黄酮吸附特征Word下载.docx
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2.6pH值对吸附的影响11
2.7动态吸附试验11
3结论14
参考文献16
致谢17
附录
河西学院本科生毕业论文（设计）诚信声明
本人郑重声明：
所呈交的本科毕业论文（设计），是本人在指导老师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，成果不存在知识产权争议，除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。
对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明确方式标明。
本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。
作者签名：
二O一三年六月八日
河西学院本科生毕业论文（设计）开题报告
论文题目
葡萄籽黄酮在X-5树脂上的吸附特征
学生姓名
XXX
所属学院
农业与生物技术学院
专业
生物科学
年级
2009级
指导教师
所在单位
河西学院
职称
讲师
开题日期
2012.10
选题的根据：
选题的理论、实际意义并综述有关本选题的研究动态和自己的见解
葡萄这种世界性水果栽培面积和产量长期居世界水果首位，其中80%的葡萄用于酿酒，13%用于食用，7%用于加工果汁及其他葡萄制品。
酿酒后的葡萄籽与葡萄皮很多被作为工业废渣排放，这不仅浪费资源而且污染环境。
截止2009年，甘肃省酿酒葡萄种植面积达14万亩，有多家葡萄酒生产企业，产能接近10万吨，年产量达2.41万吨，且酿酒葡萄种植基地以及葡萄酒生产企业主要集中在河西地区，这说明河西地区每年会有大量葡萄酒生产下脚料产生，为保护环境，充分利用资源，需要对葡萄酒生产下脚料进行再利用。
葡萄籽与葡萄皮中含有黄酮，现代科学证明黄酮具有多种保健功能，因此，对黄酮类化合物的研究与利用越来越受到人们的重视，其在食品，医药，保健品和化妆品等领域也将具有广阔应用前景。
在实验室条件下，可以利用大孔吸附树脂对黄酮等植物天然成分进行分离，纯化，大孔吸附树脂具有物理化学稳定性高、吸附选择性独特、再生简便、解吸条件温和、使用周期长、易于循环利用、成本低等诸多优点。
本研究主要立足于大孔吸附树脂对葡萄籽黄酮的吸附，通过比较几种树脂对葡萄籽黄酮吸附和解吸附能力，确定使用X-5大孔吸附树脂对葡萄籽黄酮进行分离提纯，以及研究不同实验条件对X-5大孔吸附树脂吸附黄酮能力的影响。
其实际意义有以下几点：
1.比较几种大孔吸附树脂对葡萄籽黄酮的吸附与解吸附能力，确定本实验室对葡萄籽黄酮提取与纯化需使用的大孔吸附树脂
2.通过研究X-5大孔吸附树脂对葡萄籽黄酮的静态吸附和动态吸附，确定分离提纯葡萄籽黄酮的各种最佳条件，优化分离提纯工艺
3.通过对葡萄酒厂下脚料葡萄籽中黄酮的分离纯化研究，可以充分利用资源，废物利用，减少废料对环境的污染
论文的主要内容、基本要求及其主要的研究方法：
本研究的主要内容：
主要从6种大孔吸附树脂中筛选出分离纯化葡萄籽黄酮的最佳树脂，然后分别进行静态吸附试验和动态吸附试验。
其中静态吸附试验研究上样黄酮浓度，上样量与树脂量比（V/m），上样液pH对吸附率的影响及静态动力学试验；
动态吸附试验使用湿法装柱，研究上柱液流速对树脂动态吸附性能的影响，乙醇浓度、洗脱体积、洗脱流速对解吸率的影响，从而确定较佳的吸附工艺条件。
基本要求：
试验数据的记录真实、客观、准确；
文章格式要求写作规范、主题突出、层次分明；
熟练地掌握计算机操作，解决和处理毕业论文（设计）相关问题。
要积极主动地与指导老师联络，以便论文完成顺利，为论文答辩做好充分准备。
主要研究方法如下:
最佳大孔树脂筛选；
NaNO2-Al（NO3）3比色法测定计算黄酮浓度；
湿法装柱；
静态吸附特征研究；
动态吸附特征研究。
论文进度安排和采取的主要措施：
进度安排：
2012年11月选题准备阶段
2012年12月整理阅读主要资料
2013年2月设计与确定实验方案，样品采购，药品准备
2013年3月树脂选择，静态吸附试验及数据整理
2013年4月动态吸附试验及数据整理，完成初稿
2013年5月初稿修改，完成终稿
2013年6月论文答辩、上交
采取的主要措施：
一、根据论文题目参阅有关文献资料，写出综述报告
二、整理阅读主要资料设计与确定实验方案
三、筛选最佳大孔吸附树脂并进行静态、动态吸附试验
四、解吸附试验
主要参考资料和文献：
李凤英,李润丰（2002）.葡萄籽中主要化学成分及其开发应用.河北职业技术师范学院学报（02）:
26-31.
吴嘉慧,袁春龙,宋洋波（2011）.葡萄籽功能性成分及其应用.日用化学工业41（3）:
216-221.
王克勤,罗军武,刘仲华等（2009）.葡萄皮中黄酮类化合物的提取分离与鉴定.食品与机械25（6）:
212-215.
张来,杨碧昌,何绍红等（2011）.植物黄酮类化合物的基础研究及应用.安顺学院学报13（3）:
132-135.
刘彬果,郭文勇（2003）.大孔树脂吸附技术在中药制剂中的应用.解放军药学学报19（6）:
452.
张亚梅,张晓娟,简晖等（2009）.大孔吸附树脂树脂纯化山腊梅叶中总黄酮的研究.中草药40（8）:
1226-1229.
彭世顺,彭拓华,张少俊等（2011）.大孔树脂吸附人参总皂苷的使用寿命及强化再生的研究.今日药学21（5）:
272-276.
张德一,张秀荣（2010）.大孔吸附树脂在中药有效成分分离纯化中的应用.吉林医药学院学报31（6）:
356-359.
任荣军（2008）.大孔树脂吸附技术在黄酮类成分分离与纯化中的应用.中国药业17（6）:
71-73.
指导教师意见：
签名：
年月日
教研室意见
负责人签名：
年月日
学院意见
摘要：
为分离、纯化葡萄籽黄酮，比较了6种大孔树脂的静态吸附过程，筛选出适合吸附葡萄籽黄酮的树脂；
研究了葡萄籽黄酮在大孔吸附树脂上的静态和动态吸附特性，并确定分离葡萄籽黄酮的最佳条件，结果表明：
X-5大孔吸附树脂对葡萄籽黄酮有较好的吸附分离性能，其对葡萄籽黄酮的静态吸附平衡时间为4小时，吸附形式为单分子吸附，吸附样液最适pH值为5.0；
操作流速、葡萄籽黄酮浓度、pH等工艺条件对X-5树脂的动态吸附动力学曲线都有影响，确定树脂柱的较佳操作条件为：
上样流速1mL·
min-1，吸附浓度2mg·
mL-1，洗脱剂为95%乙醇，洗脱体积1.6BV，洗脱流速1mL·
min-1。
关键词：
葡萄籽；
黄酮；
大孔吸附树脂
AdsorptionCharacterOfFlavonoidsFromQrapePipByX-5Resin
Abstract：
Fortheseparationandpurificationofflavonoidsfromgrapepip,comparedthestaticabsorptionprocessof6differentkindsofmacroporousresin,screenedouttheproperresinwhichcanabsorbtheflavonoidsfromgrapepip.Alsoresearchedthestaticanddynamicadsorptioncharacteristicofflavonoidsfromgrapepipapepiponthemacroporousresinanddeterminedtheoptimalconditionsofseparationofflavonoidsfromgrapepip.X-5macroporousresinhasabetterperformanceofabsorptionandseparationtotheflavonoidsfromgrapepip.TheequilibriumtimeofX-5macroporousresintothestaticabsorptionofflavonoidsfromgrapepipis4h.Theabsorptionformissinglemolecularadsorption,andtheoptimumpHvalueofabsorptionsamplesolutionis5.0.Theflowrateoftheoperation,theconcentrationoftheflavonoidsfromgrapepip,thepHvalueotherandtechnologicalconditionshaveanimpactondynamicabsorptionkineticcurveoftheX-5macroporousresin.Finally,ascertainedthebestoperationconditionofresincolumnislikebelow.Thesamplingflowrateis1mL·
min-1,theadsorptionconcentrationis2mg·
mL-1,theeluentis95%ethanol,theelutionvolumeis1.6BVandtheflowrateofelutionis1mL·
min-1.
Keywords：
Grapepip;
Flavonoids;
Macroporousadsorptionresin
引言
葡萄是一种世界性水果，栽培面积和产量长期居世界水果首位，其中80%的葡萄用于酿酒，13%用于食用，7%用于加工果汁及其他葡萄制品（刘崇怀2012）。
酿酒后的葡萄籽很多被作为工业废渣排放，这不仅浪费资源而且污染环境（李华和绍建辉2004）。
葡萄酿酒或进行果汁加工的下脚料主要是葡萄皮与葡萄籽，两者约占鲜果重量的20%（李凤英和李润丰2002）。
葡萄籽与葡萄皮中含有黄酮（吴嘉慧等2011；
王克勤等2009），现代科学研究证明黄酮类化合物具有抗氧化、抗菌消炎、抗过敏、抗病毒、抗癌（赵梅和周琴2013）、抗衰老、降血糖、抑制高血压高血脂及预防心血管疾病、护胃保肝等多种药理作用（刘金霞等2002；
曹杰2010；
李荣和李俊2005）。
因此，对黄酮类化合物的研究与利用越来越受到人们的重视，其在食品，医药，保健品和化妆品等领域也将具有广阔应用前景（张来等2011；
黄池宝和罗宗铭2000；
郭芳彬2005）。
大孔吸附树脂具有物理化学稳定性高、吸附选择性独特、再生简便、解吸条件温和、使用周期长、易于循环利用、成本低等诸多优点，广泛应用于天然产物的提取分离，在植物天然活性成分的分离、纯化中得到广泛应用（张亚梅等2009；
张德一和张秀荣2010；
彭世顺等2011；
刘彬果和郭文勇2003）。
本实验采用X-5大孔吸附树脂对葡萄酒下脚料中葡萄籽黄酮进行分离与纯化，并对葡萄籽黄酮在大孔吸附树脂上的静态和动态吸附特性进行初步研究，为葡萄籽黄酮进行深加工奠定基础。
1材料与方法
1.1材料与试剂
葡萄籽：
购于滨河集团的葡萄酒酿造下脚料；
芦丁、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、无水乙醇为分析纯；
大孔吸附树脂：
D301，001×
7，AB-8，D301，X-5，717。
1.2仪器与设备
722型可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司），HZ-D3型循环水式多用真空泵（常州国华电器有限公司），BT300FJ型恒流泵（保定申辰泵业有限公司），PL203型电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司），XO-SM50型超声波发生器（南京先欧仪器制造公司）。
1.3试验方法
1.3.1葡萄籽黄酮粗提液制备
葡萄籽粉碎，用50%乙醇，料液比为1:
5（m/V）混合，超声处理10min，抽滤得滤液，测黄酮含量备用。
1.3.2黄酮含量测定
本实验采用NaNO2-Al（NO3）3比色法（张斌等2010）测定黄酮含量，在510nm处测吸光值。
利用贾贵华等的方法得到标准曲线方程为：
Y=1.2450X－0.0024（R2=0.9992），其中X—黄酮浓度（mg·
mL-1）；
Y—OD值。
1.3.3大孔吸附树脂的预处理
新树脂孔内含有合成树脂时残留的致孔剂等杂物，故应将其出去，用95%乙醇浸泡树脂，倾去上浮的杂物，然后将树脂装柱：
在柱内加入约柱体积1/4的乙醇，将树脂小心沿管壁导入柱中。
通入乙醇，控制流速每分钟为树脂柱床体积的1/25，直至流出液与蒸馏水混合不产生浑浊为止。
再用蒸馏水洗至流出液无醇味即可，最后用蒸馏水浸泡备用。
使用时真空抽滤，成为抽干树脂。
1.3.4静态吸附试验
1.3.4.1大孔吸附树脂材料的确定
准确称取经过预处理后抽干的6种树脂各1g装入三角瓶中，分别加入吸附样品6mL，室温放置12h，测定吸附后的溶液中黄酮浓度，根据式
（1）、
（2）计算各树脂室温下的吸附量和吸附率。
再将饱和吸附后的树脂过滤并用蒸馏水洗，抽干后加入10mL无水乙醇洗脱12h，测定无水乙醇中黄酮浓度，根据式（3）计算解吸率。
然后根据吸附率与解吸率选择最佳树脂。
Q=（C0－Ce）V1/m
（1）
E=（C0－Ce）/C0×
100
（2）
D=CxV2/[（C0－Ce）V1]×
100（3）
Qt=（C0－Ct）V1/m（4）
式中Q—吸附量（mg·
g-1）；
C0—初始浓度（mg·
Ce—平衡浓度（mg·
V1—加入的原液体积（mL）；
m—树脂用量（g）；
E—吸附率（%）；
D—解吸率（%）；
Cx—洗脱液浓度（mg·
V2—洗脱液体积（mL）；
Qt—t时刻树脂吸附量（mg·
Ct—t时刻吸附液浓度（mg·
mL-1）。
1.3.4.2黄酮浓度与吸附率的关系
分别称取筛选出的树脂0.5g装入6个三角瓶中，然后在6个三角瓶中分别加入浓度为4mg·
mL-1、3.5mg·
mL-1、3mg·
mL-1、2.5mg·
mL-1、2mg·
mL-1、1mg·
mL-1的吸附样品，室温静置12h，测定并计算不同浓度下树脂对葡萄籽黄酮的吸附率。
1.3.4.3吸附样品量与树脂量之比与吸附率的关系
分别称取筛选出的树脂0.5g装入6个三角瓶中，然后在6个三角瓶中分别加入2mL、4mL、6mL、8mL、10mL、12mL葡萄籽黄酮溶液，即V/m分别为1:
4、1:
8、1:
12、1:
16、1:
20、1:
24，室温静置12h，测定并计算不同浓度下树脂对葡萄籽黄酮的吸附率。
1.3.4.4静态动力学试验
综合1.3.4.2、1.3.4.3步骤筛选出的最佳体积与浓度进行吸附试验，每隔1h测定其黄酮含量，根据（4）式计算吸附量，绘制静态动力学曲线。
1.3.4.5吸附等温线的绘制
mL-1的吸附样品，静置12h，测定并计算不同浓度下树脂对黄酮的吸附量，以静态吸附量和对应的平衡浓度作图，即为该温度下吸附树脂对葡萄籽黄酮的吸附等温线。
1.3.4.6吸附液pH值的选择
准确称取抽干的树脂0.5g，置于三角瓶中，再依次加入不同pH值分别为3、4、5、6、7、8的葡萄籽黄酮溶液各4mL，测定其葡萄籽总黄酮的静态吸附量，研究其对葡萄籽总黄酮吸附性能的影响，确定适宜上柱的pH值。
1.3.5动态吸附试验
树脂湿法装柱（2.6cm×
40cm），葡萄籽黄酮提取液以一定的流速通过吸附柱，测定流出液中葡萄籽黄酮浓度，流出液与上样液中葡萄籽黄酮浓度比值的百分数为漏出率，漏出率对上样液体积作图，为树脂的动态吸附曲线。
研究上柱液流速对树脂动态吸附性能的影响，乙醇浓度、洗脱体积、洗脱流速对解吸率的影响，从而确定较佳的吸附工艺条件。
2结果与讨论
2.1大孔吸附树脂的筛选结果
6种大孔吸附树脂对于葡萄籽黄酮的吸附率与解吸率见表1，由表1可以看出树脂D301、X-5、717吸附率较高，而D101、AB-8、X-5解吸率较高。
综合吸附率与解吸率，可以看出树脂X-5对于葡萄籽黄酮有较好的吸附性能与解吸性能，因此本实验选用X-5大孔吸附树脂来分离、纯化葡萄籽黄酮。
表1不同树脂的静态吸附与解吸特性比较
Tab.1Comparsionsofstaticadsorptionanddesorptionperformanceofdifferentresins
树脂型号
D101
001×
7
AB-8
D301
X-5
717
吸附率
73%
64%
69%
96%
75%
87%
解吸率
17%
10%
13%
5%
34%
2.2黄酮浓度与吸附率的关系
分别测定葡萄籽黄酮溶液在不同浓度4mg·
mL-1时的静态吸附量，结果如图1所示，由图1可以看出在浓度2mg·
mL-1时，大孔吸附树脂X-5对于葡萄籽黄酮有较好的吸附效果，因此确定浓度2mg·
mL-1为宜。
2.3吸附样品量与树脂量之比与吸附率的关系
分别称取筛选出的树脂0.5g装入6个三角瓶中，然后在6个三角瓶中分别加入2mL、4mL、6mL、8mL、10mL、12mL葡萄籽黄酮溶液，静置12h，测定计算不同浓度下树脂对葡萄籽黄酮的吸附率作图如图2所示，可见在上样量为4mL即树脂量与上样量之比为1:
8时有较高的吸附效果，故选择吸附树脂量与上样量之比（m/V）为1:
8为宜。
2.4静态动力学试验
大孔吸附树脂的静态吸附动力学曲线如图3所示，该曲线反映了树脂吸附量与时间的变化关系。
由图3可知，在2h内，X-5树脂对葡萄籽黄酮类物质的吸附为快速平衡型，起始阶段吸附量较大，可以称之为第一阶段。
第二阶段为慢速吸附过程，到4h后，吸附量变化平稳，其静态吸附基本达到平衡。
因此X-5大孔吸附树脂的静态平衡吸附时间为4h。
根据Langmuir提出的吸附动力学方程：
LnQe/（Qe－Qt）=kt（5）
式中Qt—t时刻树脂吸附量（mg·
Qe—平衡树脂吸附量（mg·
k—平衡速率常数（min-1）。
以-ln[（Qe－Qt）/Qe]对时间t作图，拟合后得一直线方程-ln[（Qe－Qt）/Qe]=t，拟合相关系数为0.9785，根据斜率可得X-5树脂的平衡速率常数为1.3718min-1，表现为单分子吸附形式，该形式的起始瞬间吸附速率极大。
这种吸附速率快、容量大的特点使X-5大孔吸附树脂对葡萄籽黄酮的吸附具有较高的工业应用价值。
2.5吸附等温线的绘制
树脂的吸附等温线见图4，用Langmuir公式和Freundlich公式进行拟合。
根据Langmuir等温方程：
Ce/Qe=Ce/Qmax+1/aQmax（6）
式中Qmax—每克湿树脂的最大吸附量（mg·
a—常数；
以Ce/Qe对Ce作图得一直线，斜率为1/Qmax，截距为1/aQmax，进行方程回
归，并计算其决定系数R12。
根据Freundlich等温方程:
Qe=KCn（7）
式中n、K—常数，在双对数坐标下作图，lnQe=nlnC+lnK，得线性方程，进行方程回归，并计算其决定系数R22，结果见表2。
由表2可以看出，Langmuir模型比Freundlich模型能够更好地描述葡萄籽黄酮在X-5树脂上的吸附平衡过程。
表2模拟方程参数
Tab.2Calculatedresultsofmodelparameters
Langmuir方程
Freundich方程
Qmax（mg.g-1）
α
R2
n
K（×
10-3）
39.53
3112.60
0.8436
0.0413
0.0191
0.6551
2.6pH值对吸附的影响
分别测定葡萄籽黄酮溶液在不同pH值3、4、5、6、7、8时的静态吸附量，结果如图5所示，由图5可以看出，一定的酸性条件有利于葡萄籽黄酮的吸附。
其原因可能是黄酮类化合物含有酚羟基，在酸性条件下以分子状态存在，主要以范德华力与树脂进行物理吸附。
而在碱性条件下，以离子状态存在，不易与树脂发生物理吸附作用，因此确定吸附pH值5为宜。
2.7动态吸附试验
2.7.1动态吸附特征曲线
将浓度为5.08mg·
mL-1的黄酮样品液以1mL·
min-1的流速通过装有X-5树脂（2.6cm×
40cm）的层析柱进行动态吸附，分段收集流出液，每2mL为1份，共收集了13份。
通常情况下流出液的目标物浓度达到上样液目标物浓度的1/10时，认为达到了目标物的泄漏点。
由图6可看出，X-5树脂在此试验条件下对葡萄籽黄酮有比较好的吸附性能，泄漏点为16mL左右。
2.7.2上样流速的确定
将浓度为3mg·
mL-1葡萄籽粗黄酮样液20mL以不同的流速通过柱状大孔树脂，收集流出液并测定流出液中总黄酮的吸附量，计算不同流速下树脂对黄酮的吸附率。
由图7可以看出，上样流速对吸附率有很明显的影响，流速越慢吸附率越高，选择1mL·
min-1的上样流速为宜。
2.7.3水洗体积的确定
使用蒸馏水洗涤树脂柱，起到了很好的除杂作用，经水洗后的产品呈黄褐色脆性固体，而不用水洗时产物呈黄褐色粘稠物，具有明显的甜味。
一般当流出的水洗剂清亮透明时说明大部分杂质已经被去除。
用水洗时，开始流出的溶液颜色较深，当水洗剂用量为40mL时，流出液已经清亮，此时已基本把水溶性杂质洗脱下来。
所以水洗体积确定为40mL即0.8BV。
2.7.4解吸剂浓度的确定
常用的解吸剂是以最能溶解吸附质为原则，但要求沸点低，易于蒸馏回收，且同时要考虑环境保护等问题，综合考虑以上因素，选用水溶性好、低沸点的极性有机溶剂乙醇作解吸剂最好。
用含有62mg黄酮的吸附液进行吸附，待吸附液完全进入层析柱后关闭阀门，饱和吸附30min，然后用40mL蒸馏水正向洗脱，然后分别取50mL55%、65%、75%、85%、95%的乙醇溶剂进行洗脱，解吸流速控制为1mL·
min-1，分别收集水洗液和醇洗液并分别测定其中的总黄酮。
由图8可以看
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