菌种的选育与保藏Word文件下载.docx

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涂布分离法

用涂棒蘸取培养液，在固体培养基表面均匀涂平，获得单菌落。

精细型：

毛细管分离法：

利用培养皿或凹玻片等分离小室进行细胞分离。

也可以利用复杂的显微操作装置进行单细胞挑取。

流式细胞仪：

流式细胞仪（FlowCytoMeter,FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析和检测、筛选技术。

筛选方案：

4、性能鉴定：

平皿快速检测

生产性能测定

平皿快速检测法

第二节优良菌种选育

自然选育

诱变育种

一、自然选育

1、自然选育：

菌种在生产过程中不经过人工处理，利用微生物自身碱基突变而进行的菌种筛选过程。

①多因素低剂量的诱变效应：

辐射、H2O2、O2－

②互变异构：

DNA分子的碱基，存在酮式-烯醇式或氨式-亚胺式互变异构。

不同的互变异构体形成氢键的方向和能力不同，有可能导致复制时出现错误。

例如在正常情况下，A（氨式结构）与T（酮式结构）配对；

当A以亚胺式存在时（几率非常小），则与C配对。

2、诱变育种

利用各种被称为诱变剂的物理因素和化学试剂处理微生物细胞，使菌体负责遗传作用的DNA分子中的碱基对产生突变，进而采用简便、快速和高效的筛选方法，获得所需要的高产优质菌种的方法。

诱变育种原理：

基因突变

染色体畸变：

染色体或DNA片段发生缺失、易位、

重复等现象

基因突变：

DNA碱基发生变化

诱变剂：

物理、化学、生物三大类。

（1）物理诱变剂

紫外线、X-射线、γ-射线、激光、快中子、超声波、同位素等等

紫外线诱变机制：

造成DNA链断裂或是DNA分子内或分子间发生交联。

核酸物质的最大紫外线吸收峰值在265nm波长处。

（2）化学诱变剂

化学诱变剂的种类有许多，但具有高效诱变作用的并不多，常用的化学诱变剂根据其作用方式不同分为三种类型。

①与核酸碱基化学反应的诱变剂

此类型主要有烷化剂、亚硝酸和羟胺等。

烷化剂，带有一个或多个活性烷基，带一个活性烷基称单功能烷化剂，带二个或多个的分别称为双功能或多功能烷化剂。

它们的诱变作用是其与DNA中的碱基或磷酸作用。

常见的烷化剂有硫酸二乙酯（DES）、甲基磺酸乙酯（EMS）、亚硝基胍（NTG）、亚硝基甲基脲（NMU）、氮芥、乙烯亚胺和环氧乙酸等。

亚硝酸----亚硝酸的作用主要是使碱基氧化脱氨基，如使腺嘌呤（A）、胞嘧啶（C）和鸟嘌呤（G）分别脱氨基成为次黄嘌呤（H）、尿嘧啶（U）和黄嘌呤（X）。

复制时，次黄嘌呤、尿嘧啶和黄嘌呤分别与胞嘧啶（C）、腺嘌呤（A）和胞嘧啶（C）配对。

（2）、诱变育种的方法步骤

2.1制定筛选目标

①高产量

②生长速度快、产孢子多；

③消除某些色素或无益组分；

④能有效利用廉价的发酵原材料；

⑤改善发酵工艺中的某些缺陷（如泡沫过多、对温度波动敏感、菌丝太多、自溶早、过滤困难等）。

2.2制定育种方案

诱变筛选的典型流程见后图，除了增加了诱变处理，其他与前面所讲的自然选育过程基本相似。

菌株选育典型流程

出发菌株（砂土管或冷冻管）小试

原种特性考擦

斜面或摇瓶培养24h培养基优化

单孢子悬液菌悬液挑出高产菌株

诱变处理摇瓶复筛

处理前后计数

稀释涂平板传种斜面

观察单菌落形态

挑选单菌落转种斜面保藏菌株

对照组比较

摇瓶初筛挑出高产斜面

①出发菌株的选择

用来进行诱变实验的菌株就是出发菌株，对它的选择是诱变育种工作成败的关键，挑选出发菌株有以下几点原则：

a.来源于自然界直接分离的野生菌株.

b.有利于发酵产物合成的性状，出发菌株应具有生产上所需要的代谢特征。

c.要尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细胞体来作出发诱变细胞，这是由于变异性状大部分是隐性的，特别是高产基因。

d.生产或科研上经过多次诱变改造的菌株。

③诱变剂的选择

诱变剂复合处理及其协同效应

④突变株筛选

诱变处理后遗传性能发生变化：

营养缺陷型、抗性、代谢、呼吸缺陷、形态变异、生长繁殖、温度敏感性突变株。

ⅰ粗筛方法：

A：

菌体形态观察法：

形态与产量并没有完全相关性，形态特征变化可能引起产量变化，阿舒假囊酵母-VB2高产菌落深黄色，浅黄色、白色低产。

B：

平皿快速检测法a：

纸片显色法，浸有指示剂滤纸。

b：

变色圈法；

c：

透明圈法；

d：

生长圈法；

e：

抑制圈法。

ⅱ复筛摇瓶培养法：

a、抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变株的筛选

常用的筛选方法为：

1）抗末端产物结构类似物突变株。

2）利用营养缺陷型回复突变筛选抗反馈突变株。

例如：

谷氨酸棒杆菌的肌苷酸脱氢酶的回复突变株对其终产物鸟苷酸的反馈调节不敏感，从而提高了鸟苷酸的产量。

b、抗性突变株的筛选

这包括抗生素、金属离子、温度、噬菌体等抗性突变株的筛选。

方法是在平板中（分离培养基）和初筛培养基中加入不同的抗性物质，能够很好生长的菌株就为抗性突变株。

选择能和抗生素或合成中间体结合的对菌体生长有毒性作用的抑制剂,如二价金属离子加入培养基中，当抑制剂达到一定浓度时，抗生素低产菌株不能够生存，可以得到高产菌株。

c、组成型突变株的筛选

（1）通过加入诱导酶合成抑制物筛选组成酶的突变株。

如邻硝基-β-D-岩藻糖苷抑制β-半乳糖苷酶的合成。

（2）利用交替培养法使组成型突变株处于优势。

（3）显色法筛选组成型突变株生产酶。

如邻硝基苯半乳糖苷用于筛选β-半乳糖苷酶组成型突变株，刚果红用于筛选纤维素酶组成型突变株。

d、营养缺陷型的选育*

营养缺陷型是指通过诱变育种，出发菌株发生基因突变，致使细胞组成成分的合成途径出现某些缺陷，在只含有最低限度营养物质的基本培养基上不能生长，必须在此中培养基中加入某些有机营养物才能正常生长。

氨基酸、维生素和碱基

与营养缺陷型对应的是野生型。

能满足野生型菌株正常生长的培养基称基本培养基（MMminimalmedium）；

在基本培养基中有针对性地补加某一种或几种营养成分，以满足相应的营养缺陷型菌株生长需要（其他营养缺陷型仍不能生长）的培养基补充培养基（SMsupplementalmedium）；

可满足该菌各种营养缺陷型菌株营养需要的天然或半合成培养基完全培养基（CMcompletemedium），如牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基等。

营养缺陷型的用途：

营养缺陷型在生产上和科学研究上用途很大。

目前生产氨基酸、核苷酸的菌种都是各种类型的缺陷型。

要研究代谢途径，育种技术都必须有营养缺陷型的菌株为材料。

筛选营养缺陷型的步骤

菌种诱变

淘汰野生型

检出缺陷型

营养缺陷型的鉴定

二、淘汰野生型

原理：

野生型能在MM中生长，而缺陷型不能，于是将诱变处理液在MM中培养短时让野生型生长，处于活化阶段，而缺陷型无法生长，仍处于休眠状态。

①抗生素法：

由于细菌或酵母对一些抗生素敏感，于是就相应加入一定量的抗生素，结果活化状态的野生型就被杀死，保存了缺陷型。

一般细菌可以采用青霉素，酵母可采用制霉菌素。

②菌丝过滤法：

对于霉菌，因孢子生长后会长出菌丝体，就可用滤纸过滤法将菌丝滤去，而缺陷型孢子却因未发芽而不能滤过。

③添加化学试剂法：

青霉属、链霉菌属、芽孢杆菌属菌株可用25-50mg/mL五氯酚处理发芽孢子。

适当亚硫酸对霉菌发芽孢子有选择杀死作用

④差别杀菌法：

芽孢耐热性强，萌发后的菌体细胞不耐热，通过加热杀死营养体细胞，芽孢保存。

三、营养缺陷型菌株的检出

1、逐个检出法：

把经诱变处理的细胞群涂布在完全培养基的琼脂平板上，待长成单个菌落后，用接种针或灭过菌的牙签把这些单个菌落逐个整齐地分别接种到基本培养基平板和另一完全培养基平板上，使两个平板上的菌落位置严格对应。

经培养后，如果在完全培养基平板的某一部位上长出菌落，而在基本培养基的相应位置上却不长，说明此乃营养缺陷型。

2、夹层培养法：

先在培养皿底部倒一薄层不含菌的基本培养基，待凝，添加一层混有经诱变剂处理菌液的基本培养基，经培养后，对首次出现的菌落用记号笔一一标在皿底。

然后再加一层完全培养基，培养后新出现的小菌落多数都是营养缺陷型突变株。

3、限量补充培养法：

把诱变处理后的细胞接种在含有微量（＜0.01%）蛋白胨的基本培养基平板上，野生型细胞就迅速长成较大的菌落，而营养缺陷型则缓慢生长成小菌落。

若需获得某一特定营养缺陷型，可再在基本培养基中加入微量的相应物质。

4、影印平板法：

将诱变剂处理后的细胞群涂布在一完全培养基平板上，经培养长出许多菌落。

用特殊工具--“印章”把此平板上的全部菌落转印到另一基本培养基平板上。

经培养后，比较前后两个平板上长出的菌落。

如果发现在前一培养基平板上的某一部位长有菌落，而在后一平板上的相应部位却呈空白，说明这就是一个营养缺陷型突变株。

四、营养缺陷型的鉴定

生长谱法。

生长谱法是指在混有供试菌的平板表面点加微量营养物，视某营养物的周围有否长菌来确定该供试菌的营养要求的一种快速、直观的方法。

具体操作：

把生长在完全培养液里的营养缺陷型细胞经离心和无菌水清洗后，配成适当浓度的悬液（如107～108个／ml），取0.1ml与基本培养基均匀混合后，倾注在培养皿内，待凝固、表面干燥后，在皿背划几个区，然后在平板上按区加上微量待鉴定缺陷型所需的营养物粉末（滤纸片），例如氨基酸、维生素、嘌呤或嘧啶碱基等。

经培养后，如发现某一营养物的周围有生长圈，就说明此菌就是该营养物的缺陷型突变株。

五、基因重组育种

基因重组育种：

采用结合、转化、转导、原生质体融合、有性杂交及准性生殖的遗传学的方法和技术使微生物细胞内发生基因重组，增加优良性状的组合或者导致多倍体的出现，从而获得优良菌株的一种育种方法。

（一）原核生物的基因重组育种：

1、结合

供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触，把F质粒或其携带的不同长度的核基因组片段传递给后者，使后者获得若干新遗传性状的现象。

大肠杆菌中存着致育因子F，有F因子为F+，没有F因子称F-。

F因子存在于细胞中形式：

游离状态（F+细胞）；

整合状态，即F因子插入胞核质的一定位置上（Hfr细胞）。

F因子有明显的感染性，大肠杆菌的接合，实质上是F因子的转移，所以F+和Hfr称供体菌，而F-称受体菌。

2、转导

通过转导噬菌体的媒介，把供体细胞的DNA片段携带到受体细胞中，从而使后者获得前者部分遗传性状的现象。

转导子

转导噬菌体

普遍转导和局限性转导

3、转化

受体菌直接吸收供体菌的DNA片段而获得了供体菌部分遗传性状的现象。

转化子

感受态：

遗传性、菌龄、生理状态、培养条件

CaCl2冰冷电击

（二）放线菌的杂交育种

基因重组过程近似于细菌，但其育种方法有许多与霉菌相似。

1、杂交原理

放线菌基本上有四种遗传体系。

（1）异核现象

有些放线菌的营养缺陷型在混合培养或杂交过程中，经菌丝之间的接触和融合而形成异核体。

异核体形成的菌落在表型上是原养型的，无重组体出现。

（2）结合现象

不同基因型的细胞核在双方增殖过程中，发生部分DNA的转移或遗传信息的交换，形成部分合子。

（3）异核系的形成

当部分合子形成后，经过一次单交换而产生异核系染色体组。

（4）重组体的形成

异核系不稳定，在菌落生长过程中，在染色体重叠区域不同的部位再次发生交换后，能产生重组体孢子。

也可由部分合子不经过异核系，直接经过双交换形成重组孢子。

2杂交方法

（1） 

混合培养法：

要求两亲本菌株必须为互补的营养缺陷型。

将两菌株接种到完全培养基上培养至孢子长出，然后将孢子在选择培养基上进行筛选，能长出的菌株为重组菌株。

（2） 

平板杂交法：

将菌株一在完全培养基上培养至产生孢子，用影印法将菌落孢子印至已铺有另一菌株孢子的完全培养基上，等长出孢子后，用基本培养基筛选重组菌株。

三、霉菌的杂交育种

构巢曲霉--准性杂交

不经过减数分裂就能导致基因重组的生殖过程

四、酵母菌的杂交育种

性细胞间的结合和随之发生的染色体重组，并产生新遗传型后代的一种育种技术。

子囊孢子的形成

子囊孢子的分离

杂种的获得

（三）原生质体融合

分别酶解两个不同遗传性状的菌株细胞壁，在高渗环境中释放出只有原生质体膜包被的原生质体，将它们混合，然后通过物理、化学或生物学方法使他们互相聚集，通过遗传性状不同的两亲本原生质体融合，接着发生染色体交换、重组而达到杂交目的。

并筛选获得集双亲优良性状于一体的稳定重组体。

六、基因工程育种

基因工程：

用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质DNA分子提取出来，在离体条件下进行切割，获得代表某一性状的目的基因，把该目的基因与作为载体的DNA分子连接起来，然后导入某一受体细胞中，让外源基因在受体细胞中进行正常的复制和表达，从而获得目的产物。

一个完整的基因克隆过程包括以下步骤

１、获得待克隆的DNA片段（基因）；

２、目的基因与载体在体外连接；

３、重组DNA分子导入宿主细胞；

４、筛选、鉴定阳性重组子；

５、表达筛选。

（一）载体系统：

携带目的基因并将其转移至受体细胞内，进行复制和表达的运载工具。

1、特征:

一般为环状，具有体外酶切和连接能力，与目的基因结合成环状---转化---受体细胞中---复制表达能力

2、载体具备性质：

①在宿主细胞内具有自主复制和表达能力。

②能与外源DNA片段结合而不影响本身的复制能力。

③具有两个以上限制性内切酶单一位点。

④具有两个易检测的遗传标记，赋予宿主细胞不同的表型，便于检测和分离。

⑤载体分子量尽可能小，便于与较大基因结合，不易受到机械剪切。

⑥易于转化到宿主细胞。

3、常用质粒载体

pBR322质粒载体

pplasmid

BR构建者Boliver和Rodriguez

322实验标号

pUC质粒载体

PlasmidUniversityCalifornia

宿主：

JM101细菌细胞（突变体）

限制性核酸内切酶（限制酶）

限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease,RE）是识别DNA的特异序列（4~8bp）,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。

（四）目的基因的获取

1、通过建立基因文库分离靶基因

2、化学合成法制备DNA片段

从蛋白质肽链的氨基酸顺序可以知道它的遗传密码，再依照密码合成基因。

3、聚合酶链反应法扩增基因片段

对于已知全部或部分核苷酸序列的基因，可以通过聚合酶链反应（PCR），以基因组DNA或cDNA模板扩增得到目的基因片段。

（五）重组DNA导入宿主菌

体外连接的重组DNA分子必须导入适当的受体细胞中才能大量的复制、增殖和表达。

根据所采用的载体的性质，将重组DNA分子导入受体可有不同的方法。

1、转化

指以细菌质粒为载体，将外源基因导入受体细胞的过程。

转化时，细菌必须经过适当的处理使之处于感受态－即容易接受外源DNA的状态,然后利用短暂热休克使DNA导入细菌宿主中。

此外还可用电穿孔法转化细菌，它的优点是操作简便、转化效率高、适用于任何菌株。

2、转染和感染

利用噬菌体DNA作为载体时可经两种方式导入受体菌。

一种是感染，即在体外将噬菌体DNA包装成病毒颗粒，然后使其感染受体菌。

另一种方式是转染，即在DNA连接酶作用下使噬菌体DNA环化，再象重组质粒一样地转化进受体菌。

但习惯上常把以噬菌体DNA为载体构建成的重组子导入细胞的过程统称为转染。

（六）重组克隆的筛选与鉴定

基因克隆的最后一步是从转化细菌菌落中筛选出含有阳性重组子的菌落，并鉴定重组子的正确性。

通过细菌培养以及重组子的扩增，获得所需的基因片段的大量拷贝。

进一步研究该基因的结构、功能，或表达该基因的产物。

种子制备

将保存在沙土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面，活化后再经过扁瓶、摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种培养过程。

工业发酵种子的制备

种子质量的控制

发酵阶段的条件控制

一、概述

（一）种子扩大的目的3

1、为每次发酵罐投料提供一定数量代谢旺盛的种子

2、有利于缩短发酵时间、提高罐利用率。

3、减少杂菌污染机会

（二）优良种子必须具备条件

1、菌种细胞生长活力强，接种于发酵罐后迅速生长，延迟期短。

2、生理状态稳定，以得到稳定的菌体生长过程。

3、具有适宜的菌体总量及浓度，满足大容量发酵需要。

4、无杂菌及噬菌体污染，保证整个发酵正常进行。

5、保持稳定的生产能力，使最终产物高产、稳产。

（三）种子扩大培养的工艺流程

①将砂土管或冷冻抱子接种到斜面培养基中进行活化培养；

②将斜面抱子或菌丝体转接到扁瓶固体培养基或摇瓶液体培养基中进行扩大培养，制备实验室种子；

③将扩大培养的孢子或菌丝体按种到一级种子罐，制备生产用种子，一级种子再接种至二级种子罐进行扩大培养，完成生产车间种子的制备；

④制备好的生产种子转接到发酵罐中进行发酵生产。

（四）种子进罐的方法：

1、孢子进罐法：

先在固体培养基上生长、繁殖成大量孢子，将孢子直接接入种子罐扩大培养。

发酵生产方向，细、霉、放线菌采用，工艺简单、种子易于保存、减少污染机会，沙土管冷冻管用量较大。

2、菌丝摇瓶进罐法：

将固体培养基上繁殖的孢子接入摇瓶液体培养基中，使菌丝生长，再将摇瓶菌丝接入种子罐扩大培养或发酵。

生长、发育缓慢放线菌、节约沙土管冷冻管用量，菌丝不易保存，批次之间差异大，污染机会多。

二、工业发酵种子的制备

实验室种子制备：

孢子制备、固体培养基扩大培养、摇瓶液体培养。

生产车间种子制备：

摇瓶液体种子制备、种子罐扩大培养

（一）实验室种子制备

孢子制备----发酵工序开端

1、放线菌孢子制备：

培养基一般采用琼脂和其他一些适合孢子生长的成分。

麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨、牛肉膏和一些无机盐等，其中的碳源和氮源不要太丰富（碳源约为1％，氮源不超过0.5％）。

碳氮比例大一些为好，这样避免菌丝的大量形成，有利于产生大量孢子。

一般情况下，干燥和限制营养可直接或间接诱导。

2、霉菌孢子制备：

培养基一般使用大米、小米、玉米、麦麸等天然农产品为培养基原料。

适合霉菌的生长繁殖、这类培养基的表面积较大，可获得大量的孢子。

制备大（小）米培养基，要严格控制灭菌后培养基的含水量，使其不粘不散。

接种时，先将砂土管或冷冻管中的菌种制成悬浮液，再把一定量的悬浮液直接接人大（小）米培养基上，培养成熟后称为“亲米”，由亲米再转至大（小）米培养基上，培养成熟后称为“生产米”。

用“生产米”制成孢子悬浮液，最后转入种子罐内。

培养温度25～28℃，一般培养时间4～14天。

3、细菌类孢子制备

制备细菌类孢子，斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方。

牛肉膏，蛋白胨是常用的有机氮源。

细菌培养温度大多数为37℃，少数为28℃。

细菌菌体培养时间一般为1～2d，产芽孢的细菌则需培养9～10d。

摇瓶液体种子制备

种子罐种子制备

1、摇瓶液体种子制备

某些孢子发芽和菌丝繁殖速度缓慢的菌种，需要将孢子经摇瓶液体培养成菌丝后再接人种子罐，这就是摇瓶种子。

将斜面孢子接种到体积较小的摇瓶（母瓶）中，经培养后形成大量菌丝体后，再转接到较大的摇瓶（子瓶）中培养，这种摇瓶培养方法称为母瓶-子瓶两级培养、摇瓶进罐法常采用母瓶-子瓶两级培养。

2、种子罐种子制备

种子罐的级数是指制备种子需要逐级扩大培养的次数。

种子罐种子制备的工艺过程，因菌种不同而有差异，一般可分为一级种子、二级种子和三级种子的制备。

孢子（或摇瓶菌丝）被接种到体积较小的种子罐中，经培养后形成大量的菌丝，这样的种子称为一级种子。

把一级种子转入发酵罐内发酵，称为二级发酵。

如果将一级种子接入到体积较大的种子罐中，经培养后形成更多的菌丝，这样的种子称为二级种子。

把二级种子转入发酵罐内发酵，称为三级发酵。

一般应根据菌种生长特性、孢子发芽和繁殖速度以及所采用的发酵罐容积来确定种子罐的级数.

抗生素生产中，放线菌的细胞生长繁殖速度较慢，常采用二级种子扩大培养，即三级发酵，一般50t发酵罐多采用三级发酵，有的甚至采用四级发酵。

谷氨酸类氨基酸发酵所采用的菌种是细菌，生长繁殖速度很快，采用二级发酵。

☆种子异常的分析

1、菌种生长发育缓慢或过快

这种现象是指在各项工艺参数正常的情况下，出现整个代谢过程过慢或过快。

菌种在种子罐中生长发育缓慢或过快和孢子质量以及种子罐的培养条件有关。

一般情况下，通入种子罐中无菌空气的温度较低或者培养基的灭菌质量较差是种子生长、代谢缓慢的主要原因。

3、菌丝贴壁

所谓菌丝粘壁是指在种子培养过程中．菌丝正常发育生长，但再继续培养时菌丝逐步粘附在罐壁上。

当菌丝繁殖速度低于被罐壁粘附的速度时，培养液中菌丝浓度愈来愈小，最后就可能形成菌丝团。

搅拌效果不好

搅拌时泡洙过多

以及种子罐装料系数过小等原因造成。

在以真菌为产生菌的种子培养过程中，发生菌丝贴壁的机会较多。

4、生理生化代谢异常

如糖、氮代谢过快或过慢，pH过高或过低，种子罐发酵单位低等。

第四节菌种保藏和复壮

一、菌种退化：

生产菌株遗传标记的丢失及生产能力的下降

退化表现：

产量下降，腾仓赤霉产赤霉素能力下降。

菌落和细胞形态发生变化，苏云金芽孢杆菌—芽孢伴孢晶体变小而少。

对宿主寄生能力下降，白僵菌对宿主致病能力下降。

退化原因：

基因突变，控制细胞性状的基因发生突变

当控制产量的基因发生负突变，就会引起产量下降；

当控制孢子生成的基因发生负突变，则使菌种产孢子性能下降。

分离