基条件化。

制作条件培养基的简便方法是：

把液体培养基中培养了4～6周的高密度细胞滤掉，将其培养基制成液体培养基或固体培养基来培养单细胞或低密度细胞群体，这样可明显提高单细胞培养物存活和分裂的能力。

或是采用Torres（1989）设计的一种装置，其中把高密度细胞悬浮培养物（看护培养物）装在一个透析管内（图5－1），用线悬挂在三角瓶中，瓶内装有低密度细胞培养基。

看护培养物产生的代谢物扩散到低密度细胞培养基中以后，促进了低密度细胞的生长，并提高其细胞活性。

这样一来，由于在低密度细胞培养基中原先不存在的必需物质被看护细胞通过生物合成活动释放到其中，于是就可满足低密度细胞群体对生长条件的要求。

图5－2使低密度细胞培养基条件化的装置（引自Razdan，1993）

悬浮培养物需要持续振荡培养基，才能通气充足，促使细胞分散。

利用摇床和适当的三角瓶就可以进行振荡培养。

其中旋转式摇床在分批悬浮培养中是一种应用最广泛的设备。

以转速30～150r／min为宜（不要超过150r／min），冲程范围应在2～3cm。

转速过高或冲程过大会造成细胞的破裂。

此外还有慢速转床和自旋式培养架可用。

2.4悬浮培养细胞的同步化

细胞悬浮培养物中的细胞大小、形状、DNA和核酸含量变化极大。

此外，单个细胞内细胞周期时间变化也非常大。

为此，细胞培养物几乎完全是非同步的。

这种捉摸不定的变化严重地干扰了对细胞代谢的生物化学、遗传学、生理学及其他方面的研究。

因此，很有必要控制非同步生长的悬浮培养物的生长条件，达到悬浮培养物生长的高度同步化。

同步化培养是大多数细胞同时通过细胞周期每一阶段（G1、S、G2和M,细胞周期指由细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的过程，所需的时间叫细胞周期时间。

可分为四个阶段：

①G1期（gap1），指从有丝分裂完成到期DNA复制之前的间隙时间；

②S期（synthesisphase），指DNA复制的时期；

③G2期（gap2），指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时间；

④M期又称D期（mitosisordivision），细胞分裂开始到结束。

）的培养方法。

同步化程度以悬浮培养物中同步细胞的百分率来表示。

获得悬浮培养物同步化的方法可以分成2类，即物理方法和化学方法。

2.4.1物理方法

物理方法主要是通过对细胞物理特性（细胞或小细胞团的大小）或生长环境条件（光照、温度等）的控制，实现高度同步化，其中包括按细胞团的大小进行选择（以最优质的潜在悬浮培养物中细胞团大小为标准选择细胞团，有可能获得同步化生长的细胞）的方法和低温休克法等。

2.4.2化学方法

（1）饥饿法

在这种方法中，先对细胞断绝供应一种进行细胞分裂所必需的营养成分或激素，使细胞停滞在G1期或G2期，经过一段时间的饥饿之后，当重新在培养基中加入这种限制因子时，静止细胞就会同步进入分裂。

（2）抑制法

使用DNA合成抑制剂如5－氨基尿嘧啶、羟基脲和胸腺嘧啶脱氧核苷等，也可使培养细胞同步化。

当细胞受到这些化学药物的处理之后，细胞周期只能进行到G1期为止，细胞都滞留在G1期和S期的边界上。

当把这些抑制剂去掉之后，细胞即进入同步分裂。

应用这种方法取得的细胞同步性只限于一个细胞周期。

2.5悬浮培养中细胞生长的测定

2.5.1细胞计数

细胞计数测量法是一种相对比较精确的测量方法，用于测定培养物的生长。

由于在悬浮培养中总存在着大小不同的细胞团，因而通过由培养瓶中直接取样很难进行可靠的细胞计数，为提高细胞计数的准确性，可先用铬酸（5％～8％）或果胶酶（O.25％）对细胞和细胞团进行处理，以增加细胞的分散性。

最后用血球计数板进行细胞计数。

2.5.2细胞密实体积（packedcellvolume,PCV）

细胞密实体积是以每毫升培养液中细胞总体积的毫升数表示的。

为了确定细胞密实体积，须将一已知体积的均匀分散的悬浮液放入一个15ml刻度度离心管中，在2000g下离心5min，即可得到细胞沉实的体积。

2.5.3细胞鲜重

把悬浮培养物倒在下面架有漏斗的已知重量的湿尼龙丝网上，用水洗去培养基，真空抽滤以除去细胞上沾着的多余水分，再称重，即可求得细胞鲜重。

细胞的鲜重是以每毫升培养物细胞的重量表示的。

2.5.4细胞干重

用已知重量的干尼龙丝网依上法收集细胞，在60℃下干燥12h，再称重。

细胞的干重是以每毫升培养物或每106个细胞的重量表示的。

2.5.5细胞有丝分裂的指数

有丝分裂指数是指在一个细胞群体中，处于有丝分裂的细胞占细胞总数的百分数。

指数越高，表明细胞进行分裂的速度越快，反之则越慢。

有丝分裂指数只反映群体中每一个细胞用于分裂所需时间的平均值，在一个活跃分裂的悬浮培养物中，分裂指数可以反映细胞分裂的同步化程度。

一个迅速生长的细胞群体其有丝分裂指数为3％～5％。

测定有丝分裂指数的方法比较简单。

对于愈伤组织一般是采用孚尔根染色法，先将愈伤组织用lmol／LHCI在60℃水浴中水解后染色，然后在载玻片上按常规方法镜检，随机检查500个细胞，统计其中处于分裂期间和处于有丝分裂各个时期的细胞数目，计算出分裂指数。

悬浮培养的细胞先用固定液处理，然后将固定的悬浮液滴于载玻片上，染色并做镜检，至少统计500个细胞。

虽然有丝分裂指数的测定是研究细胞生长的有用技术，但它受许多因子的影响，如完成一个细胞周期所需的时间、有丝分裂持续的时间、非周期性和死细胞的百分数、细胞群体中同步化的程度等。

因此单独测定有丝分裂指数还不能精确反映某一培养物的细胞分裂的同步化程度。

2.6培养细胞活力的测定

培养物的生长在很大程度上依赖于细胞的活力，可以用显微镜观察未处理的细胞或经化学试剂处理的细胞，分析细胞的活力。

方法有以下几种：

2.6.1相差显微术法

在显微镜下，根据细胞质环流和正常细胞核的存在与否，即可鉴别出细胞的死活。

但在亮视野显微镜下很难观察到未染色细胞细胞的活力时，利用相差显微镜可以得到更明显的图像。

2.6.2四唑盐还原法（TTC法）

活细胞由于呼吸作用可产生还原力，可将2，3，5－氯化三苯基四氮唑（TTC）还原成红色染料，据此可测定细胞的呼吸效率，反映细胞的代谢强度。

一般可在显微镜下观察视野中被染色细胞的数目，计算出活细胞的百分率。

也可以将还原的TTC红色染料用乙酸乙酯提取出来，用分光光度计进行测定（520nm），计算细胞的相对活力。

2.6.3荧光素二乙酸酯法（FDA法）

用FDA法可以快速观察细胞的活力。

用丙酮制备0.5％的FDA贮备液，置于0℃下保存。

当进行细胞活力测定时，将FDA贮备液加入到细胞或原生质体悬浮液中，加入的数量以使最终浓度为0.01％为准。

为了保持细胞或原生质的稳定性，可适当加入一种渗透压稳定剂。

保温5min后，用一台带有适当的激发片和吸收片的荧光显微镜对细胞进行检查。

FDA既不发荧光也不具有极性，能自由地穿越细胞膜进入细胞内部。

在活细胞内FDA被酯酶分解，产生有荧光的极性物质—荧光素。

由于荧光素不能自由穿越细胞膜，因而就在活细胞中积累起来，而在死细胞中不能积累。

所以，在荧光显微镜下观察到产生荧光的细胞，表明是有活力的细胞；

相反不产生荧光的细胞，是无活力的细胞。

细胞活力以发绿色荧光的活细胞的百分数表示。

2.6.4伊凡蓝染色法

这种方法可用做FDA的互补法。

当以伊凡蓝的稀薄溶液（O.025％）对细胞进行处理时，只有活力已受损伤的细胞能够摄取这种染料，而完整的活细胞不能摄取这种染料。

因此，凡不染色的细胞皆为活细胞。

但染色时间不宜过长，否则活细胞也会逐渐积累染料而染上色。

细胞活力以未染色的活细胞数占总观察细胞数的百分数来表示。

3单细胞培养

单细胞培养就是对分离得到的单个细胞进行培养，诱导其分裂增殖，形成细胞团，再通过细胞分化形成芽、根等器官或胚状体，直至长成完整植株的技术。

由于培养中细胞在遗传和生理生化上会出现变异，形成的植株也就表现出一定的差异，这种差异又反映在它们的产量、品质、抗病虫和抗逆性等方面。

所以对由单细胞培养获得的单细胞无性繁殖系进行研究，在理论上和实践上都有很重要的意义。

3.1单细胞培养方法

单细胞培养方法有平板培养法、看护培养法、微室培养法和条件培养基培养法。

3.1.1平板培养法

平板培养法是将悬浮培养的细胞接种到未固化的薄层培养基中，使其与培养基充分混合，再倒人培养皿中进行培养的方法。

它是最常用的单细胞培养法。

具体做法是，先将含有游离细胞和细胞团的悬浮培养物过滤，弃去大的细胞团，只留下游离细胞和小细胞团。

进行细胞计数。

根据细胞的实际密度，或是加入液