组织培养实验指导书.docx
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组织培养实验指导书
实验一组培器皿及器械的洗涤、灭菌及环境的消毒
一、实验目的
通过实验,使学生了解并掌握组织培养用实验器皿及器械的洗涤、灭菌,环境的消毒方法。
二、实验原理
实验仪器及器械的清洗、消毒和灭菌是组织培养成功的关键所在,是外植体免受污染的前提。
由于灭菌剂的种类不同,所以选择消毒剂既要考虑良好的消毒、杀菌作用,同时易被蒸馏水冲洗掉。
无菌的环境是植物组织培养成功的前提,因为绝大多数操作程序要求在无菌条件下进行。
三、实验操作步骤
(一)器皿与用具的洗涤
1、玻璃器皿的洗涤
新购置的玻璃器皿或多或少都含有游离的碱性物质。
使用前要先用1%稀HCL浸泡一夜,再用肥皂水洗净,清水冲洗后,再用蒸馏水冲洗1次,晾干后备用。
用过的玻璃器皿,用清水冲洗,蒸馏水冲洗一次,干后备用即可。
对于已被污染的玻璃器皿则必须在高压蒸汽灭菌后,倒去残渣,用毛刷刷去瓶壁上的培养液和病斑后,再用清水冲洗干净,蒸馏水冲淋一遍,晾干备用,切忌不可用水直接冲洗,否则会造成培养环境的污染。
清洗后的玻璃器皿,瓶壁应透明发亮,内外壁水膜均一,不挂水珠。
2、金属用具的洗涤
新购置的金属用具表面上有一层油腻,需擦净油腻后再用热肥皂水洗净,清水冲洗后,擦干备用。
用过的金属用具,用清水洗净,擦干备用即可。
3、每人清洗部分玻璃器皿
清水洗净→浸入洗衣粉溶液中洗刷→清水反复冲洗→蒸馏水淋一遍→烘干备用。
对于较脏玻璃器皿的洗涤:
采用先碱后酸的方法,即用洗衣粉洗刷后冲洗干净→晾干→浸入酪酸洗液(一种强氧化剂,去污能力强,配制方法:
重铬酸钾40克,溶解在500ml在水中,然后徐徐加入450ml粗制浓硫酸),浸泡时间视器皿的肮脏程度而定→清水反复冲洗干净→蒸馏水淋洗一遍→烘干备用。
对于带有石蜡或胶布的器皿:
先将其除去,再用常规洗涤,石蜡用水煮沸数次即可去掉,胶布粘着物则需用洗衣粉液煮沸数小时,再用水冲洗,凉干后浸入洗液,以后的步骤同前。
(二)玻璃器皿、用具及环境的灭菌
1、玻璃器皿和用具的灭菌
(1)采用干热灭菌法:
将洗干净晾干后的培养皿、三角瓶、吸管等玻璃用具和解剖针、解剖刀、镊子等金属器具,用纸包好,放进电热烘干箱,当温度升至100℃时,启动箱内鼓风机,使电热箱内的温度均匀。
当温度升至150℃时,定时控制40min(或120℃定时120min),达到灭菌目的。
(2)采用高压蒸汽灭菌法:
即用手提式高压灭菌锅,在1.2个大气压下保持15~20分钟。
有些如聚丙烯、聚甲基戊烯等类型的塑料用具也可以进行高温消毒。
(3)灼烧灭菌:
用于无菌操作的镊子、解剖刀等用具除高压蒸汽灭菌外,在接种过程中还常常采用灼烧灭菌,将镊子、解剖刀等从浸入95%酒精中取出,置于酒精灯火焰上灼烧,借助酒精瞬间燃烧产生高热来达到杀菌等目的。
操作过程中要反复浸泡、灼烧、放凉、使用,操作完毕后,用具应擦拭干净后再放置。
2、环境的消毒
(1)地面、墙壁和工作台的灭菌
每次使用前,将配好的20%新洁尔灭(苯扎溴铵)溶液倒入喷雾器中,对接种室地面、墙壁、角落均匀地喷雾。
在喷房顶时间,注意不要让药液滴入眼睛。
然后开启紫外灯开关,照射15~30min,一般紫外线消毒后不要立即进入,应在关闭紫外灯15-20min后进入室内。
(2)无菌室和培养室的灭菌
消毒灭菌的方法:
首先将房子关闭,定期用甲醛和高锰酸钾2:
1的比例定期熏蒸灭菌24h或用70%的酒精或0.5%苯酚喷雾降尘和消毒。
操作时要戴好口罩和手套,用甲醛与高锰酸钾配比时要注意避开烟雾,封闭消毒期间不宜进入消毒空间。
三、实验报告
1.将本次实验内容整理成实验报告。
2.试阐述为什么要对器皿和用具进行严格的洗涤和灭菌?
实验二培养基母液的配制与保存(MS培养基)
一、实验目的
通过学习MS培养基母液的配制与保存,掌握培养基母液浓度的换算、配制与母液的保存方法。
二、实验原理
培养基制备之前,为了使用方便和用量准确,常常将大量元素、微量元素、铁盐、有机物类、激素类分别配制成比培养基配方需要量大若干倍的母液。
当制备培养基时,只需要按预先计算好的量吸取母液即可。
三、实验仪器、用具及试剂
(一)实验仪器、器皿及用具
电子天平(感量为0.0001g、0.01g),烧杯(1000ml,100ml,50ml)、量筒(1000ml,100ml,50ml)、容量瓶(1000ml,500ml,200ml,100ml,50ml)、棕色或白色广口瓶(1000ml,500ml,200ml,100ml)、药匙、玻璃棒、称量纸、标签、冰箱。
(二)试剂
MS培养基所需各种试剂、IAA、IBA、NAA、6-BA、2,4-D、GA3、KT、蒸馏水、重蒸馏水。
四、实验步骤与方法
母液的配制是按所使用药品的类别,而分别配成大量元素、微量元素、维生素、钙盐、镁盐和铁盐等。
配制母液时特别要注意无机盐成分在一起,可能产生的化学反应,如Ca2+和SO42-,Ca2+,Mg2+和PO43-一起溶解后,会产生硫酸钙或磷酸钙的不溶物沉淀,因此不能配在一起作母液贮存,应分别配制和保存。
配制母液时要用双重蒸馏水等纯度较高的水,药品应采用化学纯或分析纯级,药品的称量及定容都要准确,各种药品先以少量蒸馏水使其充分溶解,然后按培养基上的排列顺序混合。
现以MS培养基(Murashige和Skoog,1962)为例叙述如下:
(一)、大量元素母液(浓缩10倍)的配制
MS培养基配方中大量元素共有5种(表1-1),按照培养基配方的用量,各种化合物扩大10倍,用电子天平分别称好,分别用50ml烧杯称量,加30-40ml蒸馏水溶解。
5种化合物分别充分溶解后,按顺序混合定容在1000ml量筒中,注意在混合定容时,一定要最后加入氯化钙,因为氯化钙与磷酸二氢钾形成磷酸三钙,磷酸钙之类是不溶于水的沉淀(也可将钙盐与镁盐单独配成母液存放),将配好的定容溶液倒入1000ml广口瓶中,贴好标签保存于冰箱的冷藏室中。
配置培养基时,每配1L培养基取此母液100ml。
表1-1Murashige和Skoog大量元素的称量及定容
化合物名称
培养基配方用量(mg/L)
扩大10倍称量(mg)用于定容
KNO3
1900
19000
NH4NO3
1650
16500
MgSO4·7H2O(无水MgSO4)
370(190)
3700(1900)
KH2PO4
170
1700
CaCl2·2H2O(无水CaCl2)
440(330)
4400(3300)
(二)、微量元素母液(浓缩100倍)的配制
MS培养基配方中微量元素共有7种(表1-2),按表中称取用量,用感量为0.0001g电子天平,分别称取后,均放入1000ml的一个烧杯中,加蒸馏水溶解,然后定容到1L容量瓶。
贴好标签,放入冰箱保存。
配置培养基时,每配制1L培养基取此母液10ml。
表1-2微量元素母液各化合物用量
化合物名称
培养基配方用量(mg/L)
扩大100倍称量(mg)用于定容
MnSO4·4H2O(MnSO4·H2O)
22.3(16.9)
2230(1690)
ZnSO4·7H2O
8.6
860
CuSO4·5H2O
0.025
2.5
H3BO3
6.2
620
Na2MoO4·2H2O
0.25
25
KI
0.83
83
CoCl2·6H2O
0.025
2.5
(三)、铁盐母液(浓缩200倍)的配制
目前常用的铁盐是硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠的螯合物,必须单独配成母液。
这种螯合物使用起来方便,比较稳定,又不易发生沉淀。
配制方法是:
用感量为0.01g的电子天平称取硫酸亚铁2.78g和乙二胺四乙酸二钠3.73g分别溶解在200ml蒸馏水中,两种溶液混合定容至500ml,用棕色广口瓶盛装,贴标签,放入冰箱保存。
注意:
两种盐用热水分别溶解,然后混合,放置于室温下10小时以上看是否有沉淀产生,然后才能使用。
配置培养基时,每配制1L培养基取此母液5ml。
(四)、有机物母液(浓缩100倍)的配制
在MS培养基中,有机物配方成份有维生素和氨基酸(表1-3)。
按表1-3中的用量用电子天平进行称量,分别溶解,混合定容至100ml。
贴标签,放入冰箱保存。
配置培养基时,每配制1L培养基取此母液10ml。
表1-3有机物母液的称量
化合物名称
培养基配方用量(mg/L)
扩大100倍称量(mg)
VB1(硫胺素)
0.4
4.0
VB5(盐酸吡哆醇)
0.5
5.0(NaOH溶解)
VB6(烟酸)
0.5
5.0(NaOH溶解)
肌醇
100
1000
甘氨酸
2
20
(五)、生长调节物质(激素)母液的配制(浓度1mg/ml)
激素的使用比较灵活,要根据培养的植物种类和目的而定。
为了操作方便,节约时间,激素也可如同配制上述母液一样,先配成浓缩母液(1mg/ml),这样配制培养基时只要稍加计算,按需要量取即可。
生长调节物质一般不溶于水,可先用少量不同的溶剂来溶解。
例如,萘乙酸(NAA),吲哚乙酸(IAA),赤霉素(GA3),2,4-D等生长素和玉米素(Ze)可先用少量95%酒精助溶,然后再加蒸馏水定容至刻度。
激动素(KT)和6-苄基嘌呤(6-BA)可先溶于少量1mol/L的盐酸中,叶酸需用少量稀氨水溶解(见附表2)。
用电子天平分别称量各种生长调节物质50mg,并先用相应的少量有机溶剂进行助溶,再加蒸馏水定容至50ml,可得到浓度为1mg/ml的生长调节物质母液,即配制的母液每毫升含有生长调节物质1.0mg。
贴好标签,写明配制的激素浓度,存于冰箱保存(0~4℃)。
配制培养基时,如每升(1000ml)需添加的生长调节剂物质为0.5mg时,则取0.5ml母液即可。
注意:
各种母液配制好后应存放在4℃冰箱中,使用中防止污染和沉淀(贮存温度过低时会产生针状结晶),发现有沉淀或霉团时,则不能继续使用。
五、实验报告
1、将本次实验内容整理成实验报告。
2、制备母液时应注意哪些问题?
为什么?
3、根据所给母液浓度、蔗糖、琼脂用量、PH值,按MS配方计算各种母液吸取量,填入下表:
表1-5按MS配方需要量和母液浓度计算各种母液吸取量并填入下表
药品名称
MS配方需要量
母液浓度
配制培养基母液吸取量/ml
1000ml
500ml
300ml
大量元素
10倍液
微量元素
1000倍液
铁盐
5ml/L
VB1(硫胺素)
0.4mg/L
1mg/L
VB6(烟酸)
0.5mg/L
1mg/L
VB5(盐酸吡哆醇)
0.5mg/L
1mg/L
甘氨酸
2mg/L
2mg/L
肌醇
100mg/L
20mg/L
2,4-D
0.5mg/L
1mg/L
KT
1mg/L
0.5mg/L
蔗糖
20g/L
琼脂
8g/L
PH值
5.8
实验三MS固体培养基的配制及灭菌
一、实验目的
通过MS培养基的配制,学习培养基配制与灭菌的操作方法。
二、实验原理
植物材料培养要获得成功,并正常生长,培养基的组成成分是一个决定性因素,不同植物要求不同的培养基,因此,在进行大量工作之前,对不同培养基应进行分析、比较、试验,选择一个符合实验材料需要的适宜培养基。
大多数植物组织培养所用的培养基由无机营养物质、碳源、维生素、生长调节物质和有机附加物等五类物质组成。
三、实验仪器、用具及试剂
(一)实验仪器、器皿及用具
移液管(枪)、量筒(5