生物分离工程期末复习资料Word下载.docx

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②絮凝剂浓度；

③pH;

最关键因素，影响絮凝剂活性基团的解离度。

④搅拌转速和时间。

4、发酵液预处理的法？

①凝聚和絮凝法

②加热法

③调节PH法

④加水稀释法

⑤加入助滤剂法

⑥加吸附剂法或加盐法

⑦高价态无机离子去除法

Ca2+——草酸、草酸钠→形成草酸钙沉淀

Mg2+——三聚磷酸钠（Na5P3P10）→形成三聚磷酸钠镁可溶性络合物

Fe3+——黄血盐（K4Fe（CN）6）→普士蓝淀

⑧可溶性杂蛋白的去除法

3、VB12发酵液絮凝预处理的研究

由正交试验确定影响絮凝的主要因素，结果表明，最佳絮凝条件：

絮凝剂为聚合氯化铝、加入体积分数7%，pH6、搅拌速度14r/min、搅拌时间45s。

通过加压过滤实验，得到絮凝后滤饼的过滤特性；

在此基础上，加入硅藻土助滤剂以探讨对滤饼结构和过滤速率的影响，并考察滤饼的比阻值及可压缩性。

实验表明，絮凝预处理后的滤饼为高可压缩滤饼，加入硅藻土后滤饼的比阻值降低，可压缩性系数减少到0.387过滤速率提高30%。

第三章细胞分离技术

一、填空

1.根据被分离物质颗粒的大小，可分为一般过滤和膜过滤。

2.离心分离因子Fr来定量评价离心设备的分离能力

3.离心分离法根据其操作式不同，又可分为重力沉降和密度梯度离心。

4-1细胞壁结构

微生物

革兰氏阳性细菌

革兰氏阴性细菌

酵母菌

霉菌

壁厚/nm

20-80

10-13

100-300

100-250

层次

单层

多层

主要组成

肽聚糖

（40-90%）

多糖

胞壁酸

蛋白质

脂多糖

（1-4%）

（5-10%）

脂蛋白

（11-22%）

磷脂

葡聚糖

（30-40%）

甘露聚糖

（30%）

（6-8%）

脂类

（8.5-13.5%）

多聚糖

（80-90%）

4-2革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌细胞壁结构比较

指标

金黄色葡萄球菌（G+）

大肠杆菌（G-）

肽聚糖含量

多，一般占细胞壁干重的

60%~90%

少，只占细胞壁干重的10%左右

肽聚糖层数

多，可达50层

少，只有1~2层

磷壁酸

有

无

外膜

厚度

厚，20~80nm

薄，2~3nm

强度

坚韧

疏松

5.细胞破碎效果通常用细胞破碎率来衡量。

直接测定法：

其中：

X---细胞破碎率，%

N---经t时间操作后未破碎细胞的数量，个/cm3

N0---细胞初始量，个/cm3

6.细胞破碎法：

机械破碎法、物理破碎法、化学渗透法、酶溶法。

7.机械破碎法又分为珠磨法、高亚匀浆法、超声波破碎法。

8.不宜采用高压匀浆法的微生物：

团状或丝状真菌、较小的革兰氏阳性菌、质地坚硬的亚细胞。

9.传统的化学渗透剂包括：

酸碱、盐、表面活性剂、变性剂，螯合剂、有机溶剂等。

10.冻结的目的：

为了破坏细胞膜的疏水键（膜的通透性改变）。

11.蛋白质复性法：

稀释与透析复性法、色谱复性技术、反胶束萃取复性法。

12.提高复性率的策略：

二硫键的形成、小分子添加剂、模拟体蛋白折叠过程

（共表达分子伴侣、折叠酶可提高外源蛋白的可溶性表达）、温和溶解工艺相结合提高复性率。

二．名词解释

1、离心沉降：

是利用惯性离心力和物质的沉降系数或浮力密度的不同而进行的一项分离、浓缩或提取操作。

2、超声波破碎法：

超生波破碎细胞时的频率一般为15～20kHz，功率为100～250W，可分为槽式和探头直接插入介质式两种型式。

其原理可能与空穴现象引起的冲击波和剪切作用有关。

3、蛋白质复性：

又称再折叠，是指变性蛋白质在变性剂去除或浓度降低后，就会自发地从变性的热不稳定状态向热力学稳定状态转变，形成具有生物学功能的天然结构。

第四章沉淀技术

1.蛋白质胶体具稳定性因素：

蛋白质围的水化层、蛋白质分子间的静电斥力。

2.双电层可分为：

紧密层和分散层。

3.盐析公式：

S---蛋白中溶解度，mol/L

β---盐浓度为0时，蛋白质溶解度的对数值，与蛋白质种类、温度、pH有关，与盐无关

I---离子强度

ci---离子浓度

Zi---离子化合价

Ks---盐析常数，与蛋白质和无机盐有关,与温度、pH无关

4．有机溶剂沉淀法的原理：

破坏了蛋白质表面的水化层。

5．有机溶剂沉淀法溶剂用量：

计算公式：

V=V0（S2-S1）/（100-S2）

V——需要加入100%浓度有机溶剂的体积，mL；

V0——原始溶液的体积，mL;

S2——所要求达到的有机溶剂的浓度，g/100mL；

S1——原溶液中有机溶剂的浓度，g/100mL；

100——指加入的有机溶剂的浓度为100%，

如所加入的有机溶剂浓度为95%，则（100-S2）改为（95—S2）

6.果胶提取中，乙醇沉淀法的最佳条件为：

pH3.5~4.0，沉淀时间30min，沉淀温度为25℃，以硫酸铝钾为盐析剂，其盐析最佳条件为：

PH5.8，沉淀时间30min，沉淀温度为25℃；

以三氯化铁为盐析剂，其盐析条件为：

pH4.0，沉淀时间60min，沉淀温度为60℃。

1.结晶：

同类分子或离子以有规则排列形式析出。

2.沉淀：

同类分子或离子以无规则紊乱排列形式析出。

3.分散双电层：

偏离等电点的蛋白质净电荷或正或负，成为带电粒子，在电解质溶液中吸引相反电荷的离子（简称反离子），由于热运动的影响，这些离子有离开蛋白胶粒的趋势，反离子层并非全部排布在一个面上，而是在距胶粒表面由高到低有一定的浓度分布，形成分散双电层，简称双电层。

4.盐析：

在高浓度中性盐存在的情况下，蛋白质等生物大分子在水溶液中的溶解度降低并沉淀析出的现象称为盐析。

（常用盐析剂：

硫酸铵）

5.等电点：

是两性物质在其质点的净电荷为零时介质的pH值，溶质净电荷为零，分子间排斥电位降低，吸引力增大，能相互聚集起来，沉淀析出，此时溶质的溶解度最低。

三．简答or论述

1.蛋白质沉淀法：

①盐析法

②有机溶剂沉淀法

③等电点沉淀法

④非离子多聚物沉淀法

⑤变性沉淀

⑥生成盐类复合物的沉淀

⑦亲和沉淀

2.影响盐析的因素：

①蛋白质种类相对分子质量大、结构不对称的蛋白质Ks值大，越易沉淀

②离子类型相同离子强度下，不同种类的盐对蛋白质的盐析效果不同。

③温度和pH在保持待沉淀物稳定的前提下，尽可能的接近其等电点。

盐析一般在室温下进行。

但对于温敏型生化物质，盐析最好在低温

④盐的加入式

⑤蛋白质的原始浓度一般较适当的样品浓度是2.5%-3.0%

3.以硫酸铵为例介绍盐析操作过程盐析曲线的制作步骤：

①取一部分料液，将其分成等体积的份数，冷却至0℃；

②跟据公式或者附表查料液饱和度达20%-100%所需加入硫酸铵的质量，并在搅拌条件下分别加到终了，继续搅拌1h以上，同时保持0℃，使沉淀得到平衡；

③在3000g下离心40min后，将沉淀溶于2倍体积的缓冲液中，测定其中蛋白质的总浓度和目标蛋白的浓度；

④分别测定上清液中蛋白质的总浓度和目标蛋白的浓度，比较前后蛋白质时候保持物料守恒，检测分析结果的可靠性；

⑤以饱和度为横坐标，上清液中蛋白的总浓度和目标蛋白的浓度为纵坐标作图。

4.有机溶剂沉淀法影响沉淀效果的因素：

①温度在使用有机溶剂沉淀生物高分子时，整个操作过程应在低温下进行。

②pHpH多控制在待沉蛋白质的等电点附近。

③蛋白质浓度蛋白质的初浓度以0.5～2％为好，粘多糖则以1～2％较合适。

④离子强度一般在有机溶剂沉淀时中性盐浓度以0.01～0.05mol/L为好，常用的中性盐为醋酸钠、醋酸铵、氯化钠等。

⑤多价阳离子的影响实际操作时往往先加有机溶剂除去杂蛋白，再加Ca2+、Zn2+沉淀目的产物。

第五章

一、概念

1、萃取：

利用溶质在互不相容的溶剂里的溶解度不同，用一种溶剂把溶质从它与另一种溶剂所组成的溶液中提取出来的法。

2、分配定律：

在恒温恒压条件下，溶质在互不相容的两相中达到分配平衡时，如果在两相中的相对分子质量相等，则其在两相中的平衡浓度之比为一常数，称为分配常数A。

3、萃取速率计算公式：

V=

c料液相中溶质的浓度

c*与萃取相中溶质呈平衡的料液相中溶质的浓度

k传质系数

a相间接触比表面积

4、单级萃取萃取过程中的萃余分率：

萃取分率（收率）为

5、双节线：

是两种高分子聚合物和水形成的双水体系的相图图中以聚合物Q的浓度（%，质量分数）为纵坐标，以聚合物P的浓度（%，质量分数）为纵坐标。

图中把均匀区与两相分开的曲线称为双节线。

影响因素：

相图中双节线的位置、形状与聚合物的相对分子质量有关，一般聚合物的相对分子质量越高，相分离所需要的浓度越低；

两种聚合物的相对分子质量相差越大，双节线的形状越不对称。

6、反胶团：

若将表面活性剂溶于非极性的有机溶剂中，并使其浓度超过临界胶束浓度，便会在有机溶剂形成聚集体，这种聚集体称为反胶团。

7、超临界流体：

处于超临界状态时，气液界面消失，体系性质均一，既不是气体也不是液体，呈流体状态。

二、填空

1、液液萃取类型分为单级萃取、多级错流萃取、多级逆流萃取。

2、选择有机溶剂的原则是相似相容。

3、乳化现象发生后，可能产生两种形式的乳浊液，一种是（有机相）以油滴分散在水中的水包油型（0/W）；

另一种是水以水滴分散在油中的油包水型（W/O）。

4、双水相体系的形成主要取决于两个因素：

体系熵的增加和分子间作用力。

5、在生化工程中得到广泛应用的双水相体系主要是聚乙二醇-葡萄糖体系和聚乙二醇-无机盐系统。

6、溶质能在双水相系统中，进行分配主要是受体系表面自由能和表面电荷的影响。

7.液膜分离系统的膜相通常由膜溶剂、表面活性剂、流动载体、膜增强剂构成。

8、反胶团萃取蛋白质的主要推动力是蛋白质与表面活性剂极性头间的静电相互作用。

9、乳化液膜分离的工艺流程依次为液膜制备、液膜萃取、分离浓缩、破乳。

10、液固萃取过程分为润湿、溶解、扩散和置换四个过程。

11、超临界流体的溶剂萃取能力取决于萃取的温度和压力。

12、常用的超临界流体为CO2。

13、由超临界流体的特点可知，在临界点附近（即工作区里），P上升或T下降则溶剂的ρ大幅度增加，对溶质溶解度大幅度增加，有利于溶质的萃取；

而P下降或T上升，则溶质的ρ大幅度减小，对溶质溶解度大幅度减小，有利于溶质的分离和溶剂的回收。

三、问答：

1、分配常数A在使用时应满足哪些条件？

①必须是稀溶液

②溶质对溶剂的互溶度没有影响

③溶质在两相中必须是同一分子类型，不发生缔合或解离

2、影响有机溶剂萃取的因素

①pH值影响分配系数；

影响选择性

②温度

③盐析降低溶质在水的溶解度；

减少有机溶剂在水中的溶解度

④带溶剂易溶于有机溶剂并能和溶质形成复合物，容易解离

9、青霉素G提取和部分精制流程图

发酵液

↓

冷却至10℃，滤去菌丝体

用10%硫酸调节pH值至2.0-2.2→以青霉素酸的形式存在，能溶于有机溶剂中

加入醋酸丁酯，将青霉素逆流萃取至醋酸丁酯相

利用磷酸缓冲液（pH=7）将青霉素逆流萃取至水相→青霉素盐，能溶于水

↓

用10%硫酸调节pH值，将青霉素再次逆流萃取至乙酸丁酯中

加温，加入醋酸钾，形成青霉素钾盐结晶

离心过滤，得到湿晶体

分离，洗涤，干燥

4、青霉素G的萃取过程

青霉素的提取是利用青霉素盐易溶于水，而青霉素酸易溶于有机溶剂的性质反复在溶剂相和水相中转移，达到提纯和浓缩的目的。

其萃取过程一般分为3步：

①将滤液经稀硫酸酸化（pH2.0-2.2），把青霉素G抽提到有机溶剂中；

②用pH6.8-7.2的磷酸缓冲液或碳酸氢钠水溶液，把青霉素G从有机相转移到水相中；

③在青霉素G缓冲液提取液中加稀硫酸，使Ph2.0-2.2，又把青霉素G从水相转移到有机相中。

最后经浓缩提纯后送至结晶工序。

10、影响双水相分配系数的主要因素？

①成相聚合物的相对分子质量；

②聚合物的浓度

③盐的种类

④盐的浓度

⑤pH

⑥温度

⑦细胞的浓度

11、乳化液膜分离的工艺流程

①液膜制备

②液膜萃取

③分离浓缩

④破乳

12、影响反胶团萃取的主要因素？

①水相pH决定蛋白质表面电荷的状态

②离子的种类和强度改变蛋白质的溶解性能。

演的浓度越高，影响越大；

③表面活性剂的种类和浓度选用有利于增强蛋白质表面电荷与反胶团表面电荷间的静电作用、增加反胶团大小的表面活性剂。

④溶剂体系溶剂的性质尤其是极性对反胶团的形成和大小有很大影响。

13、反胶团萃取的过程？

①溶质从水相通过表面液膜到达相界面

②在界面处溶质进入反胶团中

③含有溶质的反胶团扩散进入有机相

14、超临界流体萃取的优点？

①具有液相萃取和精馏的特点；

②萃取能力取决于流体的密度，密度容易控制；

③可在常温左右操作；

④可选择适当萃取剂或添加夹带剂；

⑤溶剂回收便，节省；

⑥常用的CO2具有很多优点

第六章膜分离过程

1.膜过程分为压力差推动膜过程、浓度差推动膜过程、电位差推动膜过程、温度差推动膜过程等。

2.压力驱动膜过程包括微滤、超滤、纳滤和反渗透等。

3.膜蒸馏过程的选择性主要依赖于组分挥发度的差异。

1.膜分离过程：

是用具有选择透过性的天然或合成薄膜为分离介质，在膜两侧的推动力（如压力差、浓度差、电位差、温度差等）作用下，原料液体混合物或气体混合物中的某个或某些组分选择性地透过膜，使混合物达到分离、分级、提纯、富集和浓缩的过程。

2.浓差极化：

较高的压力和料液浓度以及缓慢的膜面流速可造成膜表面溶质浓度高于主体浓度,形成高浓度边界层,使料液侧膜面的渗透压升高,有效压差减小。

3.截留分子量:

当截留率分别达到95%以上和90%以上时，该标准物质的分子量就是该膜的截留分子量。

4.穿透压：

膜萃取实验研究表明，两相之间保持一定的压差条件，可以避免两相之间渗透和夹带，要求不浸润膜的一相的压强高于对膜有浸润性的一项的压强，而且两项之间的压差存在临界值△pcr，若压差超过临界值，则未浸没膜的一相会穿透进入膜达到另一相，这个压差的临界值称为穿透压。

1.影响超滤和微滤过程操作的因素：

①膜污染和浓差极化

②加压过滤式

③操作压差

④料液流速

⑤截留液温度

⑦膜材料

第六章第三节P138好好看！

！

第七章

一、名词解释：

1、吸附：

溶质从液相或气相转移到固相的现象。

2、交换容量：

单位质量的干燥离子交换剂或单位体积的湿离子交换剂所能吸附的一价离子的毫摩尔数。

3、滴定曲线：

是检验和测定离子交换剂性能的重要参数。

以每克干离子交换剂加入NaOH（或HCl）为横坐标，以平衡时pH为纵坐标作图，就可得到滴定曲线。

4、吸附等温线：

溶质在吸附剂上的吸附平衡关系是指吸附达到平衡时，吸附剂的平衡吸附质浓度q*与液相游离溶质浓度c之间的关系。

一般q*是c和温度的函数即

一般吸附过程是在一定温度下进行，此时q*只是c的函数,q*与c的关系曲线称为吸附等温线。

1、常见的吸附剂有活性炭、硅胶、氧化铝、大网状吸附剂。

2、在溶液中，固体吸附剂的吸附主要考虑3种作用力：

界面层上固体与溶质之间的作用力、固体与溶剂之间的作用力、溶质与溶剂之间的作用力。

三、简答：

1、影响吸附的主要因素

①吸附剂的特性（比表面积、粒度、极性大小、活化条件）

②吸附物的性质（极性大小、分子量）

③pH（对蛋白等两性物质在PI附近吸附量最大）

④温度（对蛋白分子，一般认为T↑吸附量↑，考虑到稳定性,通常在0℃or室温操作）

⑤吸附物浓度与吸附剂用量（吸附物浓度↑，吸附量↑，吸附法纯化蛋白时，要求浓度<

1%，以增强选择性,吸附剂用量↑，吸附物总量↑，但过量吸附剂导致成本↑，选择性↓）

2、影响交换速度的因素

①颗粒大小：

愈小越快

②交联度：

交联度小，交换速度快

③温度：

越高越快

④离子化合价：

化合价与高，交换越快

⑤离子大小：

越小越快

⑥搅拌速度：

在一定程度上，越大越快

⑦溶液浓度：

当交换速度为外扩散控制时，浓度越大，交换速度越快

3、影响离子交换选择性的因素

①水合离子半径；

半径越小，亲和力越大

②离子化合价；

高价离子易于被吸附

③溶液pH；

影响交换基因和交换例子的解离程度，但不影响交换容量

④离子强度；

越低越好

⑤有机溶剂；

不利于吸附

⑥交联度、膨胀度、分子筛；

交联度大、膨胀度小，筛分子能力增大；

交联度小、膨胀度大，吸附量减少。

⑦树脂与粒子间的辅助力：

除静电力以外，还有氢键和德华力等辅助力

第八章

1、流动相：

在色谱过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个向移动的液体、气体或超临界流体。

2、分配系数：

在一定条件下，某种组分在固定相和流动相中含量（浓度）的比值。

3、阻滞因素:

又称迁移率，指在一定条件下，在相同的时间某一组分在固定相移动的距离与流动相本身移动的距离之比值。

4、洗脱容积：

在色谱分离中，使溶质从柱中流出时所通过的流动相的体积

5、吸附薄层色谱法:

将吸附剂均匀地铺在一块玻璃上，形成薄薄的平面涂层，干燥后在涂层的一端点样，竖直放入一个盛有少量展开剂的有盖容器中，展开剂接触到吸附剂涂层，借毛细作用向上移动形成薄层色谱，使混合物得以分离。

6、特异性洗脱：

用能与配基可待分离物质发生更强特异性亲和作用的小分子化合物作为洗脱剂，通过与配基可目标产物竟争性结合，使配基与目标产物解吸的洗脱式。

7、非特异性洗脱：

改变洗脱液的pH、离子强度、离子种类或温度等物化性质，降低目标产物与配基之间亲和作用的洗脱法。

1、色谱系统由固相定相、流动相、泵系统和在线检测系统组成。

2、正相色谱是指固定相的极性高于流动相的极性。

非极性分子或极性小的分子比极性大的分子移动速度快，先从柱中流出来。

3、反相色谱是指固定相的极性低于流动相的极性，在这种色谱过程中，极性大的分子比极性小的分子移动速度快，而先从柱中流出。

4、根据分离原理的不同，色谱主要可以分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶过滤色谱、亲和色谱

5、色谱系统的操作法：

装柱、平衡、上样量和上样体积、洗脱、流速及控制、分部收集、检测和合并收集、洗脱峰纯度鉴定、脱盐和浓缩。

6、离子交换色谱反应过程，包括吸附、吸收、穿透、扩散、离子交换、离子亲和等物理化学过程。

三、论述:

1、重组人尿激酶原的生产工艺

尿激酶原（pro-UK）亦称单链尿激酶，是双链尿激酶的前体，由于其具有选择性的溶栓作用，引起了人们很大的兴趣，它是当前很有希望的溶栓药物之一。

通过基因重组技术构建了可生产人尿激酶原的基因工程细胞（如大肠杆菌、哺乳动物、酵母、昆虫等细胞）。

大量培养生产尿激酶原过程中，纯化工艺包括快流速磺酸型琼脂糖凝胶珠、CM-纤维素阳离子交换色谱、对氨基苯甲脒-Sepharose-6B亲和色谱、磺酸型阳离子交换快速蛋白质液相色谱（mono-SFPLC）等。

以大肠杆菌细胞生产尿激酶原的生产工艺为:

菌种复→LB琼脂平板→摇瓶种子培养→种子罐发酵→生产罐发酵→菌体分离与破碎→包涵体回收与活化→CM离子交换色谱→分子筛色谱→AffipolymyxinSupport亲和色谱→hpro-UK精制溶液→冷冻干燥→重组人尿激酶原原料药→制剂配制→罐装→冷冻干燥→注射用重组人尿激酶原。

其中包涵体的复性处理是制造工艺的关键。

基于hpro-UK的分子质量，可先用截流相对分子质量30000的超滤膜对hpro-UK活化液进行透析；

利用其碱性蛋白的特点，先用CM-纤维素阳离子交换色谱，再用分子筛色谱，以除大分子质量杂质和小肽；

最后用AffipolymyxinSupport亲和色谱，可有效地去除样品中的热源，获得hpro-UK精制溶液。

进一步透析去盐，冷冻干燥，获得hpro-UK原料药。

2、重组CHO细胞乙型肝炎疫苗的生产工艺

国生产重组CHO细胞乙肝疫苗所用的细胞种子为重组CHO细胞C28株，该株系利用DNA操作技术将编码HBsAg的基因拼接如CHO细胞染色体中而获得。

静止或旋转培养细胞，待表达HBsAg含量达到1.0mg/g以上时收获培养液，培养液用离心机进行澄清处理后，可采用三步色谱法提纯HBsAg。

培养上清液经过以Butyl-S-SepharoseFF为介质的疏水作用色谱（HIC）、以DEAE-SepharoseFF为介质的阳离子交换色谱（IEC）和过以Sepharose4FF为介质的凝胶过滤色谱（GFC）制得精制的HBsAg。

按上述法纯化获得的HBsAg加入终浓度为1：

4000甲醛于37℃保温72h，再经超滤、浓缩及除菌过滤后得到原液，原液吸附Al（OH）3佐剂并加入防腐剂为半成品，经分包装即为成品。

第九章

一、填空：

1、制备超离心技术分离和纯化生物样品用三种法：

差速离心法、差速-区带离心法、等密度梯度离心法。

二、名词解释：

1、沉降速率：

在强大离心力的作用下，单位时间物质运动的距离。

2、沉降系数：

单位离心力作用下粒子的沉降速率。

3、等密度离心法：

被分离的不同粒子的密度在