生物化学综合实验实验报告Word文档格式.docx
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前言：
核酸（nucleicacid）是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。
核酸是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一。
核酸广泛存在于所有动植物细胞微生物体内，生物体内的核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。
核酸是生物体内的一种大分子化合物，与生物的生长、发育、繁殖、遗传与变异有密切关系，是蛋白质生物合成不可缺少的物质，因此，核酸的提取一直应用于遗传工程上。
目前,人们已发现,除了遗传学上的用途外,核酸制剂还可广泛应用于医学、食品工业上，核酸及其衍生物具有有效的抗癌作用。
所以核酸的分离纯化，一直广受大家的关注，本次试验就是以植物和动物作为实验材料，来进行核酸的分理纯化及性质研究。
1.植物组织中核酸的分离与纯化原理：
DNA存在于细胞的细胞核中，且DNA大部分是以脱氧核糖和蛋白的形式存在于其中。
所以为了提取植物组织和动物肝脏中的DNA，我们先提取了脱氧核糖和蛋白（DNP），再将蛋白质去除。
然后利用阴离子去垢剂SDS使DNA与蛋白质进行分离，再用含少量异戊醇的氯仿去除蛋白质，最后用乙醇把DNA从抽提液中沉淀出来。
DNP与核糖核蛋白（RNP）在不同浓度的电解质溶液中溶解度差别非常大，我们可以利用这一特点将二者进行分离。
通常可用1mol/LNaCl提取DNA。
为了进一步纯化DNA,我们可用适量的RNase来处理提取液，从而降解DNA中掺杂的RNA.因为在提取过程中DNA可能被细胞中释放出来的DNase分解或者DNA发生变性，所以整个提取过程都应该在较低的温度下进行，同时研磨缓冲液中加入柠檬酸三钠和Na2-EDTA抑制DNase的活性。
我们一般要通过紫外吸收，化学测定和电镜观察等方面来测定提取的DNA是否为纯净，双链，高分子化合物。
本实验采用紫外吸收法。
2.肝脏中DNA的提取及纯度鉴定原理：
本实验采用动物新鲜肝脏为提取DNA的材料，通过组织匀浆，使细胞破碎，利用RNP和DNP在一定浓度NaCL溶液中溶解度不同的特点，提取DNP。
用SDS使蛋白质变性和核蛋白解聚，释放出DNA。
用氯仿使蛋白质变性沉淀，离心去除。
用乙醇作沉淀剂，得到较纯的DNA。
用rNASE去除RNA，再用氯仿使酶蛋白变性沉淀，离心去除，最后用乙醇作沉淀剂，重复进行上述步骤，即可制成纯度较高的脱氧核糖核酸。
，DNA纯度鉴定需要测定A260，A230和A280的值，经验数据表明，高纯度DNA样品A260/A280的值在1.8左右，当比值高时说明样品中混杂有RNA，当比值低时表明样品中蛋白质没有脱净；
而A260/A230应大于或等于2.0，若比值过小则表明有杂质（一般多酚类或色素）。
因此，可利用A260/A280和A260/A230比值的大小来鉴定DNA样品的纯度。
3.二苯胺法测定核酸的含量原理：
脱氧核糖核酸中的α—脱氧核糖在酸性环境中变成ω—羟基—γ酮基戊醛与二苯胺试剂一起加热产生蓝色化合物，在595nm处有最大的吸收，在每毫升含DNA20~400微克范围内，光密度与DNA的浓度成正比，在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应的灵敏度。
除DNA外，脱氧木糖，阿拉伯糖也有同样的反应。
DNAHOCH2C—CH2CHO蓝色化合物
酸性条件二苯胺
0
ω—羟基—γ酮基戊醛
4.DNA的琼脂糖凝胶电泳原理；
DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。
由于糖—磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量碱基的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。
在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子本身的大小和构型，具有不同分子量的DNA片段迁移速度不一样，迁移速度与DNA分子量的对数值成反比关系。
凝胶电泳不仅可分离不同分子量的DNA，也可以分离分子量相同、但构型不同的DNA分子。
一般提取的质粒有3种构型：
超螺旋的共价闭合环状DNA（covalentlyclosedcircularDNA，简称cccDNA），开环DNA，即共价闭合环状质粒DNA有一条链断裂，（opencircularDNA，简称ocDNA），线状质粒DNA，即质粒DNA在同一处两条链都发生断裂（linearDNA，简称LDNA）。
本实验采用限制性内切酶HindⅢ酶解λDNA的片段为标准物，建立其酶切图谱，同时以酶解各片段的分子量为纵坐标，以它们对应的迁移率为横坐标，在半对数坐标纸上，连接各点绘制出测定DNA分子量的标准曲线。
琼脂糖凝胶浓度/%
可分辨的线性DNA大小范围/kb
0.3
60-5
0.6
20-1
0.7
10-0.8
0.9
7-0.5
1.2
6-0.4
1.5
4-0.2
2.0
3-0.1
表5-1DNA大小范围与琼脂糖凝胶浓度的关系
实验仪器与试剂：
1.实验试剂：
（1）以西兰花为材料提取DNA
（2）研磨缓冲液：
1mol/氯化钠，0.045mol/L柠檬酸三钠盐，0.1mol/L乙二胺四乙酸二钠盐（Na2-EDTA），1%的十二烷基硫酸钠（SDS）,并调到PH=7.0.
（3）氯仿-异戊醇（V/v）：
氯仿：
异戊醇=24:
1
（4）95%乙醇溶液
（5）RNase溶液
（6）TE溶液：
含10mmol/L的Tris-HCL,1mol/L的Na2-EDTA。
动物新鲜肝脏（猪，鸡）。
（7）4mol/L氯化钠溶液：
将233.84g氯化钠溶于水，稀释至1000mL.
（8）0.14mol/L氯化钠-0.15mol/L乙二胺四乙酸钠溶液：
溶解8.18g氯化钠及37.2g乙二胺四乙酸钠于蒸馏水，稀释至1000mL。
（9）25%的SDS溶液：
25g十二烷基硫酸钠溶于100mL蒸馏水中。
（10）0.015/L氯化钠-0.015/L柠檬酸三钠溶液：
0.88g氯化钠和0.44g柠檬酸三钠溶于蒸馏水中，稀释至1000mL.
（11）TE缓冲液：
称取0.12gTris,加适量蒸馏水溶解，用1mol/lHCL溶液调至1000ml，并定容至100ml，加入0.037gEDTA溶解。
（12）RNase溶液（10mg/mL）：
将RNaseA10mg溶解于1mLTE缓冲液中。
（13）70%乙醇，95%乙醇。
（14）DNA标准溶液：
取小牛胸腺DNA用0.1N氢氧化钠溶液配制成200微克/毫升的溶液。
（15）DNA样品液：
（自己提取）控制其DNA含量在50~100微克/毫升左右。
（16）二苯胺试剂：
称取1克结果的二苯胺试剂溶于100毫升分析纯的冰醋酸中，再加入10毫升过氯酸（A.R60%以上）或浓硫酸2.75毫升，混匀备用。
临用前加入1毫升1.6%乙醛溶液（乙醛溶液应保存于冰箱，一周内可使用）所配得的溶液应为无色。
（17）限制性内切酶HindⅢ试剂盒
（18）标准λDNA：
按使用说明配制
（19）标准pBR322：
（20）电极缓冲液（5×
TBE）：
用前稀释10倍
称取10.88克Tris，5.52克硼酸，0.74克EDTA·
Na2·
2H2O，溶解后用蒸馏水定容至200ml。
使用前用蒸馏水稀释10倍，称为TBE稀释缓冲液（0.5×
TBE）。
（21）溴乙锭（EB）染色贮存液（1mg/ml）：
1滴/组
将100mg溴乙锭溶于蒸馏水或电极缓冲液100ml，棕色瓶内封好，避光保存。
EB是诱变剂，配制和使用时应戴乳胶手套，并且不要将该溶液洒在地面或桌面上。
凡是沾污过EB的器皿或物品，必须经专门处理后，才能进行清洗或弃去。
（22）1%琼脂糖
2.实验器材：
离心机；
752紫外分光光度计，研钵，三角瓶，烧杯，玻璃棒，匀浆器，离心管，恒温水浴箱（60度，100度），量筒，吸量管，真空干燥器，紫外分光光度计，石英比色皿，电泳仪，电泳槽，微量移液器，紫外检测灯，移液管（1、2、5ml）,试管及试管架，凝胶塑料托盘，大小烧杯，一次性塑料手套，紫外反射投射仪，洗瓶，胶头滴管，卡尺。
操作步骤：
1.植物组织中DNA的提取及纯度鉴定（西兰花）
（1）称取6g在冰箱中冷冻30min以上的西兰花组织，加入12mL的研磨缓冲液，迅速（5min以内）研磨成匀浆。
（2）将匀浆倒入三角瓶内，加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，充分震荡半分钟，以脱组织蛋白，然后离心（10000r/min）5min，小心地吸出上层清液备用，弃去中下层含有细胞碎片，变性蛋白质，氯仿等残物。
这个过程循环2-3次。
（3）将收集的上层溶液倒入三角瓶中，再加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，充分震荡半分钟，以脱组织蛋白，然后离心（10000r/min）5min，用吸管吸出上层核酸水同液，移于烧杯中。
（4）用吸管沿烧杯壁缓缓加入2倍体积预冷95%的乙醇，然后用玻璃棒轻轻搅动，将出现的纤维沉淀缠绕在玻璃棒上。
因玻璃棒搅拌纤维沉淀过少，故离心五分钟后在此操作，获得沉淀。
（5）将上述沉淀溶解在适量PH=8.0的TE溶液中，搅拌到完全溶解后，加入RNase溶液12ｕＬ，使其最终浓度为50-75ug/mL,在37度下保温30min，以除去RNA，然后加入等体积氯仿-异戊醇混合液，在三角瓶中，震荡半分钟，离心（10000r/min）5min。
收集上层水溶液，再次除去残留的蛋白质和所加的RNase.
（6）按照4的程序加乙醇后，将DNA沉淀挑出，再将DNA溶解于PH=8.0的TE溶液中，即得到纯化的DNA溶液。
（7）DNA纯度测定。
采用DNA紫外吸收特性进行测定，取少量样品，加PH=8.0的TE溶液稀释至一定浓度，测A260和A280的值，如A260/A280=1.8，蛋白质含量不超过1.3%，DNA纯度合乎质量标准。
NDA浓度（ug/mL）=×
稀释倍数
（L为比色杯厚度，一般为1cm;
0.020为每mL溶液中含1ugDNA钠盐时的吸光值；
A260为260nm波长处光吸收值）
2.肝脏中DNA的提取及纯度鉴定
（1）取新鲜肝脏（约10g）,用0.14mol/L氯化钠-0.15mol/L乙二胺四乙酸钠溶液洗去血液，剪碎，加入10mL0.14mol/L氯化钠-0.15mol/L乙二胺四乙酸钠溶液,置匀浆器中研磨，待研成糊状后，浆糊状物离心5min（10000r/min）,弃去上清液，沉淀用0.14mol/L氯化钠-0.15mol/L乙二胺四乙酸钠溶液洗2-3次。
（2）向上述沉淀物加入0.14mol/L氯化钠-0.15mol/L乙二胺四乙酸钠溶液，使总体积为4mL,然后滴加25%SDS溶液0.4mL,边加边搅拌。
加毕，置60度水浴保温10min（用细玻璃棒经常搅拌），等溶液变得粘稠时（可能不明显）取出冷至室温。
此步操作系使大分子脱氧核糖核蛋白从细胞核中溶出，核酸与蛋白质分离。
（3）加入4mol/L氯化钠溶液2.2mL,使氯化钠最终浓度达到1mol/L搅拌10min，加入约1倍体积的氯仿-异戊醇混合液，震摇20min，离心5min（10000r/min）.收集上层水相，去掉在氯仿与水相之间的变性蛋白质沉淀；
向上层水相徐徐加入1.5-2倍预冷的95%乙醇，DNA沉淀即析出，离心5min（10000r/min）去掉上清，收集沉淀（DNA粗品）。
（4）将DNA粗品置于2.7mL0.015mol/L氯化钠-0.0015mol/L柠檬酸三钠溶液中溶解，再加入0.3mL1.5mol/L氯化钠-0.15mol/L柠檬酸三钠溶液,搅匀，加入1倍体积的氯仿-异戊醇混合液，震摇10min，离心5min（10000r/min），小心地吸取上层水相（含NDA钠盐），弃中层变性蛋白；
收集上层水相再加入一倍体积的氯仿-异戊醇混合液，震摇10min，离心5min（10000r/min），小心地吸取上层水相，弃中层变性蛋白。
反复几次直到中间层蛋白凝胶层消失。
向收集的上层水相加入2倍体积预冷的95%乙醇，DNA即沉淀析出。
离心5min（10000r/min），弃去上清液，沉淀为较纯的DNA.
（5）将上述所得沉淀溶于2mLTE缓冲液中，加入RNaseA溶液4ul至终浓度为20mg/L混匀，在37度水浴中保温30min。
（6）向经RNaseA消化后的DNA溶液中加入1倍体积的氯仿-异戊醇混合液，震摇5min，离心5min（10000r/min），小心地吸取上层水相（含DNA），弃中层变性蛋白,重复抽屉2-3次。
（7）向除尽蛋白质的上清液中徐徐加入2倍体积预冷的95%乙醇，DNA及沉淀析出。
离心5min（10000r/min），弃去上清液，再用预冷的70%乙醇洗一次，室温倒置干燥。
（8）将上步所得更纯的DNA沉淀溶于2mL0.015mol/L氯化钠-0.0015mol/L柠檬酸三钠溶液中备用（供定性鉴定或定量测定）。
（9）将DNA样液适当稀释，移入光径为1cm的石英比色皿，并以0.015mol/L氯化钠-0.0015mol/L柠檬酸三钠溶液作为空白对照。
在紫外分光光度计上分别于260nm,280nm和230nm波长处进行测定，计算A260/A280和A260/A230比值的大小来鉴定DNA样品的纯度。
3.二苯胺法测定核酸的含量
（1）DNA标准曲线的制作
取8支试管，编号，按下表加入试剂
管号
试剂
2
3
4
5
6
7
DNA标准液
0.2
0.4
0.8
1.0
1.6
蒸馏水
1..8
二苯胺试剂
加毕，摇匀，于60℃恒温水浴中保温1小时，（或于沸水中煮沸15分钟，冷却测0.D595nm值。
）以光密度为纵坐标，DNA含量（ug/ml）为横坐标，绘制标准曲线。
（2）样品的测定
取2支试管，加0.2毫升的肝脏待测液，0.5毫升的苦苣待测液（内含DNA应在标准曲线可测范围之内）加蒸馏水稀释至2毫升，再加4毫升二苯胺试剂，摇匀，其操作步骤与标准曲线的制作相同。
根据测得的光密度值，从标准曲线上查出相当该光密度DNA的含量，按下式计算出样品中DNA的百分含量。
DNA含量/毫升待测液=标准曲线查得值×
4.DNA的琼脂糖凝胶电泳（实验一，二样品）
一、DNA的酶解
取2只清洁、干燥、无菌的Eppendorf管，编号，分别加入25μL样品溶液，然后加入5μL6×
电泳缓冲液，混匀，放入冰箱保存。
二、1.0%琼脂糖凝胶板的制备
1.用配套挡板将凝胶塑料托盘短边缺口封住，置水平玻板或水平工作台面上，将样品槽模板（梳子）插进托盘长边上的凹槽内（距一端约1.5cm），梳齿底边与托盘表面保持0.5-1mm的间隙，安置好后保持静置状态。
图5-1凝胶托盘的组装
1.托盘2.挡板3.梳子
2.称取0.3克琼脂糖置于小锥形瓶中，加入30mlTBE稀释缓冲液，在电炉上（或微波炉中）加热融化，轻轻摇匀，避免产生泡沫。
3.待琼脂糖冷却至放在手背不觉太烫手（约60℃）后，滴一滴EB，然后将琼脂糖溶液在靠近挡板一侧连续地倒入托盘内（注意中间不要间断），使凝胶缓慢而连续地展开直至在托盘表面形成一层约3mm厚均匀胶层（7.1×
9.0cm）。
胶内不要存有气泡，室温下静置约20分钟。
4.待凝固完全后，双手均匀用力轻轻拔出样品槽模板（注意勿使样品槽破裂），则在胶板上形成相互隔开的样品槽。
取下封边的挡板，将凝胶连同托盘放入电泳槽平台上，倒入大量TBE稀释缓冲液直至浸没过凝胶面2-3mm，要防止样品槽内窝存气泡，可以用微量注射器挑除。
三、加样
用微量注射器或移液枪将经酶切的样品液和未经酶切的样品液（要加2μL的酶反应终止液）分别加入到胶板的不同加样槽内，每个槽（5×
2×
2.5mm）容积约为25μL，因此加样量不要超过20μL，避免因样品过多而溢出，污染邻近样品。
加样时，注射器针头穿过缓冲液小心靠近加样槽底部，但不要损坏凝胶槽，然后缓慢地将样品推进槽内，让其集中沉于槽底部。
加完一个样品后的微量注射器应反复洗净后才能用以加下一个样品。
四、电泳
加样完毕，将靠近样品槽一端连接负极，另一端连接正极（千万不要搞错），接通电源，开始电泳。
在样品进胶前可用略高电压，防止样品扩散，样品进胶后，应控制电压降不高于5V/cm。
当染料带移动到距离凝胶末端约1cm时，停止电泳。
五、观察
小心地取出凝胶置托盘上，将胶板推至预先浸湿并铺在紫外灯观察台上的玻璃纸内，在波长245nm紫外灯下进行观察。
DNA存在的位置呈现橘红色荧光，可观察到清晰的条带。
观察时应带上防护眼镜，避免紫外灯对眼睛的伤害。
六、制作测定分子量标准曲线
用卡尺量出λDNA-HindⅢ酶解各片段的迁移距离（cm），以DNA酶解各片段分子量为纵坐标，它们的迁移距离为横坐标，在半对数坐标纸上连结各点划出曲线，即为DNA分子量的标准曲线。
λDNA-HindⅢ酶解各片段大小见表5-2。
片段
碱基对数目（kb）
道尔顿（×
106）
8
23.130
9.419
6.557
4.371
2.322
2.028
0.564
0.125
15.0
6.12
4.26
2.84
1.51
1.32
0.37
0.08
表5-2λDNA-HindⅢ酶解片段
实验结果：
1.西兰花组织中DNA的提取及纯度鉴定
波长/nm
260
280
吸光值A
0.649
0.668
比值260（nm）/280（nm）
0.97
波长
230
2.070
3.523
2.201
吸光值比值
260（nm）/280（nm）=1.601
260（nm）/230（nm）=1.701
DNA含量标准曲线的绘制
试管标号
DNA浓度（ug/ml）
0.049
0.088
0.168
0.201
0.239
0.307
0.384
利用二苯胺法测定样品中核酸含量（在波长为595nm环境下进行紫外吸收，且样品稀释了2倍）
样品类型
西兰花组织中的DNA
肝脏组织中的DNA
0.053
0.061
0.525
0.610
通过琼脂糖凝胶电泳后将电泳结果在紫外线下照射观察出了如图所示的条带
（因实验时实验室DNA标准液用完，故没有标准条带）
西兰花
动物肝脏
分析与讨论：
1.对于第一个实验即在西兰花组织中提取DNA，采用SDS法提取DNA，在进行DNA纯度测定时我们稀释的倍数为10倍，然后测得吸光值。
测得结果为A260（nm）/A280（nm）=1.14，此比值远小于标准值1.8，说明我们提取的DNA不纯，不满足质量标准。
通过与组员的分析讨论，我们认为其中含有的杂质可能有RNA、蛋白质等物质。
原因可能是①我们在进一步对DNA进行提纯时重复提纯的步骤还不够多。
②在震荡过程震荡不充分，在进行玻璃棒缠绕沉淀实验中因沉淀产生不明显，采用离心的方法获得沉淀。
2.第二个实验提取肝脏中的DNA，方法同第一个实验类似，但操作步骤较复杂。
利用标准DNA样品我们做出了DNA浓度的标准曲线。
随后利用标准曲线求解我们实验样品中DNA的含量时发现样品中DNA的含量非常的微少。
可能原因是我们在研磨的时候不充分，导致DNA粗提取不够，也可能是再进行DNA提纯时未能将DNA完全吸取出来导致含量偏少，或者是震荡离心不完全。
3.在进行琼脂糖胶电泳凝实验时，最终通过观察我们的样品所跑出来的条带时发现我们的样品条带并没有跑出来，我们观察到的只是标准DNA样品的条带。
通过分析我们发现造成这样的结果的主要原因应该还是我们提取出来的DNA的含量太少了，以致于观察不到条带。
实验心得：
这次生物化学综合实验的操作与学习，让我明白了“磨刀不误砍柴工”这个道理。
实验之前的认真预习是十分有必要的，只有这样，才能正确认识到自己需要做些什么，有明确目的地去做实验才能够把实验做好。
这次综合实验老师只跟我们说了一些实验的注意事项，后续的实验完全靠我们自己去计算、操作、分析，充分锻炼了我们的综合能力，让我们在动手操作中加深了对知识的理解。
在实验的过程中必须做到百分百的严谨细致，所用试剂避免混淆，对于实验的细节和安全方面要有足够的重视。
同时，实验过程中一定要做到分工明确，并详细记录实验相关的
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