抗体工程制药Word格式.docx

抗体工程制药Word格式.docx

《抗体工程制药Word格式.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《抗体工程制药Word格式.docx（18页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

应用基因工程抗体抑制肿瘤，

应用导向IL-2受体的融合毒素治疗肿瘤，

应用基因治疗法治疗肿瘤，如应用γ-干扰素基因治疗骨髓瘤。

自身免疫性疾病

冠心病

◆简述抗体药物的概念和特点。

概念：

通过细胞工程和（或）基因工程方法制备的用于治疗的单克隆抗体、抗体片段、基因工程改造的抗体以及抗体免疫偶联物或抗体融合蛋白称为抗体工程药物，又称抗体药物（抗体的概念：

由抗原诱导的淋巴细胞合成和分泌的具有特殊氨基酸序列和结构的免疫球蛋白分子）

特异性

和相关抗原的特异性结合

对肿瘤等靶细胞的选择性杀伤作用

多样性

抗原的多样性

抗体结构的多样性

抗体活性的多样性

免疫偶联物的多样性

制备时的定向性

针对特定的靶分子定向制备抗体药物

根据需要选择抗体药物的“效应分子”

◆什么是单克隆抗体？

简述制备针对特异性抗原的单克隆抗体的基本过程。

单克隆抗体：

具有分泌抗体能力的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞经无性繁殖形成的细胞系分泌产生的活性、亲和力均相同的抗体（特点：

抗体分子在Aa序列和空间构型上均相同，单抗具有高度的特异性，产生单抗的细胞系可长期传代并保存，可持续生产同一性质的抗体）

制备针对特异抗原的单克隆抗体：

一般选40-50%的PEG进行诱导（细胞融合后培养液中有脾-脾、脾-瘤、瘤-瘤、脾、瘤等细胞）；

常用的选择性培养基为HAT培养基（瘤细胞是次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺乏株）将经融合的混合细胞用HAT培养液悬浮稀释；

一般在含有饲养细胞的96孔板中进行；

在融合后7d用HAT选择培养基培养，7-14d用HT培养基培养，14d后用完全培养基培养；

选择培养后，只有杂交瘤细胞才能生存（但不是所有的杂交瘤细胞均能产生所需的抗体）；

产生特定抗原的抗体的B细胞只占所有脾细胞的5％左右；

用抗原对所有小孔的培养上清进行抗体检测，筛出能产生目的抗体的杂交瘤细胞；

将能产生目的抗体的培养小孔中的杂交瘤细胞进行稀释；

可用有限稀释法和软琼脂法（有效稀释时，将细胞稀释液分加到96孔板中，使每个小孔在理论上只有一个细胞；

软琼脂法）；

培养后，取上清进行抗体检测，获得能产生目的抗体的杂交瘤细胞系；

大量生产目的单克隆抗体

体外培养法，10μg/ml

动物体内诱生法，5-20mg/ml

小结：

1.用特定的抗原免疫动物；

2.从脾中取出B淋巴细胞，2.骨髓瘤细胞；

3.获得杂交瘤细胞；

4.培养并筛选能产生抗体的单个杂交瘤细胞；

5.优化培养目的杂交瘤细胞；

6.纯化单克隆抗体

◆什么是基因工程抗体？

有哪几种基因工程抗体？

各种基因工程抗体的含义是什么？

人－鼠嵌合抗体：

在基因水平上将鼠源性单克隆抗体的可变区和人源性抗体恒定区连接起来并在适当的宿主细胞中表达形成的抗体

改形抗体：

改形抗体又叫CDR移植抗体（CDRgraftingantibody），将鼠单抗的CDR移植到人Ig分子的骨架区中换下其CDR序列而形成的抗体（具有鼠源性单克隆抗体的抗原结合特异性；

抗体分子中鼠源部分只占很小的比例，可基本消除免疫原性）

镶面抗体：

在人－鼠嵌合抗体的基础上将来自鼠单抗可变区中决定免疫原性的暴露于抗体表面的Aa用相应位置的人Ig的Aa代替而形成的抗体（理论基础：

抗体表面所暴露的Aa位置和数量都很保守，不因种属和型别而改变；

抗体表明暴露的Aa是鼠源可变区免疫源性的主要来源）

小分子抗体：

（优点：

分子质量小，免疫原性低；

易于进入实体瘤周围的微循环甚至进入实体瘤的内部；

无Fc片段，不易和具有Fc受体的非靶细胞结合，用于免疫诊断时成像清晰，本底低；

构建较简单，易于操作和改造；

可在细菌中表达，易于大量生产；

可和多种效应分子如毒素、前体药物转化酶等构建多种双功能抗体分子缺点：

多为单价抗体，和抗原结合活性相对较弱；

半衰期短，能很快从血液中清除，从而可能影响治疗底有效浓度）

◆简述抗体在制药中的重要用途和发展趋势

抗体的主要用途：

器官移植排斥反应的逆转（Orthoclone）

肿瘤免疫诊断，肿瘤免疫显像，肿瘤导向治疗

哮喘、牛皮癣、类风湿性关节炎、红斑狼疮、急性心梗、脓毒症、多发性硬化症及其他自身免疫性疾病

分子瘤苗治疗肿瘤

多功能抗体（双特异抗体、三特异抗体、抗体细胞因子融合蛋白、抗体酶等）的特殊用途

发展趋势：

寻找新的分子靶标

抗体人源化

抗体药物的高效化

抗体药物分子的小型化

抗体融合蛋白

动物细胞制药

◆什么是动物细胞制药？

利用动物细胞体外培养和扩增来开发、测试和生产药物的工程技术，属于动物细胞技术（animalcelltechnology）或称动物细胞工程（animalcytotechnology）

◆动物离体培养细胞根据培养特点可分为哪几种类型？

根据获得途径不同又可分为哪几类？

分类

---贴壁依赖型（anchorage-dependent）：

贴壁细胞

培养过程中依靠自身分泌的或培养基中的贴附因子才能在支持物表面生长、增殖

可来源于中胚层细胞，如成纤维细胞、心肌细胞、平滑肌细胞和成骨细胞；

贴壁生长后呈成纤维细胞型形态，细胞呈梭形或不规则三角形

可来源于外胚层和内胚层，如表皮细胞、上皮细胞等；

贴壁生长后呈上皮样细胞型形态，细胞呈扁平的不规则多角形

---非贴壁依赖型（anchorage-independent）：

悬浮细胞

可在培养液中悬浮生长，不依赖于支持物表面

如血液中的淋巴细胞

生产干扰素的Namalwa细胞

细胞呈圆形

---兼性贴壁细胞

可贴附于支持物表面生长，也可在培养基中呈悬浮状态生长

如CHO细胞、小鼠的L929细胞

当贴附于支持物表面生长呈上皮或成纤维细胞型

当悬浮培养时呈圆形

根据获得途径分：

---原代细胞

直接将动物的组织、器官经破碎等处理后获得的细胞悬浮液

1g组织约有109个细胞

需要大量的动物，费钱费力

用得最多的如鸡胚细胞、兔肾或鼠肾细胞、以及淋巴细胞

---二倍体细胞系

原代细胞经传代、筛选、扩增，从多种细胞成分中挑选并纯化出的某种具有一定特征的细胞系

染色体的核型仍然是2n

具有明显的贴壁依赖和接触抑制的特性

只有有限的增殖能力

无致瘤性

---转化细胞系

细胞在某种转化过程中，常常由于染色体的断裂变成了异倍体，从而失去了正常细胞的特点，获得了无限增殖的能力

可自发；

可用病毒或化学试剂诱导；

还可以从肿瘤组织中获得

◆用于动物离体细胞培养的培养基有哪几种？

什么是无血清培养基？

分类：

天然培养基：

血浆凝块；

血清；

淋巴液；

胚胎浸液；

羊水；

腹水（早期使用，成分复杂，组分不确定，来源有限）

合成培养基；

氨基酸，维生素，糖类，无机盐，核酸前体，氧化还原剂，动物血清（提供生长因子和激素，提供贴附因子和伸展因子，提供可识别金属、激素、维生素和脂类的结合蛋白，提供脂肪酸，提供微量元素）（成分明确，组分稳定，可批量生产）

无血清培养基：

在合成培养基中加入不同种类的添加剂后而形成的适于大规模细胞培养的培养基。

添加剂：

激素和生长因子，结合蛋白，贴附和伸展因子，其他有利于细胞生长的因子和元素（提高了细胞培养的可重复性；

减少了由血清带来的各种微生物的污染；

可工厂化生产，供应充足、稳定；

细胞产品易于纯化；

避免了血清中某些因素对有些细胞的毒性；

便于产品的检测）

◆简述用于动物离体细胞培养的方法。

---悬浮培养：

将细胞自由地悬浮于培养基内生长增殖，适用于非贴壁依赖性细胞、兼性贴壁细胞（优点：

操作简单，培养条件均一，传质和传氧较好，易于扩大培养；

缺点：

细胞的培养密度较低）

---贴壁培养：

将细胞贴附在某种基质上生长培养，适用于一切贴壁依赖型细胞，兼性贴壁细胞（优点：

适用的细胞种类多，易采用灌流培养，可使细胞达到高密度；

操作麻烦，需要合适的贴壁材料，培养条件不一，难控制）

---贴壁-悬浮培养：

分

微载体培养

包埋培养：

细胞被包埋或包裹在凝胶载体中

微囊培养：

将包埋的颗粒经液化处理而成为微囊

结团培养：

以细胞本身作为基质，相互贴附后，再用悬浮的方式进行培养

基因治疗和核酸药物

◆什么是基因治疗？

世界上第一个批准的用于基因治疗的药物是什么？

基因治疗：

通过改变病人遗传基因来治疗疾病的任何治疗方案或药物（“Anyprocedureintendedtotreatoralleviatediseasebygeneticallymodifyingthecellsofapatient”）

2004，重组人ｐ５３腺病毒注射液（商品名：

今又生）

◆简述各种基因治疗方法的含义。

---基因置换（genereplacement）：

用正常基因原位替换病变细胞内的缺陷基因（细胞内的缺陷基因不再存在；

细胞完全恢复正常；

最理性，技术上难）

---基因矫正（genecorrection）：

将突变基因的突变基因序列矫正，正常部分保留（能使致病基因完全恢复；

操作要求高，技术上难）

---基因增补（geneaugmentationtherapy,GAT）：

用于基因失活引起的疾病，缺陷基因仍存在，增加正常基因的拷贝数增加正常基因的表达产物使疾病细胞恢复正常功能主要用于单基因遗传病

---基因失活（geneinactivation）：

特异性地抑制有害基因的表达

核酶（ribozyme）降解或修复mRNA

三链寡核苷酸（triple-formingoligonucleotides）抑制基因转录

反义核酸（antisenseoligos）反义DNA和反义RNA

RNA干扰（RNAi）

---免疫调节（immuneadjustment）：

将抗体、抗原或细胞因子的基因导入病人体内，通过改变病人免疫状态来预防和治疗疾病

---其他，如增加肿瘤细胞对放化疗地敏感性

◆简述用于基因治疗的病毒载体的种类和特点。

---逆转录病毒（retroviruses）

优点

基因组小并且简单

可稳定整合到宿主基因组

生物学特性研究清楚

可高效转入复制状态中的细胞

对宿主细胞无害

缺点

随机整合

仅感染分裂中的细胞

病毒滴度低

可能会和其他有复制能力的病毒重组

插入容量有限

---腺病毒（adenoviruses）

可感染分裂或不分裂的细胞

适于原位使用，尤其是肺

病毒滴度高

生物学特性清楚

不和宿主基因组整合

只有短暂表达

病毒蛋白可在宿主中表达

可引起免疫反应

插入基因能力有限

---单纯疱疹病毒（herpessimplex）

---腺相关病毒（adeno-associatedviruses,AAV）

基因组小

可特异性整合到人19号染色体

以人细胞作为宿主

无毒、无致病性

未研究清楚

携带外源基因能力有限

需腺病毒辅助复制

难获得高滴度病毒

基因重组生长激素

◆生长激素是怎样和受体相互作用的？

生长激素缺乏会导致什么后果？

结合时，首先通过位点1和一个受体结合，然后再以位点2和另一个受体结合，导致两个受体同源聚合，从而激活hGH受体。

顺序作用，必须先和1位点结合，才能和位点2结合

1分子的hGH和2分子的受体结合

当hGH浓度高而受体又不足时，所有受体均和位点1结合，hGH受体不能被激活，造成hGH作用拮抗。

GH-N基因缺失，或调控异常使hGH分泌量减少，导致生长迟缓，GHD，侏儒

◆简述重组人生长激素的种类和特点

---192Aa的Met-rhGH：

治疗效果同hGH，但有50％－80％的人会产生免疫反应

---用酶去除Met，或是置于分泌型启动子后，分泌过程中切去信号肽，累积于细胞周质中（rhGH）

---聚乙二醇修饰（PEG化的rhGH）

基因重组细胞因子

◆什么是细胞因子？

常见的细胞因子有哪些?

细胞因子：

由细胞分泌的（免疫细胞和某些非免疫细胞），经刺激而合成并分泌的一些生物活性分子，具有调控细胞生长分化、调节免疫功能和生理活性并参和病理反应的小分子蛋白质（6~60kDa）（Awidevarietyofintercellular（cell-to-cellcommunication）regulatoryproteins（secretedlow-molecular-weight）producedbymanydifferentcellsinthebodyandultimatelycontroleveryaspectofbodydefense.Cytokinesactivateanddeactivatephagocytesandimmunedefensecells,increaseordecreasethefunctionsofthedifferentimmunedefensecells,andpromoteorinhibitavarietyofinnatebodydefenses.）

四大种类细胞因子

干扰素（interferon,IFN）

白细胞介素（interleukin,IL）

集落刺激因子（colonystimulatingfactor,CSF）

肿瘤坏死因子（tumornecrosisfactor,TNF）

◆常见的干扰素有哪几种？

各种干扰素的特点是什么？

I型干扰素：

可耐受PH＝2的酸溶液处理；

或可耐受60°

C的温度处理。

II型干扰素：

不能耐受PH＝2的酸溶液处理；

且不能耐受60°

常见干扰素：

INF-α，INF-β，INF-γ

INF-α

INF-β

INF-γ

位置

9号

12号

基因产物大小

188-189Aa

187Aa

166Aa

成熟产物大小

165-166Aa

143Aa

主要产生细胞

B淋巴细胞、成纤维细胞、肿瘤细胞

成纤维细胞、胚胎细胞、羊膜细胞、上皮细胞、肿瘤细胞

活化T细胞、NK细胞

刺激产生因子

RNA病毒、胞内微生物、其他细胞因子、内毒素等

和INF-α相同

抗原、分裂素、葡萄球菌肠毒素B、其他细胞因子

类型

I型

II型

受体

INF-α/βR

IFN-γR

◆干扰素有哪些生物学功能？

相应的重组干扰素可用于哪些疾病的治疗？

干扰素的生物活性

抗病毒作用：

可诱导细胞产生不同的抗病毒因子；

可诱导多种细胞表达组织相容性抗原，促进细胞加工和提呈抗原，增强细胞毒性T细胞的毒性；

能激活NK细胞、巨噬细胞并增强其抗病毒活性；

可诱导氧化氮（NO）合成酶的表达，抑制病毒复制

抑制某些细胞的生长（cytostatic），增殖：

降低DNA合成；

使细胞停留在Go/G1静止期；

降低c-myc、c-fos等原癌基因转录水平；

降低某些生长因子受体表达，如EGFR、胰岛素-IR和M-CSFR等；

抑制成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞和造血细胞的增殖

抑制和杀伤肿瘤细胞：

抑制肿瘤病毒的增殖；

直接抑制肿瘤细胞增殖；

改变肿瘤细胞表面的性能，诱发新抗原，从而易被免疫监视细胞识别而清除；

通过免疫调节，增强机体抗肿瘤的能力，如激活巨噬细胞和增强NK细胞和ADCC效应（抗体依赖的细胞毒作用）；

抑制原癌基因的表达

免疫调节作用：

高剂量的IFN-α能抑制辅助T细胞和B细胞的增殖；

IFN-α可增加I型MHC的表达，而对II型MHC的表达作用小；

IFN-γ可显著增强抗原提呈细胞表达II型MHC抗原；

IFN-γ增强抗原提呈细胞和T细胞的相互作用；

IFN-γ通过诱导某些肿瘤细胞表达MHC抗原，促进CTL细胞对肿瘤细胞的杀伤，还可诱发巨噬细胞杀伤肿瘤

---在病毒性疾病中的应用：

---在血液病治疗中的应用：

毛细胞白血病

---在治疗实体瘤中的应用：

---在治疗其他疾病中的应用：

自身免疫性疾病，如类风湿关节炎；

神经系统慢性炎症疾，多发性硬化病；

罕见的吞噬细胞氧化代谢缺陷遗传病，慢性肉芽肿

◆简述红细胞生成素的产生部位和调节

红细胞生成素：

肾脏分泌的调节红系祖细胞生长和分化的细胞因子（激素）

胎儿和新生儿，产生EPO主要器官是肝脏

成年期，约有90％的EPO由肾脏产生，包括肾皮质细胞、肾小管细胞以及肾小管周围的毛细管的内皮细胞产生

在成年期肝脏也能产生少量的EPO，称为肾外性EPO

一些肿瘤细胞也能产生EPO，如肾细胞癌细胞、血管母细胞瘤细胞等

调节：

动脉血氧分压，如贫血、心肺疾病和高原反应均可诱导产生

钴盐、锰盐和锂盐诱导产生

雄激素诱导产生

◆红细胞生成素的生物学功能是什么?

维持红细胞造血细胞前体的存活并促进其分化

诱导前期成红细胞的前驱细胞和后期成红细胞的前驱细胞生长分化为成熟的红细胞

调节红细胞的血红色素化

调节外周血红细胞的数量

◆重组人红细胞生成素生产细胞和适应症是什么？

◆新型红细胞生成素有哪些？

有哪些优缺点？

EPO模拟肽：

采用噬菌体表面展示技术在肽库中筛选和Epo受体结合并能促进红系造血的肽分子称Epo的模拟肽

高度糖基化EPO：

将天然人Epo的五个氨基酸改变（Ala30Asn,His32Thr,Pro87Val,Trp88Asn,和Pro90Thr）,同时在第30和第88位氨基酸位置引入了两个新的N2糖基化位点,其产物称为Darbepoetin（或NESP）

Epo二聚体：

将两个Epo以长17个氨基酸的柔性接头[A－（GGGGS）3－T]相连或使用含9个氨基酸的接头（Gly－Ser－Gly4－Ser－Gly－Ala）连接两个Epo分子

双因子融合蛋白：

GM-CSF/Epo，IL23/Epo，Epo/Tpo

◆什么是白细胞介素？

已上市的重组人白细胞介素是哪些？

主要适应症分别是什么？

白细胞介素：

由各种白细胞产生的，介导细胞之间相互作用的细胞因子，主要由激活的淋巴细胞分泌

---IL-2，用于肿瘤治疗，抗感染治疗，先天性和后天性免疫缺陷症

---IL-11，用于肿瘤化疗后导致的血小板减少症，治疗急性骨髓抑制正在研究中，治疗银屑病的临床试验取得初步疗效

◆什么是集落刺激因子（colonystimulatingfactor,CSF）？

主要又哪几类？

又称髓系细胞造血因子,是造血细胞在体外培养过程中形成不同细胞系克隆时起促进作用的重要因子，是骨髓中髓系造血细胞生存、生长,分化不可缺少的分子。

可维持细胞存活和细胞膜的完整，刺激造血细胞增殖，引导造血细胞分化定型，刺激终末细胞的功能活性

粒细胞集落刺激因子（granulocyteCSF,G-CSF）

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophageCSF,GM-CSF）

巨噬细胞集落刺激因子（macrophageCSF,M-GSF）

多能集落刺激因子（muti-CSF/IL-3）

红细胞生成素（erythropoietin,EPO）

血小板生成素（thrombopoietin,TPO）

干细胞因子（stemcellfactor,SCF）

白血病抑制因子（leukaemiainhibitoryfactor,LIF）

fms样tyr激酶-3配体（fms-liketyrosinekinase-3ligand,FL）

◆G-CSF、GM-CSF和M-CSF各有哪些生物活性？

G-CSF

促进骨髓造血细胞增殖分化形成粒细胞集落

诱导中性粒细胞终末分化

增强中性粒细胞的功能

GM-CSF

能维持和促进红系、巨核系、粒单系以及嗜酸系等造血前体细胞的存活和增殖分化

影响成熟髓系细胞的功能

低浓度就可维持细胞存活，但高于该浓度100的浓度才能促进细胞增殖分化

M-CSF

刺激巨噬细胞的前体增殖分化为巨噬细胞

诱导巨噬细胞产生GM-CSF、G-CSF、TNF、前列腺素和活性氧

增强巨噬细胞抗白色念珠菌和抗肿瘤的活性

对滋养层细胞、小胶质细胞和成骨细胞有调节作用

在器官发生和组织重建中起重要作用

◆简述重组G-CSF、GM-CSF和M-CSF作为生物技术药物在临床上的应用。

G-CSF：

治疗各种原因引起的中性粒细胞减少症（肿瘤放化疗后的辅助用药；

自体骨髓移植；

骨髓再生不良综合症（MDS）引发的嗜中性粒细胞的减少和缺乏症；

再生障碍性贫血伴随嗜中性粒细胞的减少和缺乏症；

重症慢性粒细胞减少症；

AIDS）

GM-CSF：

主要应用于各种原因引起的白细胞减少症（肿瘤病人放、化疗所致的造血障碍；

骨髓移植；

治疗骨髓异常增生综合症；

再生障碍性贫血；

艾滋病）

M-CSF：

主要用于肿瘤放化疗后加速造血功能的恢复，增加