NO对草莓炭疽病发生的影响及其可能作用机制Word下载.docx
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人们相信植物以获得的系统的抗性是基于茉莉酸甲酯调节信号以及与一些信号传导系统的联合，其中特别是诱导酶催化合成反应，形成国防化合物如多酚类，生物碱，活性氧（ROS）或相关（PR）病程的蛋白质（Harmsetal.,1995;
WasternackandParthier,1997）。
最近，茉莉酸甲酯表现出作用在预防疾病和病后的园艺作物。
茉莉酸甲酯的应用有效地抑制灰色霉菌引起的草莓灰霉病，削减小和上涨鲜花（Molineetal.,1997;
Meiretal.,1998;
Darrasetal.,2005），降低果实腐烂的木瓜果实感染木霉菌和链格孢菌（Gonz´
alez-Aguilaretal.,2003）。
采后绿霉病衰变造成葡萄柚通过指状青霉减少暴露的水果茉莉酸甲酯vapor（Drobyetal.,1999）。
经过茉莉酸甲酯处理，存储新鲜的芹菜储存时间和辣椒的延长减少微生物污染和减少生理恶化（布塔和莫林，1998年）。
茉莉酸甲酯也已找到提高抗病甜樱桃（YaoandTian,2005a）和桃果实（（YaoandTian,2005b）。
此外，这个信号分子，当外部应用，已被显示诱导表达的一套防卫基因，从而加强抵抗病原体番茄果实（Dingetal.,2002）。
最近，我们发现，枇杷冷藏水果（Caoetal.,2007）在10umol/L茉莉酸甲酯条件下处理的能有效地抑制腐败的发生率。
然而，模式的试验中茉莉酸甲酯抑制枇杷果实腐烂尚未明确阐明。
这项工作的目标是调查茉莉酸甲酯减少枇杷果实炭疽病腐病引起的炭疽病菌的影响，并探讨可能的机制。
2。
材料与方法
2.1。
植物材料和茉莉酸甲酯处理
成熟枇杷（EriobotryajaponicaLindl.cv.Jiefangzhong）水果在手工收割阶段，选定统一大小和颜色，而且没有视觉缺陷，然后随机分为2组各120个水果。
这两个群体的水果被安置在125L密闭容器治疗。
在初步研究中，我们发现，用10umol/L的茉莉酸甲酯处理对防治腐烂提供最大的保护，即使在没有药害发生的枇杷果实（数据未显示）防止真菌衰变，由其是集中用于茉莉酸甲酯治疗的工作。
培养20◦C的24小时的条件下茉莉酸甲酯（Aldrich公司，化工公司，Wilwaukee，威斯康星，美国）被发现在滤纸上最后水汽浓度0（对照组）或10umol/L时，。
治疗后，打开容器，病原体接种前两个群体果实均被留在20◦C的24小时。
2.2。
病原菌接种，组织培养和水果抽样
炭疽病菌分离感染枇杷果实和保持对马铃薯葡萄糖琼脂培养基（（PDA：
去皮马铃薯：
200克;
葡萄糖，20克;
琼脂，20克和去离子水，800毫升）。
炭疽病菌孢子取自26◦C孵育2周龄的水浸环境与无菌水。
孢子的浓度调整为1×
105个孢子/毫升的血球。
该疫苗进行了24h后茉莉酸甲酯治疗。
无论是茉莉酸甲酯处理和控制水果70％乙醇消毒，然后在两个地点各解剖水果（直径2毫米×
4毫米深）。
Aliquot（15ul）1×
105个孢子/毫升分别接种到每个伤口。
那个接种果实密封在聚乙烯内衬塑料箱保持相对湿度高（约95％）和20◦C培养6天。
接种之后第4和第6天,疾病发病率和病灶直径每个果实伤口录2。
当区可见腐烂的伤口以外的每个领域水果超过1毫米宽，这是算作水果感染。
有三个复制15水果每治疗，与实验进行了两次。
水果样品取自接种前（24小时茉莉酸甲酯处理后，时间0）5个果实，并在第2，第4和第6天之后接种酶检测和测量蛋白质，总酚类，过氧化氢和木质素含量。
每个处理重复三次，实验进行了两次。
2.3。
酶活性测定
所有的酶提取程序在4◦C进行。
为了超氧化物歧化酶，1克的组织实地5mL的50mM钠磷酸盐缓冲液（pH7.8）。
组织（1克）的地面5mL的50mM磷酸钠缓冲液（pH7.0）进行CAT（电子计算机横断层扫瞄），或50mM磷酸钠缓冲液（pH7.0），包含0.1mMEDTA，1mM的抗坏血酸和1％聚乙烯吡咯烷酮（聚维酮PVP）进行APX。
PAL制式提取遥控硼酸钠缓冲液，在pH8.7载有20mM的B-巯基乙醇。
对多酚氧化酶（PPO），1克该组织实地5mL的遥控磷酸钠缓冲液（pH6.5），其中载有1％皮维，或使用50mM钠硼酸盐缓冲在pH值8.7的酶。
提取物，然后匀浆离心10000×
克在4◦C，20分钟。
那个上清用于酶检测。
超氧化物歧化酶（SOD）活性测定的方法，拉奥等人。
（1996年）在最后3毫升量，其中载0.1mL原油酶提取。
一个单位的超氧化物歧化酶活性的定义是数额酶，造成了50％抑制硝基蓝四。
CAT活性测定根据ChangeandMaehly（1955）的方法。
一个CAT单位的定义为一定数量的酶在30。
C时分解1umol的H2O2/min。
APX活动已被NakanoandAsada（1989）进行了描述。
一个单位的APX被界定为室温下数额氧化酶氧化1umol抗坏血酸/min。
PAL制式测定方法的描述由扎克（1968年）。
该法中载0.1mL的酶提取和1mLL-苯丙氨酸。
在40◦C下孵化1h时，反应停止增加0.2毫升的6N盐酸。
苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性是确定测量吸光度在290nm左右。
一个单位的PAL活性被界定为：
在特定条件造成吸光度在290nm处的1小时内增加0.01的酶数量。
经过穆尔和莫里斯（1974年）的一些修改，多酚氧化酶的测定方法被确定下来。
检测培养基0.1mL酶的提取和2mL邻苯二酚。
多酚氧化酶（PPO）活性通过测量在410nm左右的吸光度。
一个单位多酚氧化酶活性的定义为在特定条件下410nm的1分钟造成吸光度增加0.01的酶的数量。
POD活性测定使用Kochba等的方法的，（1977年）有一些修改。
检测混合载50mM醋酸钠（pH值5.4），0.75％过氧化氢，20mM的愈创木酚和粗酶提取液0.2毫升。
过氧化物酶活性测定,测量吸光度在460nm左右。
一个单位的POD活性的定义是在460nm的1分钟增加造成的吸光度0.01的酶量。
酶提取物中蛋白质含量的估计使用布拉德福德（1976年）的方法，使用牛血清白蛋白作为标准。
所有酶的特殊活性表示为每毫克蛋白中的酶单位。
2.4。
测量总酚过、氧化氢和木质素含量
总酚酸含量测定根据Folin-Ciocalteu程序（SlinkardandSingleton,1977）.。
冻结组织匀浆用冷冻80％丙酮和离心10,000×
克 20分钟，4◦C 。
上清用于分析。
结果显示毫克没食子酸当量（GAE）每100克鲜重。
对于过氧化氢的水平，２克新鲜植物组织匀浆，5mL冷冻了的100％丙酮，然后在10000×
g20分钟4◦C离心。
上清收集立即根据帕特森等人（1984年）的方法分析过氧化氢。
H2O2含量表示为 umol/gFW.
木质素是根据Femeniaa等（1998年）作一些改动的方法已经确定的。
样片分散在72％硫酸在室温下6小时然后稀释至１MH2SO4和加热到100◦C持续2.5小时。
不溶性材料回收的过滤和彻底清洗用热水（90◦C），直至无酸,然后在105◦ç
下干燥过夜。
以残留量标记的木质素含量结果以百分数表示。
2.5。
茉莉酸甲酯对炭疽病菌体外生长的影响
2.5.1。
孢子萌发和芽管生长
茉莉酸甲酯对炭疽病菌孢子萌发和芽管伸长的影响，在马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）使用田等人的方法（2002年）作一些改动，进行了评估。
1×
105个孢子/毫升的悬浮液的准备如前面描述。
等分试样100uL的病原体悬浮液被转移到载有5mLPDB或没有10umol/L的茉莉酸甲酯的玻璃管中。
所有管放在一个旋转振动筛100rpm26◦C。
近似100孢子病原体的发芽率和芽管长度测定在12和24h培养后。
当芽管长度等于或大于孢子长度时，孢子被确定为萌发。
每个处理重复3次，实验重复两次。
2.5.2。
菌丝生长
茉莉酸甲酯对菌丝生长的影响，已经被YaoandTian（2005a）的方法分析过。
茉莉酸甲酯溶液混合熔融的PDA琼脂提供总额为20mL在每个Petri板（直径：
90毫米）。
在PDA的琼脂中茉莉酸甲酯浓度为10umol/L的。
在琼脂已经凝固，5毫米范围的炭疽病菌被安置在每一个的Petri板的中心。
板孵育在20◦C下,菌落直径在接种48和72h后,确定24。
每次处理反复3次和实验重复两次。
炭疽病菌的菌丝生长在PDA上用增长率表示.
根据计算公式如下:
增长率（％）=（接种后菌落直径5mm）/5mm×
100。
2.6。
数据分析
实验采用完全随机设计。
全部运用SPSS软件（SPSS软件公司，伊利诺伊州芝加哥，美国）进行了统计分析。
这些数据进行了单方差分析（方差分析）。
平均离值进行了Duncan范围试验。
分歧在P<
0.05被视为重要。
3。
结果
3.1。
茉莉酸甲酯处理对病灶直径影响和接种炭疽病菌枇杷果实的疾病发病率
经茉莉酸甲酯治疗疾病发病率明显降低,病灶直径在接种炭疽病菌后也明显降低.在枇杷果实接种炭疽病菌后分别控制在20◦C水果潜伏期的第2和第4天（图1A）,茉莉酸甲酯处理的水果的发病率为12.2和30.6％。
与此同时，处理后分别控制在水果的第4和第6天的潜伏期（图1B）,病灶直径在处理的水果中只有55.1和64.0％。
尽管所有接种都经茉莉酸甲酯处理和对照组水果在经过6天的潜伏期后,腐烂症状均有所增加，但是,经茉莉酸甲酯处理的水果的病灶直径仍然显着低于对照组水果（p<
0.05）。
图1。
疾病发病率的变化（A）和在20◦C孵化过程中枇杷果实中炭疽病菌的病灶直径（B）。
每一列代表三份样本的平均值。
竖线代表标准错误的手段。
价值观的不同字母图。
１，（Ａ）显示疾病发生率的变化；
（Ｂ）图显示枇杷果经炭疽病感染后保温在２０.Ｃ的病灶直径。
图.2枇杷果实接种炭疽病菌后在20◦C孵化期间，茉莉酸甲酯对超氧化物歧化酶（A），CAT（B），APX（C）活性和H2O2含量（D）的影响。
数据按平均三分分析。
图二，病菌感染后保温在２０ 。
Ｃ，茉莉酸甲酯对SOD（A）,CAT（B）,APX（C）活性，H2O2含量（Ｄ）的影响。
3.2。
茉莉酸甲酯处理对枇杷果实中SOD活性酶,APX和H2O2含量的影响
超氧化物歧化酶SOD的活性在枇杷果实孵化中逐渐下降，但并没有在控制的和茉莉酸甲酯
处理的水果（图2A）之间发现超氧化物歧化酶活性有显着差异。
过氧化氢酶CAT的活动和
APX在较早时期的孵化中下降，接种后观察6日,并略有增加。
与对照水果相比，经过茉莉酸甲酯
处理的水果,在头4天的潜伏期明显（P<
0.05）抑制CAT的活动和APX，但是在在6天的潜伏期（Fig.2BandC）.,增加了它们的活动.过氧化氢的水平在枇杷果实接种后增加。
所图Fig.3D所示。
茉莉酸甲酯处理显著（P<
0.05），促进了过氧化氢在头4天的孵化厚的积累，并且过氧化氢的含量在茉莉酸甲酯处理的水果中为13.4和30.8％，分别高于控制在水果的第2和第4天。
然而，在第6天（p<
0.05）,过氧化氢的含量明显低于经茉莉酸甲酯处理的水果。
3.3茉莉酸甲酯处理对PAL的活性，多酚氧化酶，POD和木质素及枇杷果实中总酚的影响
PAL活性在处理和对照组水果中随孵化时间而增加，分别在第2和第4天达到峰值，然后在剩余孵化的时间里下降。
与对照组（Fig.3A）.相比，3天的潜伏期后，经茉莉酸甲酯处理可减少峰值，显著维护（P<
0.05）较低的PAL活性。
多酚氧化酶PPO和POD活性在孵化期间增加，然而经茉莉酸甲酯处理，明显的抑制它们的活动（Fig.3BandC）（P<
0.05）的增加。
木质素的水平增加，而同时总酚在发病潜伏期减少。
用茉莉酸甲酯处理水果降低木质素的积累（Fig.3D）但是推迟了枇杷果实中总酚含量的下降（Fig.4）.。
图.3在枇杷果实接种炭疽病菌后，在20◦C孵化期间，茉莉酸甲酯对PAL制式（A），多酚氧化酶（B），过氧化物酶（C）活性和木质素含量（D）的影响。
数据为三组试验分析的值。
图.4枇杷果实接种炭疽病菌后，在20◦C潜伏期茉莉酸甲酯对总酚含量的影响。
数据表示为三份实验值。
图.5茉莉酸甲酯对炭疽病菌菌丝在体外生长的影响。
数据为三份实验的平均值。
3.4。
茉莉酸甲酯对在体外生长的炭疽病菌的影响
茉莉酸甲酯处理抑制在PDB中炭疽病菌孢子萌发和芽管增长，用MeJA处理，孵化12或24小时（表1），孢子萌发率和芽管长度显着（P<
0.05）低于样品对照组。
茉莉酸甲酯
处理也显着抑制在PDA上的炭疽病菌菌丝的增长。
在72小时20◦C的潜伏期（图5）经甲基茉莉酸处理的菌落增长速度显著低于对照组。
表1：
10umol/L的茉莉酸甲酯对体外的炭疽病菌孢子萌发和芽管长度的影响
处理 孢子萌发（%）芽管长度（um）
12h后24h后12h后24h后
对照39.9±
2.1a96.4±
0.8a4.03±
0.56a6.09±
0.36a
MEJA11.1±
1.4b26.8±
2.8b2.50±
0.12b3.08±
0.42b
发芽率和芽管长度测量使用显微镜在PDB潜伏期为26◦C在12和24h近似100病原孢子。
数据表示为三份±
S.E.实验的平均值。
其值在一栏，其次是不同的值，根据Duncan的多重测试范围在P=0.05的水平，值是明显不同的。
4。
讨论
病原体感染的植物中茉莉酸甲酯牵连的信号通路能介导诱导防御反应并常与防御有关的酶和化合物（CreelmanandMullet,1997）的积累紧密联系。
当外部应用时，茉莉酸甲酯已被证明导致低发病率和低衰减，提高几个水果（Dingetal.,2002;
YaoandTian,2005a,b）抗病性。
.在这项研究中，我们发现，茉莉酸甲酯处理可以大大减少发病率和枇杷果实接种炭疽病菌炭疽病腐病灶直径。
这些结果表明，枇杷果实采后与茉莉酸甲酯处理抗病性提高了。
保护水果免于真菌病原体入侵主要归功于激活了高度协调的生化和结构性防御系统，该系统可以帮助抵御病原体蔓延。
活性氧物种（ROS）的积累有可能不仅对作为保护剂入侵的病原体，而且可作为信号进一步激活植物防御反应，可被各种化学激发子或病原体诱导（LambandDixon,1997）。
一般来说，活性氧的代谢由一系列酶包括超氧化物歧化酶（SOD;
EC1.15.1.1），过氧化氢酶氧化氢酶（CAT;
EC1.11.1.6）,和抗坏血酸过氧化物酶（APX;
EC1.11.1.11）.所控制。
氧气可被超氧化物歧化酶有效地转化为过氧化氢，而过氧化氢主要被APX和CAT所破坏。
据报道，水杨酸（SA）诱导的H2O2含量增加，是通过在几个植物的过氧化氢酶和APX的抑制介导的（Datetal.,2000;
LandbergandGreger,2002）。
而在纸浆的'
红肉'
脐橙，SA--预处理加速超氧化物歧化酶活性的增加，但显著地抑制了过氧化氢酶活性，导致贮藏期间更高水平含量的H2O2（Huangetal.,2008）。
最近，越来越多的证据表明活性氧之间的积累和减少水果采后易感性腐烂有密切的关系。
例如，更高水平的H2O2含量与BTH处理桃果实抑制衰变率有密切的联系（Liuetal.,2005a），早期收获的苹果较低的易感性及感染扩展
与增加的H2O2含量密切相关（Torresetal.,2003）。
SA处理增加了过氧化氢和O2-含量和增强了芒果的抗炭疽病腐烂（Zengetal.,2006）。
在本研究中，茉莉酸甲酯处理显着抑制酶的活动和APX，，而超氧化物歧化酶活性在早期感染中并不受到显著影响，从而导致枇杷果实中更高水平的过氧化氢。
这些结果表明过氧化氢生成增强可能是茉莉酸甲酯处理琵琶果实触发抗病性主要因素之一。
虽然活性氧可以有助于提高植物组织中的抗病性，过量的这些化合物通过过氧化脂质有牵连的破坏植物细胞（InzeandMontagu,1995）。
因而，有效的抗氧化活性对维持活性氧的浓度处于较低水平是至关重要的（HodgesandForney,2000;
Vicenteetal.,2006）。
本研究表明，由茉莉酸甲酯或相应的试剂处理，CAT和APX的活性明显地增加，中后期孵化期，过氧化氢含量明显较低。
全部这些结果表明，茉莉酸甲酯治疗不仅提高枇杷果实早期感染后活性氧生成，也有在孵化后期增加清除组织过剩的活性氧的能力。
苯丙途径在次植物代谢中是一个重要途径，该途径产生了结构和防御有关的功能各种酚酸，包括木质素，酚酸，苯乙烯，和黄酮类化合物。
苯丙氨酸丙氨酸解氨酶（PAL;
EC4.3.1.5）是一个在第一步苯丙途径中关键的酶，该酶直接参与在酚类化合物，植物抗毒素和木质素的合成，这些与局部抗性过程相关（Ryalsetal.,1996）。
多酚氧化酶（PPO;
EC1.10.3.1）和过氧化物酶（POD;
EC1.11.1.7）都参与了寄主植物细胞木质化过程，被视为与防御对病原菌感染反应相关的关键酶（MayerandHarel,1991;
WallaceandFry,1999）。
在桃果实接种经P.扩展，BTH或1-MCP处理，加强了包括PAL，PPO和POD活性以及总水平的酚类化合物的活性，被认为在增加抗病性中发挥了重要的作用（Liuetal.,2005a,b）。
Suetal.（2003）报道茉莉酸甲酯治疗显著的增加了PAL和POD活性及木质素含量，这可能会解释在茉莉酸甲酯处理的菜用大豆豆荚中具有高抗病性和低衰减指数的原因。
YaoandTian（2005a,b）发现，用茉莉酸甲酯治疗可诱导
更强的PAL和POD活性，并大大降低了由桃褐腐病菌（Moniliniafructicola）或者扩展青霉（P.expansum）在樱桃和桃果实中的病变直径。
与此相反，我们的研究表明，治疗降低了PAL，多酚氧化酶和POD的活性，抑制了枇杷果实的木质素合成，而在茉莉酸甲酯治疗的水果中观察到了低炭疽病发生率病，而此揭示了木质化并不是茉莉酸甲酯在枇杷果实中诱导出疾病抗性的一个决定性因素。
为了进一步了解茉莉酸甲酯抑制炭疽病菌感染引起的炭疽病腐病其中的机制，我们调查了茉莉酸甲酯对病原体的增长直接效果。
我们的结果表明，茉莉酸甲酯显著的抑制炭疽病菌的孢子萌发，芽管伸长和菌丝生长，这可能对炭疽病在枇杷果实腐烂的防御机制起作用。
YaoandTian（2005b）也观察到，茉莉酸甲酯减少菌丝生长的扩展青霉（P.expansum）。
然而，其他研究人员报告说，茉莉酸甲酯不可能直接影响到一些真菌等病原体的增长，例如：
指状青霉（P.digitatum）和桃褐腐病菌（M.fructicola）（Drobyetal.,1999;
TsaoandZhou,2000;
YaoandTian,2005a）。
这些不同的结果可能与不同的真菌物种对茉莉酸甲酯的敏感性不同有关。
最后，本研究表明，茉莉酸甲酯治疗
能有效地抑制枇杷果实采后由炭疽病菌炭疽病造成的腐烂。
假设，疾病的控制
是直接由于茉莉酸甲酯对病原体的增长的抑制作用，并间接因为氧化氢水平的增强引发源性疾病抗性。
鸣谢
这项研究得到了自然科学基金资助项目的赠款
（30471215）和中国科技部长的支持（2006BAD22B05）。
参考资料：
Bradford,M.M.,1976.Arapidandsensitivemethodforthequantitationof
microgramquantitiesofproteinutilizingtheprinciple-dyebinding.
Anal.Biochem.72,248–254.
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