生物化学与分子生物学基本试验试验一蛋白质的盐析与透析试验Word格式文档下载.docx

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（4）Nessler试剂称取150g碘化钾置于三角烧瓶中，加蒸馏水100ml使之溶解，再加入110g碘，待完全溶解后加140g～150g汞，用力振摇10分钟左右，此时产生高热，须将三角烧瓶放入水中继续摇动，直至棕红色的碘转变成带绿色的碘化汞钾为止。

将上清液倾入2000ml容量瓶中，并用蒸馏水洗涤瓶内的沉淀数次，将洗涤液一并倒入容量瓶内，用蒸馏水稀释至刻度，此为贮存液，储于棕色瓶中备用。

取贮存液150ml，加10％氢氧化钠700ml，混匀后加蒸馏水150ml，混匀，此为应用液，储于棕色瓶中，如混浊可过滤或静止数天后取上清液使用。

本试剂需有适宜的pH值，调节至用1mol/L盐酸20ml滴定时，需本试剂11.0ml～11.5ml时为宜。

（5）血清样本。

实验内容

1、取2m1血清加入离心管中，再加入2ml饱和硫酸铵溶液，用玻璃棒搅匀，静置5～10分钟后，用2000rpm离心5分钟，将上清液移至另一离心管中，分次加入少量硫酸铵粉末，并用玻璃棒搅拌至有少量硫酸铵不再溶解为止，静置5～10分钟后，同上离心，得沉淀和上清液。

2、取在蒸馏水中煮沸约1小时的15mm×

60mm透析袋一条，一端打结后检查是否漏水，不漏则将水倒掉，加入用3ml蒸馏水溶解的第二次沉淀液，挂于盛有蒸馏水的小烧杯中，使袋内外的液面处于同一水平，透析约30分钟，每隔10分钟更换一次透析液。

3、检查取6支试管，按下表操作。

表3-2-1

试剂

（滴）

管号

123456

袋内液1010————

透析液——1010——

蒸馏水————10—

饱和硫酸铵—————10

双缩脲试剂10—10——10

Nessler试剂—10—1010—

混匀后观察并记录结果。

思考题

1、透析时如何防止蛋白质变性？

2、两次沉淀的蛋白质各为何种蛋白质？

实验二凝胶层析法分离蛋自质

实验目的

1、掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和方法。

2、了解核酸-蛋白质检测仪和部分收集器的工作原理和使用。

实验原理

凝胶层析法主要是根据混合物中各种分子的分子量不同，通过固定相凝胶时，分子的扩散移动速度各异而使大小不同的分子得到分离的方法。

当加在凝胶床表面的混合物随洗脱液进行洗脱时，分子量大的物质阻滞作用小，沿凝胶颗粒的间隙下流，流程短、而移动速度快，先流出层析床，分子量小的物质阻滞作用大，能够进入凝胶颗粒的网孔内，流程长、而移动速度慢，后流出层析床。

本实验用葡聚糖凝胶G-75分离牛血清清蛋白（分子量67000）与溶菌酶（分子量13930）两种蛋白质，用核酸－蛋白质检测仪进行检测或用双缩脲反应观察结果。

（1）试管及试管架。

（2）层析柱1.5cm×

20cm的玻璃管柱。

（3）大、小烧杯和玻璃棒、吸管、滴管、滤纸。

（4）部分收集器和核酸－蛋白质检测仪。

试剂药品：

（1）葡聚糖凝胶G-75（商品名为SephadexG-75）。

（2）洗脱液称取Tris12.12g，KCl15g，先用少量蒸馏水溶解，再缓缓加入6.67ml浓HCl，定容至2000ml，此为0.05mol·

L-1Tris-HCl缓冲液，其pH值为7.5。

（3）样品取牛血清清蛋白和溶菌酶各5．0mg，溶于1ml洗脱液中。

（4）10％NaOH和0.5％CuSO4溶液。

实验内容

1、葡聚糖凝胶G-75的制备取适量葡聚糖凝胶G-75加入0.05mol·

L-1Tris-HCl缓冲液中，充分混匀后，置沸水浴中1小时或室温下5小时，使其充分溶胀，倾除漂浮的细颗粒，再加入少量缓冲液，轻轻搅动后倾除剩余的细颗粒，备用。

2、装柱将1.5cm×

20cm的玻璃管柱垂直固定于铁架上，下端铺垫棉花或玻璃棉，先用少量洗脱液将气泡赶净，然后将下端活塞关闭，再将凝胶悬液倾入柱中，同时微启活塞，在管中凝胶下沉的同时继续加入凝胶悬液，待沉至约15cm高时，加入2倍柱体积的洗脱液平衡，然后在柱床表面放一滤纸片，以防加样时凝胶被冲起。

注意：

在装柱和层析过程中，不得使液面低于凝胶床表面，否则，空气进入凝胶床中将严重影响分离效果。

3、加样微启下端活塞，使柱上的洗脱液面刚好下降到凝胶床表面时，关紧活塞，用滴管吸取待分离的样品，缓慢地加到凝胶床表面上，微启下端活塞，使样品进入凝胶床，关闭活塞；

再按同样方式，反复加入少量洗脱液，以洗净柱内壁上的样品溶液，然后加入适量的洗脱液，约高出床表面3cm～5cm。

4、洗脱用洗脱液连续洗脱，流速为25滴／分钟。

用280nm紫外光监测，用部分收集器从加样开始每3分钟收集1管洗脱液，至记录仪出现二个峰及基线平稳后，停止洗脱并关机。

5、双缩脲反应观察结果每个收集管加入10％NaOH10滴，0.5％CuSO42滴，观察并记录结果。

1、洗脱过程中为何要控制流速？

2、第一次分离结束后，能否利用原层析柱继续进行分离？

为什么？

实验三血清γ球蛋白的分离提纯

1、掌握盐析法分离提纯γ-球蛋白的原理与方法。

2、了解凝胶层析法脱盐的原理和操作。

3、熟悉醋酸纤维薄膜电泳的基本原理和过程。

分离和纯化蛋白质是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。

可利用蛋白质分子量、溶解度和在一定pH条件下所带电荷不同等性质的差异，而分离和纯化，盐析法就是常用的方法之一。

向蛋白质溶液中加入中性盐（如硫酸铵），使溶液的离子强度发生改变，从而使蛋白质表面的电荷被大量中和，水化膜被破坏而沉淀析出。

由于蛋白质的性质不同，故盐析时所需中性盐的饱和度亦异，用下式计算达到所需饱和度时应如入饱和中性盐溶液的体积：

V=V0（S2－S1）／（S1－S2）

式中V和V0分别代表需加入饱和中性盐溶液的体积和待盐析蛋白质溶液的体积，S1和S2分别代表待盐析蛋白质溶液中该中性盐的原饱和度和所需达到的饱和度。

盐析法分离蛋白质多在低温下操作，所得蛋白质沉淀并不变性，但含有大量中性盐分子,可用凝胶层析法脱盐。

由于中性盐分子的分子量较小，在凝胶层析过程中的阻滞作用较大，而蛋白质分子的分子量较大,阻滞作用较小，从而达到分离（参见实验凝胶层析法分离蛋白质）。

本实验采用中性盐硫酸铵进行盐析分离血清γ球蛋白，用葡聚糖凝胶G-25进行脱盐，用双缩脲试剂和Nessler试剂分别检验蛋白质和NH4+，最后用醋酸纤维素薄膜电泳迸行比较鉴定。

仪器材料和试剂药品

（2）2ml刻度吸管、玻璃棒、烧杯。

（3）层析柱：

1.1crn×

12cm玻璃管柱及架。

（4）滴管、滤纸、反应板。

（5）离心机和全套电泳器材。

（1）兔血清。

（2）PBS（磷酸盐生理盐水缓冲液）0.2mol·

L-1，pH7.2的磷酸缓冲溶液中加入氯化钠至0.15mol·

L-1。

（3）葡聚糖凝胶G-25（商品名为SephadexG-25）。

（4）pH7.2饱和硫酸铵溶液用氨水将饱和硫酸铵溶液调到pH7.2。

（5）Nessler试剂称取150g碘化钾置于三角烧瓶中，加蒸馏水100ml使之溶解，再加入110g碘，待完全溶解后加140g～150g汞，用力搌摇10分钟左右，此时产生高热，须将三角烧瓶放入水中继续摇动，直至棕红色的碘转变成带绿色的碘化汞钾为止。

将上清液倾入2000ml容量瓶中，并用蒸馏水洗涤瓶内的沉淀数次,将洗涤液一并倒入容量瓶内，用蒸馏水稀释至刻度此为贮存液，储于棕色瓶中备用。

本试剂需有适宜的pH值，调节至用1mol·

L-1盐酸20ml滴定时，需本试剂11.0ml～11.5ml时为宜。

（6）双缩脲试剂称取CuSO4·

H2O）10g和K15g，溶于500ml蒸馏水中，再加20％氢氧化钠300ml，混匀后，慢慢加入硫酸铜溶液申，加蒸馏水至1000ml。

（7）电泳缓冲液、染色液和漂洗液：

同蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳定量测定实验。

1、盐析

（1）取1支刻度离心管，加入2.0ml血清，再加入2.0mlPBS，混匀后滴加（边加边摇）2.0ml饱和硫酸铵溶液，混匀后于室温下静置10分钟，以3000rpm离心10分钟，弃上清。

（2）向沉淀中加入PBS，使其溶解并加至1.0ml，再滴加（边加边摇）0.5ml饱和硫酸铵溶液，混匀后于室温下静置10分钟，同上离心，弃去上清。

重复本操作2~3次，沉淀物为初步纯化的γ球蛋白。

2、脱盐

（1）装柱：

称取2.5g葡聚糖凝胶G-25，倒入100ml烧杯中，加蒸馏水50ml，充分混匀后，置沸水浴中1小时或室温下5小时，使其充分溶胀，静置冷却后倾弃上清液，再加入PBS10ml，用玻璃棒轻轻搅拌，将1.1cm×

12cm的璃管柱垂直固定于铁架上，下端铺垫棉花或玻璃棉，先用少量洗脱液将气泡赶净，然后将下端活塞关闭，再将溶胀后的葡聚糖凝胶G-25悬液倾入柱中，同时微启活塞，在管中凝胶下沉的同时继续加入凝胶悬液，待全部凝胶倾入柱内，且液面接近凝胶面时，关闭下端活塞。

为使凝胶面平坦，可用手指轻轻弹动层析柱，然后小心开启下端活塞，以10滴·

min-1的速度用2倍柱体积的洗脱液平衡，当液面恰好与凝胶面重合时，立即关闭活塞，然后在柱床表面放一滤纸片，以防加样时凝胶被冲起。

（2）脱盐向盛有γ球蛋白的离心管内加入10滴PBS液，并用玻璃棒轻轻搅拌使其全部溶解，再用乳头吸管吸取γ球蛋白液，小心地加到凝胶床表面上，使之缓缓滴入，微启下端活塞，使流速为4～5滴·

min-1，待样品全部缓慢地进入凝胶床，关闭活塞。

再按同样方式，反复加入少量PBS液，以洗净柱内璧上的样品溶液，然后加入适量的PBS液，约高出床表面3crn～5cm，进行连续洗脱。

（3）收集用12支小试管收集洗脱液，每收集1ml更换试管，直到12支管都收集完，关闭活塞。

（4）检测准备反应板两块，取每支试管内的洗脱液，分别加在两块反应板的各对应凹内一滴，再向一反应板各凹加双缩脲试剂一滴,向另一反应板各凹加Nessler试剂一滴，记录各凹颜色变化，以“－”或“＋”表示不呈色或呈色深浅。

3、电泳将双缩脲反应呈色最深一管中的洗脱液作为样品，与血清作对照，按血清蛋白质醋酸纤维素膜电泳定量测定实验中的操作，进行电泳，呈色后迸行判断。

1、盐析过程中各上清和沉淀中主要含何种蛋白质？

2、盐析中所达到的硫酸铵饱和度各是多少？

3、脱盐过程中，物质洗脱出来的顺序如何？

实验四酶作用的特异性和影晌酶促反应速度的因素

1、了解酶的催化特异性。

2、了解温度、pH、激动剂和抑制剂对酶促反应速度的影响。

作为生物催化剂的酶，具有高度的特异性，如唾液淀粉酶只能催化水解α-1，4葡萄糖苷键，而不能水解α-吡喃葡萄糖-1，2-β-呋喃果糖苷键，故只能水解淀粉而不能水解蔗糖。

淀粉和蔗糖均无还原性，对班氏试剂呈阴性反应；

而它们水解后的产物则为还原糖，与班氏试剂共热时可产生红棕色的氧化亚铜沉淀，据此可检验它们有无水解。

酶促反应速度受许多因素的影响，如温度、pH、激动剂和抑制剂等。

上述诸因素对唾液淀粉酶催化淀粉水解反应速度的影响，可用定性或定量反应来观察。

利用碘与淀粉及其不同程度水解产物反应的颜色，来衡量酶促反应的速度，即淀粉（蓝色）→紫色糊精（紫色）红色糊精（红色）→麦芽糖及少量葡萄糖（黄色），颜色由蓝变黄，表示酶促反应速度由低到高，此为定性观察；

亦可利用夏弗尔一哈德曼试剂测定淀粉水解物中还原糖含量，来定量观察酶促反应的速度。

夏弗尔-哈德曼试剂中含有硫酸铜、碘酸钾和草酸钾，在碳酸氢钠和碳酸钠所构成的碱性环境中加热，还原糖可使硫酸铜中的Cu2+还原成Cu+；

当加入硫酸后，试剂中碘化钾所含的碘离子被碘酸氧化为自由单质碘；

而I2可将生成Cu+的氧化成Cu2+，后者被试剂中的草酸钾络合，从而使上述反应不能逆行，剩余的碘可用标准硫代硫酸钠溶液滴定；

按同样方法作空白滴定，所消耗硫代硫酸钠量代表溶液中总碘量。

空白滴定时与有还原糖存在滴定时所消耗的硫代硫酸钠之差，代表氧化Cu2+所消耗I2的量，亦即相当于被糖还原生成的Cu+数量，此Cu+的量与还原糖的量呈正比，故滴定数据的差数可以定量地代表还原糖的数量。

反应如下：

Cu2+→Cu+

＋

I－＋IO3－＋Ｈ+　→I2＋Ｈ2Ｏ

　↓

　　I－＋Cu2+→草酸钾络合↓

Na2S2O2＋I2→NaI＋Na2S4O6

（1）试管及试管架和烧杯。

（2）1ml、2ml、5ml刻度吸管及滴定管。

（3）沸水浴、恒温水浴器。

（1）1％淀粉溶液和1％蔗糖溶液。

（2）14mol·

L-1氯化钠溶液。

（3）磷酸盐缓冲溶液：

pH5.8、pH6.2、pH6.6、pH7.0、pH7.4。

（参见附录七）

（4）夏弗尔-哈德曼试剂：

取结晶硫酸铜6.5g，溶于100ml蒸馏水中，为甲液。

取酒石酸钾钠I2g、无水碳酸钠20g、碳酸氢钠25g溶于500ml蒸馏水中，为乙液。

取碘化钾10g、碘酸钾0.8g、草酸钾18g溶于（200～300）ml蒸馏水中，为丙液。

将乙液加入甲液中混匀后，再将其加入丙液中，混匀后稀释至1000ml。

（5）14mol·

L-1硫酸：

取蒸馏水约250ml，置于1000ml容量瓶内，缓缓加入比重1.84的浓硫酸28ml，随加随摇，混匀后定容至1000ml。

（6）0.0054mol·

L-1硫代硫酸钠溶液：

取硫代硫酸钠（Na2S2O3·

5H2O）约25g，溶于已沸过的蒸馏水中，稀释至1000ml。

此溶液浓度约为0.14mol·

L-1，其准确浓度用下述方法标定。

用分析天平准确称取碘酸钾（0.15～0.18）g，溶于50ml蒸馏水中，加入15％碘化钾10ml及64mol·

L-1硫酸10ml，放置3分钟后稀释至150ml。

用以上配制的硫代硫酸钠溶液滴定至溶液呈黄色时，加1％淀粉溶液5ml作指示剂，继续滴定至蓝色完全退去，即为终点，记录所用硫代硫酸钠溶液的体积。

用15％碘化钾溶液10ml作一空白滴定，用此结果校正上述滴定的结果。

用下列公式计算所配制硫代硫酸钠溶液的浓度，并将其浓度调整至0.14mol·

硫代硫酸钠的标定浓度（4mol·

L-1）＝碘酸钾的克数／所用硫代硫酸钠毫升数／碘酸钾分子量／6000。

用前取凋整好的标准0.14mol·

L-1硫代硫酸钠溶液50ml，稀释至1000ml，即为硫代硫酸钠应用液，其浓度为0.0054mol·

（7）碘液：

称取碘1g，碘酸钾2g，溶于300ml蒸馏水中。

实验内容

1、酶作用的特异性

（１）稀释唾液：

实验者先用水漱口，然后含一口蒸馏水于口中，2分钟后吐入小烧杯内，用滤纸过滤后，取滤液1ml加蒸馏水稀释至50ml，混匀。

（2）取3支试管，按下表操作

表3-2-2

试剂　　　　　　　　　　　　　管　　　　　　　　　号

（滴）　　　　　　　　　　　　　１　　　　　　　２　　　　　　　３

1％淀粉溶液　　　　　　　　　　　1010－

1%蔗糖溶液－－10

稀释唾液5（煮沸10′）55

混匀后置38℃恒温水浴中30分钟。

（3）取出各管，各加入煮沸的班氏试剂约2ml，煮沸2分钟，放试管架上冷却，观察并己录结果，解释之。

2、定量观察温度、pH、激动剂和抑制剂对酶促反应速度的影响

（1）稀释唾液：

同上。

（2）取12支试管，按下表操作。

表3-2-3

管号

试剂

01234567891011

1%淀粉溶液ml444444444444

氯化钠溶液ml　2222222222—2（CuSO4）

2ml缓冲溶液pH6.65.86.26.67.07.46.66.66.66.66.66.6

蒸馏水ml32.52.52.52.52.52.52.52.52.52.52.5

保温10分钟℃383838383838383838383838

稀释唾液ml—0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5

（3）充分混匀后，各管在原温度下继续保温20分钟。

（4）在保温期间，另取12支试管同样标号，各加入2ml夏弗尔-哈德曼试剂，保温达20分钟时，立即由各管吸取2ml分别加入上述相应号码的试管中，混匀后向各管加入液体石蜡5滴置沸水浴中15分钟，取出后冷却至室温，此过程均勿摇动。

（5）向各管中加入14mol·

L-1硫酸2ml，轻摇至不产生气泡为止，此时，管内液体应为蓝色。

若不呈蓝色，需加入淀粉溶液2～3滴作为指示剂。

（6）经2分钟后，以0.0054mol·

L-1硫代硫酸钠滴定各管至液体蓝色刚刚消退为止。

（7）滴定空白管与滴定各管所消耗硫代硫酸钠溶液之差，即相当于各管的还原糖所还原铜的数量。

以此差值为纵坐标，温度和pH为横坐标，分别绘制温度和pH对酶促反应速度影响的曲线图及激动剂和抑制剂对酶促反应速度的影响。

3、定性观察温度、pH、激动剂和抑制剂对酶促反应速度的影响。

（1）稀释唾液：

（2）取12支试管，按下表操作。

表3-2-4

（4）将各管取出，分别滴加碘液1滴，混匀后观察比较各管的颜色并记录。

思考题

1、实验中哪些条件必须准确一致？

在实际操作中应注意哪些事项？

2、影响酶促反应速度的主要因素有哪些？

实验五琥珀酸脱氢酶的作用及丙二酸的竞争性抑制作用

了解在无氧情况下观察脱氢酶作用的简单方法和酶的竞争性抑制作用。

琥珀酸脱氢酶能催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸，而与琥珀酸的化学结构相似的丙二酸，能与琥珀酸竞争酶分子的活性中心，并与之结合，从而抑制酶的活性，升高其Km值，抑制程度取决于琥珀酸和丙二酸两者的浓度比。

本实验在隔绝空气的条件下，利用甲烯蓝接受氢后退色的程度，来判断肌肉组织中琥珀酸脱氢酶的作用和丙二酸对酶活性的抑制。

（2）烧杯、乳钵、剪刀、镊子、纱布。

（3）上皿天平、恒温水浴。

（4）石英砂、冰块。

（1）0.24mol·

L-1和0.024mol·

L-1琥珀酸溶液。

（2）0.24mol·

L-1丙二酸溶液。

以上四种溶液均先用0.054mol·

L-1氢氧化钠溶液调节至pH7.0，再用0.014mol·

L-1氢氧化钠溶液调节到pH7.４，然后用蒸馏水稀释到所需浓度。

（3）0.14mol·

L-1pH7.4磷酸盐缓冲溶液。

（4）0.02％甲烯蓝溶液。

　（5）液体石蜡。

1、肌肉提取液的制备称取新鲜肌肉组织10g，剪成小碎块，放入烧杯中，用冰冷的生理盐水洗3次，再用0.14mol·

L-1pH7.4的磷酸盐缓冲液洗涤１次，弃去液体，移入置于冰块中的乳钵内，加适量的石英砂，研磨成糜状，然后加入20ml冰冷的上述缓冲液，混匀后用双层纱布过滤，滤液置冰浴中备用。

2、取5支试管，按下表操作。

表3-2-5

试剂管号

（ml）

12345

肌肉提取液30303030－

0.24mol·

L-1琉珀酸101010－10

0.024mol·

L-1L琥珀酸－——10＿

L-1丙二酸－10－10－

L-1丙二酸—－10－－

蒸馏水10－－－40

甲烯蓝44444

3、将各管摇匀，每管滴加（斜执试管，沿管壁缓缓加入）一层液体石蜡于溶液上，以隔绝空气。

然后置37℃水浴中保温，随时比较记录各管中甲烯蓝的退色情况。

　思考题

1、为什么实验中要用液体石蜡隔绝空气？

2、丙二酸对琥珀酸脱氢酶的活性有何影响？

实验六酮体的生成和氧化

1、了解酮粉法测定酮体的原理和操作。

2、验证酮体生成和氧化的部位。

实验原理

脂肪酸在肝脏中经β氧化生成的乙酰CoA，经缩合可生成乙酰乙酸，然后进一步还原成β-羟丁酸或脱羧生成丙酮。

乙酰乙酸、β羟丁酸和丙酮统称酮体。

主要在肝脏产生，被脑和肌肉组织利用。

乙酰乙酸及丙酮在碱性条件下与亚硝基铁氰化钠［Na2Fe（NO）（CN）5］反应，生成紫色化合物，该法对乙酰乙酸的反应比对丙酮灵敏15～20倍。

本实验以辛酸钾为底物，分别与肝组织、肌肉组织和肝与肌肉组织的混合物在一起保温，然后用酮粉法分别测定其酮体。

仪