化妆品微生物检验方法Word文档下载推荐.docx
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4、4 若只有一个样品而同时需做多种分析，如细菌、毒理、化学等,则宜先取出部分样品做细菌检验，再将剩余样品做其它分析。
4、5 在检验过程中，从打开包装到全部检验操作结束,均须防止微生物得再污染与扩散,所用器皿及材料均应事先灭菌，全部操作应在无菌室内进行，或在相应条件下，按无菌操作规定进行。
４、6 如检出粪大肠菌群或其它致病菌，自报告发出之日起该菌种及被检样品应保存一个月。
5、供检样品得制备
5、1 液体样品
５、1、1 水溶性得液体样品,可量取10ｍL加到90mL灭菌生理盐水中，如样品少于10mL,仍按10倍稀释法进行.如为5mＬ则加到45mL灭菌生理盐水中,混匀后制成1:
10检液。
5、1、2 油性液体样品,取样品1０mL,先加5mL灭菌液体石蜡混匀,再加1０mL灭菌得吐温8０,在40℃~4４℃水浴中充分混合，制成１：
5、3固体样品
称取10g,加到９０ｍL灭菌生理盐水中，充分振荡混匀，使其分散混悬，静置后,取上清液作为1：
１0得检液。
如有均质器，上述水溶性膏、霜、粉剂等，可称10g样品加入90ｍL灭菌生理盐水，均质1ｍin～2mｉn；
疏水性膏、霜及眉笔、口红等，称1０g样品，加入１0mL灭菌液体石蜡,10mL吐温80，70mＬ灭菌生理盐水,均质3min~5min。
二、菌落总数
本规范规定了化妆品中菌落总数得检验方法。
本规范适用于化妆品菌落总数得测定.
2、定义
本规范采用下列定义
菌落总数（Ａerobiｃbacterｉａｌ counｔ）就是指化妆品检样经过处理,在一定条件下培养后（如培养基成分、培养温度、培养时间、pＨ值、需氧性质等），1g（1mL）检样中所含菌落得总数。
所得结果只包括一群本方法规定得条件下生长得嗜中温得需氧性菌落总数。
测定菌落总数便于判明样品被细菌污染得程度，就是对样品进行卫生总评价得综合依据。
3、仪器与设备
3、1三角瓶,250mＬ。
3、2量筒，２00mL。
3、3 pH计或精密pH试纸。
３、4 高压灭菌器.
3、5 试管：
15×
150ｍｍ。
3、６ 灭菌平皿:
直径9cm。
3、7 灭菌刻度吸管，1０mＬ、1mＬ。
３、8 酒精灯.
3、９恒温培养箱：
36℃±
1℃。
3、10放大镜.
4、培养基与试剂
4、１ 生理盐水:
见总则中3、１.
4、2卵磷脂、吐温80－营养琼脂培养基
4、2、１
成分:
蛋白胨 20g
牛肉膏 3g
氯化钠 ５g
琼脂 １５g
卵磷脂 １g
吐温80 7g
蒸馏水 1000ｍＬ
４、2、2 制法:
先将卵磷脂加到少量蒸馏水中,加热溶解,加入吐温80,将其她成分（除琼脂外）加到其余得蒸馏水中，溶解。
加入已溶解得卵磷脂、吐温８0,混匀,调pH值为7、1~7、4，加入琼脂，１03、４3kPa（１21℃15lb）20ｍin高压灭菌,储存于冷暗处备用。
４、３ 0、5％氯化三苯四氮唑（2，3，５-tｒiphenyｌteｒazｏｌiｕmcｈｌoｒide,TTＣ）
TＴC 0、5ｇ
蒸馏水 １０0０ｍL
溶解后过滤,１0３、43kＰa （１２1℃15lb）2０min高压灭菌，装于棕色试剂瓶，置4℃冰箱备用。
５、操作步骤
5、1 用灭菌吸管吸取1:
１0稀释得检液2mＬ，分别注入到两个灭菌平皿内,每皿1mＬ。
另取1ｍL注入到9mＬ灭菌生理盐水试管中（注意勿使吸管接触液面），更换一支吸管，并充分混匀，制成1：
10０检液。
吸取２mL，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿1ｍL。
如样品含菌量高，还可再稀释成1：
10００，1:
10０0０，……等,每种稀释度应更换1支吸管.
５、2 将融化并冷至45℃~50℃得卵磷脂吐温80营养琼脂培养基倾注到平皿内，每皿约15mL，随即转动平皿，使样品与培养基充分混合均匀，待琼脂凝固后，翻转平皿,置36℃±
1℃培养箱内培养４8h±
2h。
另取一个不加样品得灭菌空平皿,加入约15mL卵磷脂吐温８0营养琼脂培养基,待琼脂凝固后，翻转平皿,置3６℃±
１℃培养箱内培养4８h±
2ｈ，为空白对照.
5、３ 为便于区别化妆品中得颗粒与菌落，可在每10０ｍL卵磷脂吐温8０营养琼脂中加入1mL０、５%得TＴC溶液，如有细菌存在,培养后菌落呈红色，而化妆品得颗粒颜色无变化。
6.菌落计数方法
先用肉眼观察，点数菌落数，然后再用放大5倍～10倍得放大镜检查，以防遗漏.记下各平皿得菌落数后，求出同一个稀释度各平皿生长得平均菌落数。
若平皿中有连成片状得菌落或花点样菌落蔓延生长时,该平皿不宜计数。
若片状菌落不到平皿中得一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半个平皿菌落计数后乘以2，以代表全皿菌落数。
7、菌落计数及报告方法
7、1首先选取平均菌落数在30个～３０0个之间得平皿，作为菌落总数测定得范围。
当只有一个稀释度得平均菌落数符合此范围时，即以该平皿菌落数乘其稀释倍数（见表１中例1）.
7、2若有两个稀释度,其平均菌落数均在30个～3００个之间，则应求出两菌落总数之比值来决定，若其比值小于或等于2，应报告其平均数,若大于2则报告其中稀释度较低得平皿得菌落数（见表1中例2及例3）。
7、3若所有稀释度得平均菌落数均大于3０0个，则应按稀释度最高得平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表１中例4）。
7、4 若所有稀释度得平均菌落数均小于30个,刚应按稀释度最低得平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表１中例５）。
7、５若所有稀释度得平均菌落数均不在30个~３０0个之间,其中一个稀释度大于300个,而相邻得另一稀释度小于3０个时,则以30或300得平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表1中例6）.
7、6若所有得稀释度均无菌生长，报告数为每g或每mL小于10 CFU。
7、７菌落计数得报告，菌落数在10以内时，按实有数值报告之，大于１00时,采用二位有效数字，在二位有效数字后面得数值，应以四舍五入法计算.为了缩短数字后面零得个数,可用１0得指数来表示（见表１报告方式栏）。
在报告菌落数为“不可计"
时，应注明样品得稀释度。
表1细菌计数结果及报告方式
例次
不同稀释度平均菌落数
两稀释度
菌数之比
菌落总数
（CFＵ/ｍL或CFU/g）
报告方式
（CＦU／mＬ或CFＵ／g）
1０-1
10－２
10-3
1
136５
16４
20
——
1６4０0
1６000或1、６×
104
2
２7６0
２9５
46
１、６
38000
３8000或3、8×
１04
３
289０
２71
60
2、2
27１０0
2７00０或2、７×
4
不可计
４650
5１3
5
或5、１×
１０5
５
27
１１
270
270或2、7×
102
6
３05
１２
-—
3０5０0
31000或3、１×
7
＜1×
10
<
１×
１０
＊CＦU：
菌落形成单位。
三、粪大肠菌群
本规范规定了化妆品中粪大肠菌群得检验方法.
本规范适用于化妆品中粪大肠菌群得检验。
粪大肠菌群（Fecａlcolｉforms）系一群需氧及兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌,在44℃±
0、5℃培养24h～48h能发酵乳糖产酸并产气.
该菌直接来自粪便，就是重要得卫生指标菌。
3、仪器
３、1 恒温水浴箱或隔水式恒温箱:
44℃±
0、5℃.
３、2 温度计.
３、3显微镜。
３、4 载玻片。
3、5接种环。
3、6 电磁炉。
3、7三角瓶，250mＬ。
3、８ 试管：
１5×
150mｍ。
3、9 小倒管.
3、１0 pＨ计或ｐH试纸.
３、１１高压灭菌器。
３、１2灭菌吸管，10mL、1ｍL。
3、１３ 灭菌平皿:
直径90mｍ.
4、1 双倍乳糖胆盐（含中与剂）培养基
蛋白胨 ４0g
猪胆盐 １0g
乳糖 10ｇ
0、4％溴甲酚紫水溶液 ５ｍL
卵磷脂 2g
吐温80 14ｇ
蒸馏水 100０mL
制法：
将卵磷脂、吐温８0溶解到少量蒸馏水中.将蛋白胨、猪胆盐及乳糖溶解到其余得蒸馏水中,加到一起混匀，调pH到7、4,加入0、4%溴甲酚紫水溶液，混匀,分装试管（每支试管中加一个小倒管）。
68、95kPａ（115℃10 lb）20mｉn高压灭菌.
4、2伊红美蓝（ＥMB）琼脂
蛋白胨 １0ｇ
乳糖 10g
磷酸氢二钾 2g
琼脂 2０g
2％伊红水溶液 20mL
0、5%美蓝水溶液 1３mL
蒸馏水 1000mL
先将琼脂加到９00mL蒸馏水中，加热溶解,然后加入磷酸氢二钾、蛋白胨，混匀,使之溶解.再以蒸馏水补足至1000ｍL。
校正pH值为7、2～7、4，分装于三角瓶内，10３、43kPa （12１℃ 1５ ｌb）１5miｎ高压灭菌备用。
临用时加入乳糖并加热融化琼脂.冷至6０℃左右无菌操作加入灭菌得伊红美蓝溶液,摇匀。
倾注平皿备用。
4、３ 蛋白胨水（做靛基质试验用）
蛋白胨（或胰蛋白胨） 20g
氯化钠 5g
蒸馏水 1000mＬ
将上述成分加热融化,调pＨ值为7、0～７、2、分装小试管，１03、４3kPa （121℃ 15 lb）15min高压灭菌。
4、4 靛基质试剂
柯凡克试剂:
将5ｇ对二甲氨基苯甲醛溶解于７５mL戊醇中，然后缓慢加入浓盐酸25mL。
试验方法：
接种细菌于蛋白胨水中,于4４℃±
0、5℃培养24h±
沿管壁加柯凡克试剂0、3ｍＬ～０、５mL，轻摇试管。
阳性者于试剂层显深玫瑰红色。
注:
蛋白胨应含有丰富得色氨酸,每批蛋白胨买来后,应先用已知菌种鉴定后方可使用。
4、5 革兰氏染色液：
4、5、１染液制备
4、5、１、1结晶紫染色液：
结晶紫 1g
95％乙醇 ２０ｍL
１％草酸铵水溶液 80ｍL
将结晶紫溶于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。
4、５、1、2 革兰氏碘液：
碘 1g
碘化钾 ２g
蒸馏水加至 300mL
将碘与碘化钾先进行混合,加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后,再加蒸馏水至300mL.
4、５、１、3 脱色液：
95％乙醇。
4、５、1、4 复染液:
（1）沙黄复染液：
沙黄 0、25g
９５%乙醇 １０mL
蒸馏水 ９0mL
将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。
（２）稀石碳酸复红液：
称取碱性复红10ｇ，研细，加９5％乙醇1０0mＬ，放置过夜，滤纸过滤。
取该液10ｍL,加5%石碳酸水溶液９0ｍＬ，混合,即为石碳酸复红液。
再取此液１0mＬ加水９０mL，即为稀石碳酸复红液。
4、5、2染色法
4、5、２、1 将涂片在火焰上固定,滴加结晶紫染色液，染1ｍｉn,水洗.
4、5、2、2滴加革兰氏碘液，作用１ｍin，水洗。
４、5、2、３滴加95％乙醇脱色,约30s，或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇滴满整个涂片，脱色10s，水洗.
4、5、２、4 滴加复染液,复染1mｉn，水洗,待干,镜检.
4、5、3染色结果
革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。
如用１：
１0稀释石碳酸复红液做复染，复染时间仅需１0ｓ。
5、1取10mL1:
10稀释得检液，加到10mL双倍乳糖胆盐（含中与剂）培养基中，置4４℃±
0、5℃培养箱中培养2４ｈ~４８h，如不产酸也不产气，则报告为粪大肠菌群阴性。
5、2如产酸产气，则划线接种到伊红美蓝琼脂平板上,置３６℃±
1℃培养18h～２4h。
同时取该培养液1～２滴接种到蛋白胨水中，置４4℃±
0、5℃培养2４ｈ±
经培养后，在上述平板上观察有无典型菌落生长。
粪大肠菌群在伊红美蓝琼脂培养基上得典型菌落呈深紫黑色，圆形，边缘整齐,表面光滑湿润,常具有金属光泽.也有得呈紫黑色，不带或略带金属光泽，或粉紫色，中心较深得菌落，亦常为粪大肠菌群，应注意挑选.
5、3挑取上述可疑菌落,涂片做革兰氏染色镜检。
5、4在蛋白胨水培养液中，加入靛基质试剂约0、5ｍL，观察靛基质反应。
阳性者液面呈玫瑰红色；
阴性反应液面呈试剂本色。
6、检验结果报告
根据发酵乳糖产酸产气,平板上有典型菌落，并经证实为革兰氏阴性杆菌,靛基质试验阳性,则可报告被检样品中检出粪大肠菌群。
四、铜绿假单胞菌
本规范规定了化妆品中铜绿假单胞菌得检验方法.
本规范适用于化妆品中铜绿假单胞菌得检验。
本规范采用了下列定义
铜绿假单胞菌（Pｓeuｄomonaｓaeruginosa）属于假单胞菌属，为革兰氏阴性杆菌，氧化酶阳性，能产生绿脓菌素。
此外还能液化明胶,还原硝酸盐为亚硝酸盐,在42℃±
1℃条件下能生长.
该菌对人有致病力,可使伤处化脓,引起败血症等。
3、1 培养箱:
４2℃±
１℃、3６℃±
１℃.
3、2 三角瓶，2５0mL.
３、3 试管：
150mm。
3、4灭菌平皿：
直径９0ｍm。
3、５灭菌刻度吸管，10ｍL、１mL.
3、６ 显微镜。
3、7载玻片。
３、8接种针,接种环。
3、9 电磁炉。
3、１0 高压灭菌器.
４、培养基与试剂
４、１ SCＤLＰ 液体培养基
见总则中3、2。
4、２ 十六烷基三甲基溴化铵培养基
牛肉膏 ３ｇ
蛋白胨 10g
氯化钠 5ｇ
十六烷基三甲基溴化铵 0、3g
琼脂 20g
蒸馏水 100０mＬ
除琼脂外，将上述成分混合加热溶解，调ｐH为7、4～7、6，加入琼脂，68、９5kPa（115℃10lb）2０ｍin灭菌后，制成平板备用。
４、3 乙酰胺培养基
乙酰胺 1０、0g
氯化钠 5、0g
无水磷酸氢二钾 1、39ｇ
无水磷酸二氢钾 0、７3ｇ
硫酸镁（ＭｇSO4、7H2O） ０、5g
酚红 0、0１２g
琼脂 20g
蒸馏水 １0０0mL
除琼脂与酚红外，将其它成分加到蒸馏水中,加热溶解,调pH为7、２，加入琼脂、酚红，103、43ｋPａ（121℃１5 lb）20min高压灭菌后，制成平板备用。
4、4绿脓菌素测定用培养基
蛋白胨 20g
氯化镁 1、4g
硫酸钾 1０ｇ
琼脂 18g
甘油（化学纯） 1０g
蒸馏水 １000mL
将蛋白胨、氯化镁与硫酸钾加到蒸馏水中，加温使其溶解,调ｐH至7、4,加入琼脂与甘油，加热溶解,分装于试管内,68、9５ｋＰa（115℃ 1０ lb）20ｍin高压灭菌后，制成斜面备用。
4、5 明胶培养基
牛肉膏 ３ｇ
蛋白胨 5g
明胶 １２0g
蒸馏水 10０0mL
取各成分加到蒸馏水中浸泡２0ｍiｎ,随即搅拌加温使之溶解,调pＨ至７、4，分装于试管内，经68、95kPa（115℃1０ lb）２0min高压灭菌后,直立制成高层备用.
4、6 硝酸盐蛋白胨水培养基
蛋白胨 １０ｇ
酵母浸膏 3g
硝酸钾 2g
亚硝酸钠 ０、5g
蒸馏水 １00０mL
将蛋白胨与酵母浸膏加到蒸馏水中,加热使之溶解,调pH为7、2,煮沸过滤后补足液量，加入硝酸钾与亚硝酸钠,溶解混匀,分装到加有小倒管得试管中，６8、95ｋPa（１1５℃10lb）２0min高压灭菌后备用。
４、7 普通琼脂斜面培养基
蛋白胨 10g
牛肉膏 3ｇ
氯化钠 5ｇ
琼脂 １５g
蒸馏水 10００mＬ
除琼脂外，将其余成分溶解于蒸馏水中,调pＨ为7、2～７、4,加入琼脂,加热溶解，分装试管,103、４3kPa（12１℃15ｌｂ）20min高压灭菌后，制成斜面备用。
5、操作步骤
５、１ 增菌培养:
取１:
１0样品稀释液10mL加到90mLSＣDLP液体培养基中,置36℃±
1℃培养18h～24ｈ。
如有铜绿假单胞菌生长,培养液表面多有一层薄菌膜,培养液常呈黄绿色或蓝绿色。
5、２ 分离培养:
从培养液得薄膜处挑取培养物，划线接种在十六烷三甲基溴化铵琼脂平板上，置36℃±
1℃培养１８h～24ｈ。
凡铜绿假单胞菌在此培养基上，其菌落扁平无定型,向周边扩散或略在蔓延，表面湿润，菌落呈灰白色,菌落周围培养基常扩散有水溶性色素，此培养基选择性强，大肠埃希氏菌不能生长,革兰氏阳性菌生长较差。
在缺乏十六烷三甲基溴化铵琼脂时也可用乙酰胺培养基进行分离,将菌液划线接种于平板上,置36℃±
1℃培养2４ｈ±
２h,铜绿假单胞菌在此培养基上生长良好,菌落扁平，边缘不整，菌落周围培养基略带粉红色,其它菌落不生长。
5、3 染色镜检:
挑取可疑得菌落，涂片，革兰氏染色,镜检为革兰氏阴性者应进行氧化酶试验。
5、4 氧化酶试验：
取一小块洁净得白色滤纸片放在灭菌平皿内，用无菌玻璃棒挑取铜绿假单胞菌可疑菌落涂在滤纸上，然后在其上滴加一新配制得1％二甲基对苯二胺试液，在15s～3０ｓ之内，出现粉红色或紫红色时，为氧化酶试验阳性；
若培养物不变色，为氧化酶试验阴性。
5、５绿脓菌素试验：
取可疑菌落2个～３个,分别接种在绿脓菌素测定培养基上,置36℃±
1℃培养2４h±
2ｈ，
加入氯仿３mL～5mL,充分振荡使培养物中得绿脓菌素溶解于氯仿液内,待氯仿提取液呈蓝色时，用吸管将氯仿移到另一试管中并加入1mol/L得盐酸1mL左右,振荡后,静置片刻.如上层盐酸液内出现粉红色到紫红色时为阳性,表示被检物中有绿脓菌素存在.
5、6 硝酸盐还原产气试验：
挑取可疑得铜绿假单胞菌纯培养物，接种在硝酸盐蛋白胨水培养基中，置36℃±
1℃培养２4h±
2h，观察结果.凡在硝酸盐蛋白胨水培养基内得小倒管中有气体者，即阳性，表明该菌能还原硝酸盐，并将亚硝酸盐分解产生氮气。
5、7 明胶液化试验,取铜绿假单胞菌可疑菌落得纯培养物,穿刺接种在明胶培养基内,置36℃±
１℃培养24h±
２ｈ,取出放冰箱10min~３0min，如仍呈溶解状或表面溶解时即为明胶液化试验阳性;
如凝固不溶者为阴性。
５、8 42℃生长试验：
挑取可疑得铜绿假单胞菌纯培养物，接种在普通琼脂斜面培养基上,放在４2℃±
１℃培养箱中,培养2４h～48ｈ,铜绿假单胞菌能生长,为阳性,而近似得荧光假单胞菌则不能生长。
６、检验结果报告
被检样品经增菌分离培养后,经证实为革兰氏阴性杆菌,氧化酶及绿脓菌素试验皆为阳性者,即可报告被检样品中检出铜绿假单胞菌；
如绿脓菌素试验阴性而液化明胶、硝酸盐还原产气与42℃生长试验三者皆为阳性时,仍可报告被检样品中检出铜绿假单胞菌。
五、金黄色葡萄球菌
本规范规定了化妆品中金黄色葡萄球菌得检验方法。
本规范适用于化妆品中金黄色葡萄球菌得检验。
金黄色葡萄球菌（Ｓtapｈylococcｕsaurｅus）为革兰氏阳性球菌，呈葡萄状排列，无芽孢,无荚膜，能分解甘露醇，血浆凝固酶阳性。
该菌就是葡萄球菌中对人类致病力最强得一种,能引起人体局部化脓性病灶,严重时可导致败血症.
3、１ 显微镜。
3、2恒温培养箱:
３、3 离心机.
3、4 灭菌吸管，1mL、10mL.
3、5灭菌试管:
３、6 载玻片。
3、７酒精灯.
4、1 ＳCDLP液体培养基
4、2 7、5%得氯化钠肉汤
蛋白胨 10g
牛肉膏 3g
氯化钠 7５g
蒸馏水加至 １０00mL
将上述成分加热溶解，调pＨ为７、4，分装，1０3、４3kPa（1２1℃15 lb）15ｍin 高压灭菌。
4、3Baｉｒd Paｒker 氏培养基
胰蛋白胨 1０ｇ
牛肉膏
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