胶乳偶联方案的输出Word格式.docx
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5、用相等体积的该缓冲溶液来洗涤胶乳微球，离心，用1倍体积的缓冲溶液重复处理；
6、将蛋白质溶解于50-100mM的MES缓冲溶液中，蛋白质浓度为1mg/mL；
7、再将胶乳微球悬浮于去离子水或结合的缓冲溶液中，迅速加入溶解的蛋白质，37℃搅拌反应3小时；
8、按1mL反应混合液加入2.5μL乙醇胺混合，搅拌反应10分钟；
9、除去未结合的蛋白质，贮藏与贮存的缓冲溶液中
方案三
生成NHS-酯的中间体二步法共价结合
1、每ml反应混合物加入下列各物：
a．去离子水是最后容积为1.0mL；
b．0.1mL的10x的贮备缓冲溶液，其pH值为6.0-6.5（一般可用0.5MMES缓冲溶液）；
胶乳微球最终浓度为1%（W/V）；
c．0.23mL的50mg/ml的NHS在去离子水中的溶液；
d．19.2mg/mL（100mM）的EDAC在去离子水中的溶液
2、在室温将此混合物反应15-30分钟，不断搅拌；
3、用MES缓冲液或纯化水洗涤胶乳微球悬浮物，除去未反应的NHS和EDAC；
4、重新将胶乳微球在去离子水中悬浮，使其浓度为1%（w/v）；
5、将结合的蛋白质溶于50-100mM的MES缓冲溶液中，浓度为1mg/mL；
6、立即加入蛋白质溶液（胶乳微球、蛋白质和缓冲溶液的浓度分别为0.5%（w/v）、0.5mg/mL、25-50mM）；
7、将混合物反应至少2小时，轻轻搅拌；
9、除去未结合的蛋白质和乙醇胺，贮于适宜的贮存缓冲溶液中。
附录
试剂：
MES缓冲液
500mM和50mM；
PH6.1；
4°
C储存（如果发黄或者污染，应倒掉）。
EDAC
盐酸1－乙基－3－二甲基氨基丙基二酰亚胺；
52umol/ml：
分析天平称取10mgEDAC，加入1ml去离子水。
（EDAC对潮气非常敏感，在水中快速水解，EDAC储存于干燥器中，-5°
C保存。
）
NHS
N－羟基琥珀酰亚胺；
50mg/ml水溶液
蛋白质溶液
蛋白质充分稀释溶解，浓度为1－10mg/ml
技术说明：
1．微球总表面积与其粒径成反比，抗体的具体用量需要根据使用微球的大小做相应改变；
单位质量的微球表面积（m2/g）：
A/M=6/PD
其中D=微球粒径（µ
m）
P=微球密度（聚苯乙烯1.05g/ml）
例如：
0.8µ
m的聚苯乙烯微球，A/M=6/1.05×
0.8=7.14m2/g
1.6µ
m的聚苯乙烯微球，A/M=6/1.05×
1.6=3.57m2/g
L，10mg聚苯乙烯微球需加入125－250µ
L多克隆抗体
L，10mg聚苯乙烯微球需加入62.5－125µ
2．虽然疏水性吸附与缓冲液pH值无关，但反应缓冲液的pH值对被吸附蛋白质的构象有较大影响，进而影响其吸附效率。
在等电点pH值条件下，更多的蛋白质疏水性吸附点暴露出来，利于其与微球作用；
3．高效搅拌下，将微球分散液快速加入蛋白质反应缓冲液，可以获得最高的吸附效率和吸附均匀度；
4．绝大部分的蛋白质很快被吸附，延长蛋白质与微球混合时间有助于蛋白质正确定位。
方案五
SampleProtocolforTwo-StepCarbodiimideCouplingofProteintoCarboxylatedMicrospheres
Microspheresshouldbeprotectedfromprolongedexposuretolightthroughoutthisprocedure.
1.ResuspendthestockuncoupledmicrospheresaccordingtotheinstructionsdescribedintheProductInformationSheetprovidedwithyourmicrospheres.
2.Transfer5.0x106ofthestockmicrospherestoaUSAScientificmicrocentrifugetube.
3.Pelletthestockmicrospheresbymicrocentrifugationat≥8000xgfor1-2minutes.
4.Removethesupernatantandresuspendthepelletedmicrospheresin100μLdH2Obyvortexandsonicationforapproximately20seconds.
5.Pelletthemicrospheresbymicrocentrifugationat≥8000xgfor1-2minutes.
6.Removethesupernatantandresuspendthewashedmicrospheresin80μL100mMMonobasicSodiumPhosphate,pH6.2byvortexandsonicationforapproximately20seconds.
7.Add10μLof50mg/mLSulfo-NHS（dilutedindH20）tothemicrospheresandmixgentlybyvortex.
8.Add10μLof50mg/mLEDC（dilutedindH20）tothemicrospheresandmixgentlybyvortex.
9.Incubatefor20minutesatroomtemperaturewithgentlemixingbyvortexat10minuteintervals.
10.Pellettheactivatedmicrospheresbymicrocentrifugationat≥8000xgfor1-2minutes.
11.Removethesupernatantandresuspendthemicrospheresin250μLof
50mMMES,pH5.0byvortexandsonicationforapproximately20seconds.SeeTechnicalNote1.
12.Pelletthemicrospheresbymicrocentrifugationat≥8000xgfor1-2minutes.
13.Repeatsteps11.and12.Thisisatotaloftwowasheswith50mMMES,pH5.0.
14.Removethesupernatantandresuspendtheactivatedandwashedmicrospheresin100μLof50mMMES,pH5.0byvortexandsonicationforapproximately20seconds.
15.Add125,25,5or1μgproteintotheresuspendedmicrospheres.（Note:
Werecommendtitrationinthe1to125μgrangetodeterminetheoptimalamountofproteinperspecificcouplingreaction.）
16.Bringtotalvolumeto500μLwith50mMMES,pH5.0.
17.Mixcouplingreactionbyvortex.
18.Incubatefor2hourswithmixing（byrotation）atroomtemperature.
19.Pelletthecoupledmicrospheresbymicrocentrifugationat≥8000xgfor1-2minutes.
20.Removethesupernatantandresuspendthepelletedmicrospheresin500μLofPBS-TBNbyvortexandsonicationforapproximately20seconds.SeeTechnicalNote2.
21.Incubatefor30minuteswithmixing（byrotation）atroomtemperature.（Note:
Optional–performthisstepwhenusingthemicrospheresthesameday.）
22.Pelletthecoupledmicrospheresbymicrocentrifugationat≥8000xgfor1-2minutes.
23.Removethesupernatantandresuspendthemicrospheresin1mLofPBS-TBNbyvortexandsonicationforapproximately20seconds.SeeTechnicalNote3.
24.Pelletthemicrospheresbymicrocentrifugationat≥8000xgfor1-2minutes.
25.Repeatsteps23.and24.Thisisatotaloftwowasheswith1mLPBS-TBN.
26.Removethesupernatantandresuspendthecoupledandwashedmicrospheresin250-1000μLofPBS-TBN.
27.Countthemicrospheresuspensionbyhemacytometer.
Calculation:
Totalmicrospheres=count（1cornerof4x4section）x（1x104）x（dilutionfactor）x（resuspensionvolumeinmL）
28.Storecoupledmicrospheresrefrigeratedat2-8°
Cinthedark.
TechnicalNote1:
Couplingcanbeperformedin100mMMES,pH6.0withsimilarresults.Forsomeproteins,bettersolubilityandbettercouplingmaybeachievedatahighercouplingpHorinadifferentbuffer.Ifyourproteindoesnotcouplesatisfactorilyundertheserecommendations,tryPBS,pH7.4asanalternatecouplingbuffer.
TechnicalNote2:
EitherPBS-TBN（PBS,0.1%BSA,0.02%Tween-20,0.05%Azide,pH7.4）orPBS-BN（PBS,1%BSA,0.05%Azide,pH7.4）maybeusedasBlocking/StorageBuffer.
TechnicalNote3:
EitherPBS-TBNorPBS,0.05%Tween-20maybeusedasWashBuffer.
附：
蛋白质检测方法
实验7考马斯亮蓝G-250染色法
测定蛋白质含量
一、目的
1、学习一种蛋白质染色测定的方法
2、掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的基本原理和方法
二、原理
蛋白质的存在影响酸碱滴定中所用某些指示剂的颜色变化，从而改变这些染料的光吸收。
在些基础上发展了蛋白质染色测定方法。
涉及的指示剂有甲基橙、考马斯亮蓝、溴甲酚绿和溴甲酚紫。
目前广泛使用的染料是考马斯亮蓝。
考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过范德华键结合后，变为蓝色，且在蛋白质一定浓度范围内符合比尔定律，可在595nm处比色测定。
2—5分钟即呈最大光吸收，至少稳定1小时。
在0.01—1.0
mg蛋白质/ml范围内均可。
该法操作简便迅速，消耗样品量少，但不同蛋白质之间差异大，且标准曲线线性差。
高浓度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵和去污剂时测定有干扰。
缓冲液浓度过高时，改变测定液pH值会影响显色。
考马斯亮蓝染色能力强，比色杯不洗干净会影响光吸收值，不可用石英怀测定。
三、材料、试剂与器具
（一）试剂
1、染色液：
取考马斯亮蓝G-250100mg溶于50ml95%乙醇中，加100ml85%磷酸，加水稀释至1升。
该染色液可保存数月，若不加水可长期保存，用前稀释。
2、标准蛋白溶液：
0.5mg/ml牛血清白蛋白。
3、未知浓度的蛋白质溶液用酪蛋白配制，浓度控制在10—30mg/ml
（二）器具
1、试管及试管架
2、移液管（1ml,5ml）
3、可见光分光光度计
四、操作步骤
（一）标准曲线的制作
1、取7支试管，按下表加入试剂
试管编号
试剂（ml）
1
2
3
4
5
6
1mg/ml牛血清蛋白
0.1
0.2
0.4
0.6
0.8
蒸馏水
0.9
考马斯亮蓝试剂
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