外周血细胞形态学检验及技巧分解Word文档格式.docx
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(一)细胞染色机制:
染色是将细胞经染色剂的物理及化学作用,使其清楚显示细胞各个组成部分,有利辨识细胞形态。
染色可分二个步骤:
1.染料受相应物质吸附而附着于物质表面;
2.固着作用,即染色粒子进入细胞内起化学反应(染料透过细胞膜的学说很多,尚无定论),与相应的物质形成溶解度很低的盐固着于细胞内而显色。
染色剂皆有选择作用,其染色不是将细胞全部一齐着色,而只是将其中一部分染色,多余的被冲洗掉。
目前多以吸附学说(电力吸附、机械吸附、化学吸附)来解释。
●一般染色方法由两种染色剂(酸性、碱性)组成,通常细胞核及浆碱性粒体为碱性,细胞浆为酸性。
酸性染料可和带正电荷的(碱性)物质结合,这种物质称嗜酸性物质,对酸性染料具有亲和力,因此嗜酸性粒细胞之颗粒本身为碱性物质;
碱性染料可和带负电荷的(酸性)物质相结合,这种物质称嗜碱性物质,对碱性染色粒具有亲和力,因此嗜碱性粒细胞之颗粒本身为酸性物质。
另一种蛋白质在pH6.4呈等电状态,本身所含的正/负电荷相等,因此,既能和酸性染料又能和碱性染料结合,这种物质称中性物质,如中性粒细胞之颗粒。
●一般用pH6.4PBS来稀释染液,使每次染色都在同一pH中进行,让细胞在恒定条件下着色,使染色效果趋于一致。
作者:
198585912005-5-2719:
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2外周血细胞形态学检验及技巧
染液过碱时,蛋白质带有负电荷,对次甲蓝有色部分的正电荷吸附力强,因此染成的细胞一般着色较蓝,说明pH不适合。
●染色与固定亦有极大关系,因细胞经固定后,其蛋白质的电力吸附(电附)可能有变化,有些固定液能将细胞某部分的电附加强,使其染色更为容易。
因此,这种固定剂不仅有固定作用,也有媒染作用(Mordunt),染色极为容易。
因此,电附是染色过程中最重要的作用。
机械吸附在染色过程中也参与作用,如用苏木液和伊红染色,细胞核不是纯蓝色,蓝色中略有红色,胞浆也不能尽为红色,红色中略有蓝色或两者皆带些紫色。
这是因为伊红与胞核虽无电附仍有机械吸附,故也能染上少量红色,苏木液与胞浆虽无电附但也有机械吸附,因而胞浆略显蓝色。
化学吸附(作用)在染色中应用,最早应用于金属染色剂(氯化金、硝酸银等)的金属与细胞内物质起化学作用,使金属在细胞内变成沉淀物或死亡物,显示细胞结构或物质。
近年来此原理用于细胞酶化学染色。
●血细胞的染色多采用瑞氏染色和姬姆萨染色两种,但作者取其两种染色的优点,采用瑞氏和姬姆萨混合染色法,比单用一种染色法更佳。
但近年来也出现一些快速和改良染色方法及染色液商品化,对血细胞形态染色不一定适用。
(二)瑞氏(Wright'
sstaim;
美蓝-伊红Y)染色:
1.瑞氏染料是由碱性染料美蓝(Methvlemblue)和酸性染料黄色伊红(EostmY)合称伊红美蓝染料即瑞氏(美蓝-伊红Y)染料。
伊红钠盐的有色部分为阴离子,无色部分为阳离子,其有色部分为酸性,故称伊红为酸性染料。
美蓝通常为氯盐是碱性的,美蓝的中间产物结晶为三氯化镁复盐,其有色部分为阳离子,无色部分为阴离子,恰与伊红钠盐相反。
2.用甲醇作瑞氏染料溶剂,即成瑞氏染液。
甲醇是瑞氏染料良好溶剂,有两种作用:
(1)甲醇使瑞氏染料中美蓝(M)与伊红(E)在溶液中离解,可使细胞成分选择性吸附其中的有色物质而着色。
甲醇
ME(瑞氏染料)————→M++E-
在配制的瑞氏染液中美蓝如放置过久即可氧化而含有天青,美蓝天青与伊红化合物能使核染成紫红色,但不能使胞浆染为蓝色,多余美蓝就可以使胞浆染成蓝色,染色主要是化学作用,是离子彼此结合的反应。
(2)甲醇具有强大的脱水力,可将细胞固定在一定形态及增加细胞结构的表面积,提高细胞对染料吸收作用,同时由于甲醇吸附染色液中的水,使染色液升温,加速染色反应。
3.瑞氏染液配制:
(1)瑞氏染液配制:
瑞氏染料830gm或1g
甲醇(AR)500ml或600ml
先称干燥(事先放入温箱干燥过夜)瑞氏染料放置乳钵内,用乳棒轻轻敲碎染料成粉末,再行研磨至听不到研芝麻声即呈细粉末,加少许甘油或甲醇溶解研磨,使染料在乳缸内显“一面镜”光泽,而无染料粉粒沉着,再加较多量甲醇研磨呈一面镜光亮,静置片刻,将上层液体倒入一清洁储存瓶内(最好用甲醇空瓶),再加甲醇研磨,重复数次,直至乳钵内染料及甲醇用完为止,摇匀,密封瓶口,存室温暗处,储存愈久,则染料溶解、分解就越好,一般储存3个月以上为佳。
(2)缓冲液:
1)缓冲液作用:
染色对氢离子浓度是十分敏感的,据观察pH值的改变,可使蛋白质与染料形成的化合物重新离解。
缓冲液须保持一定的pH使染色稳定,PBS的pH一般在6.4~6.8,偏碱性染料可与缓冲液中酸基起中和作用,偏酸性染料则与缓冲液中的碱基起中和作用,使pH恒定。
2)缓冲液配制(pH6.4~6.8,弱酸性):
配方1:
配方2:
1%KH2PO430mlM/15KH2PO473.5ml
1%Na2HPO420mlM/15Na2HPO426.5ml
3外周血细胞形态学检验及技巧
H2O(新鲜)加至1000ml
置室温黑暗处,瓶口密封,防止霉菌污染,如有污染则应报废。
(四)姬姆萨(Giemsa'
sstain;
天青-伊红)染色
1.姬姆萨染料是天青(蓝)2号伊红AzurIIEqsin)和天青(蓝)2号合成的。
2.姬姆萨红染料(Giemsa,天青-伊红)染液配制:
姬姆萨红染料(粉末)0.5g或7.5g
甲醇(AR)33ml或500ml
甘油(AR)33ml或500ml
先将姬姆萨染料放入乳钵中,逐渐倒甘油研磨溶于甘油中,置于56℃水温箱内,90~120分钟,然后加入甲醇,摇匀后放置数天,过滤后或不过滤即可使用。
此染液放置室温阴暗处,时间越长越好。
使用染液9临时配置):
姬姆萨染液1ml,加DDH2O10ml混匀。
即可使用。
3.染色步骤:
(1)先用甲醇固定2~3分钟。
(2)将血或骨髓涂片放置姬姆萨使用液15~30分钟。
(3)涂片用自来水冲洗,在室温中干燥待查。
(五)瑞氏及姬姆萨染色液的鉴定:
刚配好或放置一个月以上的染液可进行下列鉴定:
1.取1滴染液于乳白玻板上,自行迅速扩散开,其颜色变紫红色,且有伪足形成。
2.取1滴染液加1滴缓冲液,染液由深蓝色立即变为紫红色。
3.取血片或骨髓片进行试染检查,观察染色后各类细胞的胞核、胞浆及颗粒着色情况,pH是否合适及染色合适时间。
如有上述变化,表明染液合格,可供使用。
(六)瑞氏染色(Wright'
s)-姬姆萨(Giemsa'
s)混合染色:
瑞氏染色的染料配方浓度对细胞核着色程度适中,细胞核结构和色泽清晰艳丽,对核结构的识别较佳,但对胞浆着色偏酸,色泽偏红,对细胞浆内颗粒特别是嗜天青颗粒及嗜中性颗粒着色较差,而姬姆萨染色对胞浆着色能较好的显示胞浆的嗜碱性程度,特别对嗜天青、嗜酸性、嗜碱性颗粒着色较清晰,色泽纯正,而对胞核着色偏深,核结构显示较差,故采用以瑞氏染液为主姬姆萨染液为辅的混合染色。
染色步骤:
1.先用瑞氏染液将涂膜面充分覆盖;
2.稍等片刻再加姬姆萨染液2-3滴加减(根据涂片上细胞多少及增升程度酌情而定);
3.稍等1-2分钟后,再加磷酸盐缓冲液,加时应缓慢地一滴一滴加在涂片膜上,直至膜面上染色液形成表面张力而终止染色液加入;
4.染色30-40分钟;
5.分色:
用自来水缓缓冲洗至少3分钟以上,待干,勿用滤纸吸干,以免滤纸纤维污染涂片。
四.血液学及血细胞形态学内容及自身特点:
(一)血常规检查(Hb、RBC、WBC、Plt、血细胞比积、RBC-MCV、MCH、MCHC及血小板容积曲线),用自动化仪器提高工作效率,为使结果准确可靠,必须建立监测方法,搞好质控,此属数值质控。
我国已较普遍开展全国、省、市(地区)质控。
但普遍存在应付质控质量的问题,并未能切实解决自身质控问题。
(二)白细胞分类:
白细胞分类的自动化已普遍应用,只能为患者普查与筛选之用。
遇有问题应用显微镜观察,弥补自动化仪器缺陷。
一般医院显微镜档次偏低,分辨率低,正确使用和维修欠缺,因而要更好地发挥光镜的观察效应。
(三)骨髓、外周血细胞形态学及分类,是血液病及临床各科患者基本检查及诊断依据。
反映继发性疾病的血液学表现,了解机体状况、感染(细菌、病毒、寄生虫等)等改变。
(四)血细胞涂片自身的特点:
1.涂片不易均匀:
由于血液是混悬液,其中白细胞、有核细胞、RBC、血小板的形态大小、比重及生物活性和血浆成分等的不同和制片技术差异、质量分布不均匀性差异颇大。
2.细胞分布和检查的非随机性:
4外周血细胞形态学检验及技巧
(1)细胞分类标准与观念不一;
(2)采样和计数100~200个白细胞的局限性;
(3)细胞分布的生理变动;
3.与疾病的相关性;
4.室内、室间分类不一致性,开展室间质控也是促进形态学提高重要手段。
(五)血细胞形态学(外周血及骨髓)质控:
自1983年以来,澳大利亚皇家病理学质控中心和英国皇家进修学院WHO质控中心及最近美国洛杉矶质控中心,国内:
全国及省地市也普遍开展,由质控标本涂片发展图片指定细胞识别。
五.血细胞形态学采样、制片染色与检查要求:
(一)采样、制片及染色,三道工序至关重要,是细胞形态学检查的成败关键。
要得到合格的涂片标本,做好上述工序,应注意以下要求:
1.采样、制片:
(1)玻片要求:
国内1.0mm×
26mm×
76mm±
0.5,美国NCCLS规定1.0mm×
25mm×
75mm±
0.5,要严格清洁,接近中性.
(2)推片:
选择优质推片,推片两端边缘整齐、平滑。
也可选用有机玻璃,其大小、厚度与坡片相同,两端之边缘应加工光滑,以利推片用。
(3)采外周血(样),擦去第一滴血,迅速采血,量适中,如绿豆粒大小,具有一定推片技术,推片倾斜45°
±
,推成血膜长度25mm~35mm,宽度18~20mm,血膜四周留有空隙区,血膜终尾离玻片终端至少10mm,血膜均匀,薄如蝉翼,尾端形如弧状,迅速扇(摇)干,血膜具有头、体、尾不同厚薄区域。
此外,涂片时,还要考虑患者的血液状态,如贫血程度、血液粘稠度、WBC或有核细胞多少等因素,调整推片技巧。
(4)如若采用静脉血推片,用K3-EDTA或肝素抗凝,推制血片应尽早进行(最迟在1~2小时内)。
(二)染色:
是识别细胞形态的重要标记工序:
常规瑞氏-姬姆萨染色要点:
1.要得到满意、漂亮的血细胞染色标本,新鲜涂片迅速染色是很重要的。
2.染色液配制要合格;
3.涂片切勿用甲醛固定,否则不着色;
4.染色的好坏与染色液、缓冲液的质量及比例、加液间隔时间、保持玻片染色液面的张力等染色技巧均有重大关系。
染液要覆盖涂膜面,再加缓冲液(1:
2),其量要充足、混均,染色时间要30分钟以上。
5.细胞着色的观察:
(1)当染液与缓冲液混合后,甲醛吸水液温升高,发生剧烈反应,直至液膜表面的“染色粒”呈均匀分布,随染色时间的推延,“染色粒”由“染色小粒”聚集成“染色大粒”,逐渐由外缘向内缘推进至染色面中心(此过程需要20-30分钟以上),则表明细胞着色已完成,
(2)再用自来水缓流冲洗,使染色液沉渣及染色粒浮去,使其充分起分色作用,去除细胞染色中浮色,显示出胞核结构及细胞清晰形态,待干,镜检。
六.外周血细胞形态检查技巧:
外周血中三种血细胞数与形态学表现是:
●反映骨髓造血状态及血液病和其他疾病的厨窗;
●是检查与观察疾病的重要指标;
(一)WBC形态学诊断技巧:
1.WBC数值准确性估计:
(1)目前自动化计数仪时有出现结果的偏差,低倍镜观察血涂片可以粗略估计WBC数值及分布。
低倍视野WBC数:
正常约3~5个,增多6个以上,减低3个以下。
(2)WBC如推至片尾,分布不均,估计将有一定难度。
较大的细胞如单核、异淋及中性粒细胞及不成熟细胞多在片尾,体部则多为较小的淋巴细胞,使分类造成偏差,所以分类部位在适当调整。
2.白细胞计数值限度分级:
(1)WBC正常范围:
4.0~10.0×
109/L;
(2)WBC正常限度以下:
●轻度减少(<
4.0~3.0×
109/L),
●中度减少(<
3.0~2.0×
●极度减少(<
2.0×
109/L);
5外周血细胞形态学检验及技巧
(3)WBC正常高限度以上:
●分轻度增多(>
10.0~20.0×
●中度增多(>
20.0~40.0×
●明显增多(>
40.0~80.0×
109/L)
●极度增多(>
80.0×
109/L)。
以此与所测知WBC计数值作粗略对比,推断WBC计数值的准确性。
(4)如在血片分类计数过程中发现较多有核红细胞时,
●计出血片中有核红所占%率,即以校正原WBC计数值减去有核红所占比例,求出外周血中WBC总数值,
●另作WBC分类计100个过程中遇到多少有核红细胞,即有核红细胞个/100个WBC,
●或作血片有核细胞分类计数(包括有核红细胞),计出有核红细胞所占%率。
3.WBC分类正常范围及其病理性改变:
(1)WBC分类正常范围:
●新生儿出生后最初24小时白细胞数高,主要为中性粒细胞,至第3~4周,中性粒细胞与淋巴细胞比例倒转,直至4岁淋巴细胞比例仍多。
表1
●白细胞分类正常范围由于民族、地区、年龄、性别及其生理性变化的影响,以及检查本身的技术差异,即使一人同次取材不同涂片、一张涂片多次分类计数结果也不可能完全一致,但不可差异太大。
●分类中占大比例的中性粒细胞或淋巴细胞呈正态分布,占小比例的嗜酸/嗜碱性粒细胞及单核细胞则为Poisson分布。
(2)病理性形态学改变:
①中性粒细胞:
●中性粒细胞分叶分化程度,被认为从干细胞至粒细胞生成是否正常及与粒细胞年龄相关;
如核分叶不良,Pelger-huet现象;
核仅一叶或二叶,其百分率增加时谓之“左移”,反之,多数细胞四叶以上谓之右移,一般认为正常中性粒细胞胞核分叶情况:
4叶者为15~25%3叶者为40~50%
2叶者为20~40%1叶者为<
5%
血象中如有多个5叶以上者提示有巨幼细胞性贫血的可能。
右移现象
—多见于巨幼细胞性贫血、肝脏疾患,并可以5叶与4叶所占比例计算,得出简单实用的分叶指数:
分叶指数=5叶/4叶×
100%正常核分叶指数:
0~17%
—还见于缺铁性贫血、类风湿性关节炎、遗传性高分叶症(显性遗传)及某些败血症(以左移多见)。
左移—见于感染、败血症、出血、小儿慢性中性粒细胞减少症等。
●中性粒细胞毒性颗粒及空泡改变:
中性粒细胞由于受到外来刺激(包括感染及应激反应)引起颗粒变性,粗大着色深染及浆内空泡等病理性改变。
上述改变及白细胞数增多和出现幼稚及原始细胞则为类白血病反应。
●慢性粒细胞白血病(CML)的中性成熟粒细胞一般胞浆颗粒较正常稀少,但无空泡及毒性颗粒,而慢性中性粒细胞白血病(CNL)的中性成熟粒细胞则与类白血病反应形态相似。
●假性嗜酸性颗粒—在某些干细胞疾病如MDS、粒细胞缺乏症、肾性贫血某些患者中性粒细胞的颗粒增多,形态异常,类似嗜酸性样颗粒的出现。
●遗传性白细胞异常疾病:
是先天性白细胞异常疾病,临床上虽罕见,但为了提高辨别的能力,应有所认识。
Pelger-Huer白细胞异常:
属于显性遗传,其白细胞形态特点:
核分叶不良,不分叶,核呈花生形、亚铃形等形状,无核丝形成,胞浆正常,此外,还有假性(即继发性)Pelger-huet白细胞异常应加以鉴别,后者常见于急性肠炎、伤寒、疟疾、流感,无家族史,但在原发病得到治疗后白细胞形态恢复正常。
Alder-Reilly颗粒异常:
常染色体隐性遗传性多糖代谢障碍性疾病,常伴有软骨畸形、肝、脾肿大等,中性、嗜酸性及嗜碱性粒细胞含有多量嗜天青颗粒遮盖整个细胞,单核细胞亦有类似改变。
May-Hegglin异常:
为常染色体显性遗传疾病,在中性及嗜酸性粒细胞浆内含有Dunle小体,常伴有巨血小板及血小板减少、紫癜,由于细胞的游走功能差,故病人常出现感染症状。
继发性也可见于猩红热、球菌性感染、烧伤早期等某些病例。
6外周血细胞形态学检验及技巧
②嗜酸性粒细胞:
此种细胞在人体每日规律性变动,晨至午下降,午后始升,午夜至次晨3时达高峰数值,哮喘患者及夜间工作者其规律与正常相反,晨9至12时达高峰。
临床上嗜酸性粒细胞增多见于:
过敏性疾病,如血管神经性水肿、哮喘、食物及药物过敏、血清病、荨麻疹、枯燥热等。
寄生虫病:
常见于血丝虫、钩虫、包囊虫、肺吸虫、蛔虫、吕弗氏(Lofllers)综合征、蛲虫、旋毛虫、疟疾(偶见)及血吸虫等。
皮肤病:
如湿疹、剥脱性皮炎、天疱疮、牛皮癣、疟疾、疥、感染、猩红热早期等。
血液病:
高嗜酸性粒细胞综合症、CML、嗜酸性粒细胞白血病、何杰金氏病(占10%病例)、嗜酸性肉芽肿、家族性嗜酸性细胞增多症、热带嗜酸性细胞增多症、甲状腺癌及播散性结缔组织病。
与化学药物有关:
镍(致皮肤炎)、青霉素、PAS、苯、呋喃妥因、磺胺等。
③嗜碱性粒细胞:
在正常人血液中