35二硝基水杨酸DNS法测定还原糖Word文档下载推荐.docx
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3，50mL×
3；
5）刻度吸管：
1mL×
2mL×
10mL×
6）沸水浴；
7）冰浴；
8）扭力天平；
9）UV—2802SH型紫外可见分光光度计尤尼柯（上海）仪器有限公司；
2.3实验试剂
1）1mg/mL葡萄糖标准液
准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。
2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂
将6.3gDNS和262mL2MNaOH溶液，加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中备用。
3．实验步骤制作葡萄糖标准曲线
取7支25mL具塞刻度试管编号，按表1分别加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。
表1葡萄糖标准曲线制作
管号
1mg/mL葡萄糖标准液
（mL）
蒸馏水
DNS
葡萄糖含量
（mg）
光密度值
（OD540nm）
2
1.5
1
0.2
1.8
0.4
1.6
3
0.6
1.4
4
0.8
1.2
5
1.0
6
将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5min，取出，冰浴冷却至室温，用蒸馏水定容至25mL，加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色。
调波长540nm，用0号管调零点，测出1~6号管的光密度值。
以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量（mg）为横坐标，做出标准曲线。
蒽酮比色法测糖
一 目的 掌握蒽酮比色法测糖的原理和方法
二 原理 蒽酮比色法是一个快速而简便的定糖方法。
蒽酮可以与游离的已糖或多糖中的已糖基、戊糖
基及已糖醛酸起反应，反应后溶液呈蓝绿色，在620nm处有最大吸收。
本法多用于测定糖原的含量，也可用于测定葡萄糖的含量。
三 实验器材及试剂
马铃薯干粉
可调试移液器或移液管
可见分光光度计（723型）
电子分析天平
水浴锅
电炉子
蒽酮试剂：
取2g蒽酮溶解到80%H2SO4中，以80%H2SO4定容到1000ml，当日配制使用。
标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml）：
100mg葡萄糖溶解到蒸馏水中，定容到1000ml备用。
四、操作
1.制作标准曲线
取7支干燥洁净的试管，按表1顺序加入试剂，进行测定。
以吸光度值为纵坐标，各标准溶液浓度（mg/ml
）为横坐标作图得标准曲线。
表1
蒽酮比色法定糖——标准曲线的制作
沸水浴中准确煮沸10min，取出用流水冷却，室温放10min,于620nm处比色
葡萄糖浓度（mg/ml）
2.样品含量的测定
样品液的制作：
精确称取马铃薯干粉0.1g置于锥形瓶中—→加入30ml沸水—→沸水浴30min（不时摇动）—→取出，
3000rpm离心10min（或过滤）—→反复洗涤残渣2次—→合并滤液—→冷却至室温—→定容到50ml的锥形
瓶中—→再从中取出1ml，再定容到10ml的容量瓶中
样品液的测定：
（1）取4支试管，按照表2加样（加蒽酮时需要冰水浴5min冷却）
表2
蒽酮比色法定糖——样品的测定
（2）加样冷却完成后置沸水中煮沸10min，取出流水冷却放置10min，620nm处比色测量各管OD值。
（3）以1号试管作为调零管，2、3、4号管的OD值取平均后从标准曲线上查出样品液相应的含糖量。
3．结果计算：
C×
V
w
=
————×
100%
m，
式中w：
糖的质量分数（%）
C：
从标准曲线中查出的糖质量分数（mg/ml）
V：
样品稀释后的体积（ml）
m：
样品的质量（ml）
一 目的 掌握蒽酮比色法测糖的原理和方法
二 原理 蒽酮比色法是一个快速而简便的定糖方法。
蒽酮可以与游离的已糖或多糖中的已糖基、戊糖基及已糖醛酸起反应，反应后溶液呈蓝绿色，在620nm处有最大吸收。
本法多用于测定糖原的含量，也可用于测定葡萄糖的含量。
三 实验器材及试剂
马铃薯干粉
可调试移液器或移液管
可见分光光度计（723型）
电子分析天平
水浴锅
电炉子
蒽酮试剂：
标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml）：
四、操作
1.制作标准曲线
取7支干燥洁净的试管，按表1顺序加入试剂，进行测定。
以吸光度值为纵坐标，各标准溶液浓度（mg/ml）为横坐标作图得标准曲线。
表1蒽酮比色法定糖——标准曲线的制作
沸水浴中准确煮沸10min，取出用流水冷却，室温放10min,于620nm处比色
葡萄糖浓度（mg/ml）
2.样品含量的测定
样品液的制作：
精确称取马铃薯干粉0.1g置于锥形瓶中—→加入30ml沸水—→沸水浴30min（不时摇动）—→取出，
3000rpm离心10min（或过滤）—→反复洗涤残渣2次—→合并滤液—→冷却至室温—→定容到50ml的锥形瓶中—→再从中取出1ml，再定容到10ml的容量瓶中
样品液的测定：
（1）取4支试管，按照表2加样（加蒽酮时需要冰水浴5min冷却）
表2蒽酮比色法定糖——样品的测定
（2）加样冷却完成后置沸水中煮沸10min，取出流水冷却放置10min，620nm处比色测量各管OD值。
（3）以1号试管作为调零管，2、3、4号管的OD值取平均后从标准曲线上查出样品液相应的含糖量。
3．结果计算：
C×
w=————×
m，
式中w：
C：
V：
m：
样品的质量（ml）
原理
植物在个体发育的各个时期，代谢活动也发生相应的变化，碳水化合物的代谢也不例外，其含量也随之发生变化。
了解可溶性糖含量的变化，在生理上和实践上都有重要的意义。
这里介绍的是蒽酮比色法，糖在硫酸的作用下生成糖醛，糖醛再与蒽酮作用，形成一种绿色的络合物，颜色的深浅与糖含量有关。
方法简便，但没有志一性，对于绝大部分的碳水化合物都能与蒽酮反应，产生颜色。
仪器药品
721型分光光度计分析天平
研钵恒温水浴锅
烧杯容量瓶
三角烧瓶大试管
移液管漏斗
乙醚草酸钠
饱和醋酸铅
葡萄糖标准溶液：
称取已在80℃烘箱中烘至恒重的葡萄糖100mg，配制成500ml溶液，即得每ml含糖为200μg的标准溶液。
称取1g经过纯化的蒽酮，溶解于1000ml稀硫酸中即得。
硫酸溶液由760ml浓硫酸（比重1.84）稀释成1000ml而成。
操作步骤
1．可溶性糖的提取
称取重约5g的新鲜植物叶子，于研钵中乙醚少许，仔细研磨成均匀的浆状物，倒入烧杯中，用70℃热水洗涤研钵，洗液并入烧杯中，再加蒸镏水30─40ml。
将烧杯放在水浴锅中加热，保持温度70─80℃约半小时，冷却后1滴1滴地加入饱和中性醋酸铅，以除去蛋白质，直至加入醋酸铅时不再形成白色沉淀为止。
然后将此混合物连同残渣一并洗入100ml容量瓶中，加水至刻度，充分振荡。
以干燥漏斗将滤液过滤于一干燥的三角烧瓶中，瓶中事先放有少量（约0.2─0.4g）草酸钠粉末，以除去滤液中过量的醋酸铅，使生成草酸铅沉淀，再行过滤，所得的透明滤液即为可溶性糖提取液。
2．显色及比色
吸取上述糖提取液1ml，放入一干洁的试管中，加蒽酮试剂5ml混合之，于沸水浴中煮沸10分钟，取出冷却，然后于分光光度计上进行测定，波长为625nm，测得吸光度。
从标准曲线上查得滤液中的糖含量（或经直线回归公式计算），然后再行计算样品中含糖百分数。
3．绘制标准曲线
取标准葡萄糖溶液将其释成一系列不同浓度的溶液，浓度分别为每ml含糖0、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μg。
按上述方法分别测得其吸光度，然后绘制A026－糖浓度曲线，或进行直线回归求得直线方程。
4．计算样品中含糖%
设V为植物样品稀释后的体积（ml）
C为提取液的含糖量（μg/ml）
W为植物组织鲜重（g）
则得计算式如下：
％＝C×
V/（W×
1000000）×
100％
[编辑本段]
蒽酮比色法测定多糖含量
[a]多糖含有几百个或更多残基，但只有一个还原基团，因此它的还原能力极弱，对于他们的测定，应先将它们用酸水解成单糖组分。
蒽酮比色法是一种快速而简便的定糖方法，糖类遇浓硫酸脱水生成糠醛及其衍生物，该衍生物与蒽酮发生反应，反应后溶液呈蓝绿色，于620nm处有最大吸收。
因此可用此方法测定多糖含量。
[b]试剂
2g/L蒽酮试剂：
溶解2g蒽酮于1L浓硫酸（98%的浓硫酸）中，当日配制使用。
0.01g/L葡萄糖溶液（可加几滴甲苯作防腐剂）
0.1g/L糖元溶液
[c]实验器材
试管及试管架吸量管（1ml，5ml）恒温水浴箱（100℃）制冰机紫外分光光度计滴管白瓷板
制作标准曲线
准确称取0.1g葡萄糖（分析纯），溶解并用蒸馏水定容至100ml后，分别取出1ml,2ml,3ml,4ml,5ml分别加入到50的容量瓶中，并用蒸馏水定容到50ml，配成浓度分别为20ug/ml,40ug/ml,60ug/ml,80ug/ml,100ug/ml,各取1ml于试管中，再加入3ml的蒽酮试剂，迅速浸入冰水中冷却，待几支试管均匀加完后，一起浸入100℃恒温水浴箱中，为防止水分蒸发，应在试管口上加盖一个玻璃球或者加一个塞子，自温度重新升至100℃起计时，准确保温10min后取出，用流动水冷却，然后，于室温中平衡片刻（约10min左右），在分光光度计上，波长620nm处，用0.5cm厚度的比色杯，以空白管做对照空白（此处的空白是指不加葡萄糖的蒽酮试剂，其他反应条件都一致），进行比色。
既得标准曲线。
如下表格
编号
体积ml
浓度ug/ml
20
40
60
80
100
[d]样品测定
如上述条件一致，但要记得用除去蛋白质的样品溶液进行测定，否则会影响测定结果。
样品含糖量计算：
V2×
D
样品含糖量（%）=----------------------×
W×
V1×
10
其中C----在标准曲线上查出的糖含量（ug）,
V2---提取液总体积（ml）
V1---测定时取用体积（ml）
D-----稀释倍数
W-----样品重量（g）
10-----样品重量单位g换算成ug的倍数
注意事项：
1.一定要注意温度要控制在100℃
2.从100℃开始准确计时10min,然后迅速冷却，于室温中平衡10min.
3.蒽酮要注意避光保存。
配置好的蒽酮试剂也应注意避光，当天配制好的当天使用。
4.试管要保证干燥清洁，无残留水滴。
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