猪脑心肌炎病毒广西株的分离及其全基因组序列分析硕士论文文档格式.docx
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猪脑心肌炎病毒广西株的分离及其全基因组序列分析
中文摘要
脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditisvirus,EMCV)属于微RNA病毒科(Picornaviridae)、心病毒属(Cardiovirus)的成员,可引起猪的以脑炎、心肌炎或心肌周围炎为主要临床特征的急性传染病。
针对猪EMCVVP3/VP1基因序列设计并合成一对特异性引物,以构建的含有该引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测EMCV核酸的SYBRGreenIreal-timePCR方法。
该方法线性关系好,标准曲线的相关系数达到0.991;
敏感性高,初始模板的检出下限为1×
101拷贝/μL,比常规PCR方法高100倍;
特异性强,与其它猪源病毒均不发生交叉反应;
重复性好,组内与组间的变异系数均小于3%。
应用所建立的方法对临床29份可疑病料进行检测,结果1份为阳性。
将该份疑似病料上BHK-21细胞,并对其进行特性鉴定,确诊为EMCV,命名为EMCV-GXLC,设计5对引物,采用RT-PCR技术扩增EMCV分离株基因组完整开放阅读框(ORF)序列,应用3′-RACE和5′-RACE技术扩增分离株的3′-UTR和5′-UTR,分别进行扩增片段的克隆和测序。
结果表明,EMCV-GXLC株基因组全长7725nt,编码区为6879nt,编码2292个aa,将该株全基因组上传NCBI,GenBank登录号:
FJ897755。
应用分子生物学软件对EMCV-GXLC全基因组核苷酸及推导氨基酸序列进行了序列比对和同源性分析。
全基因组比对结果表明,分离株与来源于广西的FJ604852、FJ604853,北京的DQ464062,河北的DQ464063,韩国的DQ517424、EU780148、EU780149等猪源EMCV分离株的同源性较高,达99.5%以上。
各个片段推导的氨基酸同源性分析显示,非结构蛋白比结构蛋白保守;
在非结构蛋白中,3D蛋白最为保守,2A相对变异较大,预示EMCV的诊断引物可以基于3D基因;
在结构蛋白中,VP2蛋白相对保守,VP1蛋白同源性最低、变异性较大,适合用于分子流行病学的调查。
VP1蛋白有两个潜在的N-糖基化基序,分别为N29QT和N62QT,VP1是表位最多的区域,预测有9个可能的表位;
VP2和VP3共有6个潜在的N-糖基化位点。
3′-UTR和5′-UTR二级结构分析显示,FJ897755与来源于韩国的DQ517424相似度最高。
进化树分析显示,结构蛋白与全基因序列的系统发育进化树相近,且不同结构蛋白基因序列之间的系统发育进化树结构也类似,在分析EMCV分离株的进化关系时,可以使用VP3/VP1基因来绘制系统发育进化树。
关键词:
猪脑心肌炎病毒;
荧光定量PCR;
分离;
测序;
全基因组;
进化分析
ISOLATIONANDGENOMICSEQUENCEANALYSISOFPORCINEENCEPHALOMYOCARDITISVIRUSGUANGXISTRAIN
英文摘要
Encephalomyocarditisvirus(EMCV)isamemberofthegenusCardiovirusofthefamilyPicornaviridae,itisclinicallycharacterizedbyencephalitis,myocarditisorinflammationaroundcardiacmuscles.
ApairofprimerswasdesignedaccordingtothesequenceoftheVP1geneofEMCVandareal-timePCRassaybasedonSYBRGreen
fordetectionofEMCVwasestablished.TheassayhadagoodlinearrelationshipbetweeninitialtemplatesandCtvalues,andthecorrelationcoefficientofthestandardcurvewas0.991.Also,itwashighlysensitiveandhadadetectionlimitof1×
101copies/μLofinitialtemplates,whichwas100timesmoresensitivethantheconventionalPCR.Moreover,itwashighlyspecificandhadnocross-reactionwithotherporcineviruses.Finally,itwashighlyreproducibleandhadacoefficientofvariationslessthan3percentforbothintra-andinter-assay.
OneEMCVstrainwasisolatedfromtheclinicaltissuesamplesorignatedfrompigfarmsinGuangxibyusingBHK-21cells.ThisisolatewasdesignatedEMCV-GXLC(GenBankaccessionNo.FJ897755),andidentifiedusingIFA.Thevirusparticleswithdiameterof27nmwereobservedbyimmuneelectronmicroscopy(IEM).FivepairsofprimersweredesignedandfiveoverlappingcDNAfragmentscoveringthecompleteopenreadingframe(ORF)withinBJC3andHB1wereamplifiedusingRT-PCR.The5'
-rapidamplificationofcDNAends(RACE)and3'
-RACEwereemployedtoamplifythe5'
-untranslatedregion(UTR)and3'
-UTRoftheRNAoftheviruses.ThesequencesofRT-PCR-generatedcDNAfragmentsfromEMCV-GXLCviruseswereassembled.ThecompletegenomesofEMCV-GXLCconsistedof7725nucleotides,andpossessedalargeORFwithasizeof2292aminoacids.
ThehomologyofthegenomicnucleotidesequencesandthepredictedaminoacidswerealignedandanalyzedamongEMCV-GXLCandotherEMCVstrainsavailableinGenBank.Theresultsshowedthat
KEYWORDS:
encephalomyocarditisvirus(EMCV);
real-timePCR;
isolation;
sequence;
genome;
phylogeneticanalysis
目录
中文摘要I
英文摘要II
目录III
插图和附表VI
插图清单VI
附表清单VII
缩略词表VIII
1.文献综述1
1.1EMCV基因组结构1
1.1.1EMCV衣壳蛋白及其功能2
1.1.2EMCV非结构蛋白P2和P33
1.1.3EMCV5′-UTR结构与功能3
1.1.4EMCV3′-UTR5
1.2EMCV诊断技术5
1.2.1病毒分离5
1.2.2抗体检测方法5
1.2.3抗原检测方法6
1.3EMCV的流行情况及流行特点6
1.3.1流行情况6
1.3.2流行特点7
1.4EMCV的公共卫生学意义8
1.5研究内容与技术路线9
1.5.1研究内容9
1.5.2技术路线10
2.猪脑心肌炎病毒SYBRGreenIreal-timePCR检测方法的建立错误!
未定义书签。
2.1材料与方法错误!
2.1.1病毒与引物错误!
2.1.2主要试剂错误!
2.1.3试验用溶液配制错误!
2.1.4主要仪器设备错误!
2.2方法错误!
2.2.1质粒标准品的制备错误!
2.2.2Real-timePCR反应条件的优化错误!
2.2.3Real-timePCR标准曲线的制作错误!
2.2.4Real-timePCR的敏感性试验错误!
2.2.5Real-timePCR的特异性试验错误!
2.2.6Real-timePCR的重复性试验错误!
2.2.7Real-timePCR的初步应用错误!
2.3结果与分析错误!
2.3.1质粒标准品的制备错误!
2.3.2Real-timePCR反应条件的优化错误!
2.3.3Real-timePCR标准曲线的制作错误!
2.3.4Real-timePCR的敏感性试验错误!
2.3.5Real-timePCR的特异性试验错误!
2.3.6Real-timePCR的重复性试验错误!
2.3.7Real-timePCR的初步应用错误!
2.4讨论错误!
2.4.1荧光定量PCR检测方法的建立错误!
2.4.2荧光定量PCR反应特点错误!
2.4.3影响荧光定量PCR反应的因素错误!
2.4.4荧光定量PCR反应的优缺点错误!
2.5小结错误!
3.猪脑心肌炎病毒广西株的分离及其全基因组序列测定错误!
3.1材料错误!
3.1.1病料收集错误!
3.1.2主要试剂错误!
3.1.3试验用溶液配制错误!
3.1.4主要仪器设备错误!
3.2方法错误!
3.2.1病毒的分离错误!
3.2.2病毒的RT-PCR鉴定错误!
3.2.3EMCV-GXLC株间接免疫荧光抗体试验(IFA)错误!
3.2.4EMCV-GXLC株TCID50的测定错误!
3.2.5分离株的全基因组扩增、克隆与测序错误!
3.3结果与分析错误!
3.3.1EMCV病毒的分离错误!
3.3.2EMCV-GXLC株的RT-PCR鉴定错误!
3.3.3EMCV-GXLC株间接免疫荧光抗体试验(IFA)错误!
3.3.4EMCV-GXLC株TCID50的测定错误!
3.3.5EMCV-GXLC株基因片断的RT-PCR扩增结果错误!
3.3.6EMCV-GXLC株各个基因片段的克隆、测序及序列拼接错误!
3.4讨论错误!
3.4.1关于EMCV的分离错误!
3.4.2关于EMCV的鉴定错误!
3.4.3关于EMCV-GXLC株全基因的扩增错误!
3.5小结错误!
4.猪脑心肌炎病毒广西株(EMCV-GXLC)全基因组分子特征分析错误!
4.1材料错误!
4.1.1本研究所用EMCV分离株信息错误!
4.1.2分子生物学分析软件错误!
4.2方法错误!
4.2.1基因组结构分析错误!
4.2.2序列比对错误!
4.2.3结构蛋白基本特征、表位预测及二级结构错误!
4.2.4系统进化分析错误!
4.3结果与分析错误!
4.3.1EMCV-GXLC株的基因组组成和结构分析错误!
4.3.2EMCV各基因片段同源性分析错误!
4.3.3EMCV多聚蛋白各基因片段连接处氨基酸分析错误!
4.3.4EMCV-GXLC株VP1分子特征错误!
4.3.5EMCV-GXLC株VP2、VP3分子特征错误!
4.3.6EMCV-GXLC株5′-UTR二级结构预测错误!
4.3.7EMCV-GXLC株3′-UTR二级结构预测错误!
4.3.8EMCV系统发育进化树绘制错误!
4.4讨论错误!
4.4.1EMCV-GXLC株基因组序列比较错误!
4.4.2EMCV-GXLC株的变异特点错误!
4.4.3EMCV-GXLC株VP1的抗原性错误!
4.4.4病毒基因组的系统发育进化关系错误!
4.5小结错误!
5.结论11
附录12
附录1:
SYBRGreenIreal-timePCR用重组质粒测序结果12
附录2:
SYBRGreenIreal-timePCR重复性试验数据12
附录3:
EMCV-GXLC株第1~5代细胞毒TCID50测定结果56
附录4:
EMCV-GXLC株全基因组序列58
致谢63
攻读学位期间发表论文情况64
申明65
参考文献66
插图和附表
插图清单
图1-1EMCV基因组结构和多聚蛋白裂解图2
Fig.1-1OrganizationandpolyproteinofthegenomeofEMCV2
图1-2近年来EMCV全球流行情况7
Fig.1-2TherecentglobalepidemicofEMCV7
图21PCR扩增产物错误!
Fig.2-1ProductofPCR错误!
M.DNAMarkerDL2000;
1.PCR产物错误!
1.PCRproduct错误!
图22重组质粒鉴定错误!
Fig.2-2Identificationoftherecombinantplasmid错误!
图23SYBRGreenIreal-timePCR的扩增曲线(A)、熔解曲线(B)错误!
Fig.2-3Dynamiccurve(A)andmeltingcurve(B)ofSYBRGreenIreal-timePCR错误!
图24SYBRGreenIreal-timePCR的标准曲线错误!
Fig.2-4StandardcurveofSYBRGreenIreal-timePCR错误!
图25SYBRGreenIreal-timePCR特异性试验错误!
Fig.2-5SpecificityassayofSYBRGreenIreal-timePCR错误!
图31EMCV在BHK-21细胞上产生的细胞病变错误!
Fig.3-1CPEofEMCVinBHK-21cells错误!
图32EMCV-GXLC株3D基因片段的RT-PCR鉴定错误!
Fig.3-2Identificationof3DgeneofEMCV-GXLCstrain错误!
图33EMCV-GXLC株的间接免疫荧光抗体试验鉴定结果错误!
Fig.3-3IFAidentificationofEMCV-GXLCstraininBHK-21cells错误!
图34EMCV-GXLC株基因组各片段扩增结果错误!
Fig.3-5TheamplifiedfragmentsthegenomeofEMCV-GXLCstrainbyRT-PCR错误!
图41EMCV-GXLC株的序列信息错误!
Fig.4-1SequenceinformationaboutEMCV-GXLCstrain错误!
图42EMCV-GXLC株基因组组成简图错误!
Fig.4-2ThegenomeorganizationdiagramofEMCV-GXLCstrain错误!
图43EMCV-GXLC株与EMCV参考毒株VP1蛋白氨基酸序列比对错误!
Fig.4-3AlignmentofthepredictedaminoacidsequencesforVP1ofEMCV错误!
图44EMCV-GXLC株VP1蛋白特性预测错误!
Fig.4-4PredictiononantigensitesandsomecharactersofVP1proteinofEMCV-GXLCstrain错误!
图45EMCV-GXLC株VP2和VP3氨基酸序列错误!
Fig.4-5PredictedaminoacidsequencesofVP2proteinandVP3proteinofEMCV-GXLCstrain错误!
图46EMCV-GXLC株VP2蛋白特性预测错误!
Fig.4-6PredictiononantigensitesandsomecharactersofVP2proteinofEMCV-GXLCstrain错误!
图47EMCV-GXLC株VP3蛋白特性预测错误!
Fig.4-7PredictiononantigensitesandsomecharactersofVP3proteinofEMCV-GXLCstrain错误!
图48EMCV-GXLC株与部分EMCV参考株的5′-UTR二级结构预测错误!
Fig.4-8Predictionofthe5′-UTRsecondarystructureofEMCV-GXLCstrainandreferenceEMCV错误!
图49部分EMCV分离株的ploy(C)结构域基因片段比对结果错误!
Fig.4-9Alignmentofthenucleotidesequencesforploy(C)ofEMCV错误!
图410EMCV-GXLC株与部分EMCV参考株的3′-UTR二级结构预测错误!
Fig.4-10Predictionofthe3′-UTRsecondarystructureofEMCV-GXLCstrainandreferenceEMCV错误!
图411EMCV全基因组、ORF核苷酸序列系统发育进化树错误!
Fig.4-11PhylogenetictreesderivedfromEMCVcompletegenomeandORFnucleotidesequences错误!
图412EMCVCCR、VP3/VP1、VP2和VP1核苷酸序列绘制的系统发育进化树错误!
Fig.4-12PhylogenetictreesderivedfromfourEMCVdatasets,i.e.CCR,VP3/VP1,VP2andVP1nucleotidesequences错误!
图413EMCVP2、P3、2A、3D核苷酸序列绘制的系统发育进化树错误!
Fig.4-13PhylogenetictreesderivedfromfourEMCVdatasets,i.e.P2,P3,2Aand3Dnucleotidesequences错误!
图414EMCV3′-UTR、5′-UTR核苷酸序列绘制的系统发育进化树错误!
Fig.4-14PhylogenetictreesderivedfromEMCV3′-UTRand